Visualizzare le singole celle di densamente tessuti confezionati, come le cellule di Schwann terminali (SC) a giunzioni neuromuscolari (NMJs), è una sfida. "Sequenziale foto-bleaching" permette di delineare SC singolo terminale, per esempio nel triangularis espianto muscolo Sterni, un comodo nervo-muscolo preparazione, dove sequenziale sbiancamento può essere combinato con time-lapse imaging e Post-hoc Immunostainings.
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Articolo metodologico
Sequential Photo-sbiancante per Delineare cellule di Schwann singoli sulla giunzione neuromuscolare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Sequenziale foto-sbiancamento fornisce un modo non invasivo per etichettare i singoli CS al NMJ. Il NMJ è il più grande sinapsi del sistema nervoso dei mammiferi ed è servito da guida modello per studiare la struttura e la funzione sinaptica. Nel topo NMJs terminali motore assoni formano pretzel-come siti di contatto con le fibre muscolari. L'assone motore e il terminale sono rivestiti da SCS. Negli ultimi decenni, diversi topi transgenici sono stati generati per visualizzare i motoneuroni e SCS, per esempio Thy1-XFP 1 e Plp-GFP topi 2, rispettivamente.
Lungo assoni motori, mielinizzanti SC assoni sono disposti in internodi non sovrapposte, separate da nodi di Ranvier, per consentire saltatoria propagazione del potenziale d'azione. Al contrario, CS terminali a sinapsi sono specializzate cellule gliali, che monitorano e promuovere la neurotrasmissione, digerire detriti e guida assoni rigeneranti. NMJs sono strettamente coperti fino a una mezza dozzina di non MYELinating SCs terminali - questi, però, non può essere risolto singolarmente al microscopio ottico, in quanto sono in contatto diretto membrana 3.
Esistono diversi approcci per visualizzare singolarmente SC terminale. Nessuno di questi è impeccabile, però. Per esempio, il riempimento colorante, dove sono impalato singole cellule con un colorante pieno microelettrodo, richiede la distruzione di una cellula marcato prima di occupare un secondo. Questo non è compatibile con le successive registrazioni time-lapse 3. Multispettrale etichettatura "Brainbow" di SCS è stato ottenuto utilizzando l'espressione di proteine fluorescenti combinatorio 4. Tuttavia, questa tecnica richiede che unisce transgeni diversi ed è limitato dal pattern di espressione dei promotori utilizzati. In futuro, espressione di "foto-commutabili" proteine CS potrebbe essere ancora un'altra alternativa 5. Qui vi presentiamo in sequenza foto-sbiancamento, in cui le cellule singole sono sbiancati, e la loro immagine ottenuta per sottrazione. Noi crediamoche questo approccio - per la facilità e versatilità - rappresenta un'aggiunta duratura palette tecnologia del neuroscienziato, soprattutto in quanto può essere utilizzato in vivo e trasferito altri tipi cellulari, siti anatomici o specie 6.
Nel seguente protocollo, abbiamo dettaglio l'applicazione sequenziale di sbiancamento e successiva confocale time-lapse microscopia a CS terminali in triangularis espianti muscolari Sterni. Questo sottile, superficiale e facilmente sezionato nervo-muscolo preparazione 7,8 si è dimostrato utile per lo studio di NMJ sviluppo, fisiologia e patologia 9. Infine, viene spiegato come il muscolo triangularis sterni è disposta dopo la fissazione per eseguire correlata ad alta risoluzione imaging confocale, immunoistochimica o esami ultrastrutturali.
Protocollo
1. Triangularis Sterni Espianto (Figura 1)
Timing: 15 min.
- Preparare gli strumenti chirurgici: 2 paia di pinze, 1 paio di forbici, 1 paio di forbici a molla, 1 piatto coltura tissutale (10 cm). Pre-bolle (minimo per 15 min) raffreddato (4 ° C), soluzione di Ringer con il 5% di CO 2/95% O 2. Fill 15 cm piatto di coltura di tessuti con ghiaccio e coprire con piastra metallica. Preparare microscopio dissezione e posizionare il piatto di 15-cm con ghiaccio sotto la portata dissezione per raffreddare l'espianto durante la dissezione.
- Letalmente anestetizzare il mouse per overdose ....
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Risultati
Un esempio di un espianto triangularis sterni piatto pronto per l'imaging è mostrato in Figura 1G. Questo espianto è particolarmente adatto per l'imaging NMJs ex vivo come il muscolo triangularis consiste solo di pochi strati di fibre muscolari. Ciò permette di ottenere immagini ad alta risoluzione da espianti derivati da linee di topi transgenici che evidenziano sia SCS (Plp-GFP 2) e / o (assoni Thy1 XFP-1). Fattori critici per l'imaging di.......
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Discussione
Il metodo SC sbiancamento qui presentato è semplice, veloce e versatile: (i) Permette rivelando singola SC morfologia e dinamiche mediante microscopia confocale basato su un singolo transgene - che è un vantaggio significativo quando si associa l'es approccio con modelli di malattia che richiedono alleli aggiuntivi . (Ii) Il metodo è veloce, come da dissezione del fissaggio può essere eseguito in mezza giornata. (Iii) Il numero di applicazioni è ampio, in quanto può essere combinato con altri metodi, come a.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi e Kristina Wullimann per un'eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo W. Macklin per la fornitura di Plp-GFP topi. TM è sostenuto dall'Istituto di Studi Avanzati (Technische Universität München), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), dalla Alexander-von-Humboldt-Foundation e dall'agenzia finanziamenti nazionali ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) nell'ambito di ERA-Net neurone "iPSoALS" e "2-fotoni di imaging". TM e MB sono supportati dal Centro per la Scienza Protein integrata (Monaco di Baviera). PM è stato sostenuto dalla Graduate S....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda (esempio) | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
| Soluzione di etanolo al 70% (vol / vol) | Roth | T913.1 | in flacone spray |
| isoflurano | Forene, Abbott | qualsiasi altro approvato anestetico può essere utilizzato per l'anestesia letale | |
| topi transgenici (PLP-GFP) | essere ottenute da fonti citate | ||
| microscopio dissezione a freddo, luce di illuminazione | Olympus SZ51 | dotato Schott KL 1500 LCD | |
| pinza #2 | Strumenti Scienza Belle | 11233-20 | |
| pinze # 5 | Strumenti Scienza Belle | 11295-00 | |
| forbici, grandi medici | Strumenti Scienza Belle | 14108-09 | |
| forbici, piccolo primavera angolato | Strumenti Scienza Belle | 15033-09 | |
| in linea riscaldatore | Warner Instruments | SF-28 | |
| riscaldamento ad anello per 3.5 cm di piatti | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| due canali temperatura del sistema di controllo | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusione pompa sistema | custom-built | ||
| 15 cm tessuto piatto di coltura | Sarstedt | 83.1803.003 | riempito con ghiaccio e coperto da lamiera |
| 10 cm tessuto piatto di coltura | Sarstedt | 83.1802.003 | con soluzione Ringer ossigenato di |
| 3,5 cm tessuto piatto di coltura | Sarstedt | 83.1800.003 | riempito con Sylgard polimero |
| Sylgard polimero | Dow Corning | Sylgard 184 Kit di silicone elastomero | |
| microscopio confocale | Olimpo | FV1000 | con argon laser |
| 50 ml provettone | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% in PBS PFA | Sigma | P6148 | |
| cannula 0,5 millimetri x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| siringa da 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| sinaptofisina anticorpo | Invitrogen | 18-0130 | coniglio |
| anticorpo secondario | Invitrogen | A-11.012 | Alexa 594 |
| 24-pozzetti | Sarstedt | 83,1836 | |
| 0,01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0,1 M glicina in PBS | Roth | 3.790,1 | |
| coprioggetti | Neolab | E-4132 | |
| diapositive | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector laboratori | H-1000 | |
| perni minutien × 10 | Strumenti Scienza Belle | 26002-20 | abbreviato <4 mm |
| α-bungarotossina accoppiato ad Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0,2% Triton-X100 | Roth | 3.051,3 | |
| 10% di siero di capra | Abcam | ab7481 | |
| 1% di albumina di siero bovino | Sigma | A7030 | |
| Ringer gorgogliare con il 95% O 2/5% di CO 2 | |||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2,5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1,25 mm NaH 2 PO 4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mm NaHCO 3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl 2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl 2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM di glucosio | Sigma | G7528 | |
Tabella 1. Reagenti e attrezzature specifiche. |
Riferimenti
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid pro....
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Ristampe e permessi
