Elaborazione di mastoplastica riduttiva e tessuti umani mastectomia per coltura cellulare

Sommario

Un metodo per elaborare materiale mammaria umana scarto chirurgica viene descritto. Tessuti trattati, in forma di organoidi, possono essere congelati indefinitamente o posto in coltura per crescita a lungo termine. Questo metodo consente esame sperimentale di biologia umana normale delle cellule epiteliali, e gli effetti delle perturbazioni esogene.

Abstract

Esame sperimentale di normale umano cellule epiteliali mammarie (HMEC) comportamento, e come le cellule normali acquisire proprietà anormali, può essere facilitato in sistemi di coltura in vitro che più accuratamente modello in biologia vivo. L'uso di materiale derivato umano per studiare la differenziazione cellulare, invecchiamento, senescenza, e immortalizzazione è particolarmente vantaggiosa dato le molte differenze significative di queste proprietà molecolari tra cellule di roditore umane e comunemente utilizzati ^1-2. Cellule mammarie presentano un comodo sistema di modello perché grandi quantità di tessuti normali e anormali sono disponibili a causa della frequenza di mastoplastica riduttiva e ambulatori mastectomia.

La ghiandola mammaria è costituito da una miscela complessa di molti tipi cellulari distinti, ad esempio, epiteliale, mesenchimale, adipose, endoteliali. Le cellule epiteliali sono responsabili della funzione differenziata mammaria di lattazione,e sono anche all'origine della maggior parte dei tumori mammari umani. Abbiamo sviluppato metodi per trattare i tessuti mammari scarto chirurgica della ghiandola in puri elementi epiteliali e cellule mesenchimali ^3. Il materiale trattato può essere conservato congelato a tempo indeterminato, o avviate in coltura primaria. Materiale di scarto chirurgico viene trasportato al laboratorio e manualmente sezionato per arricchire di tessuto epiteliale che lo contiene. Successiva digestione del tessuto sezionato con collagenasi e ialuronidasi materiale strisce stromale dal epiteli alla membrana basale. I pezzi risultanti piccoli dell'albero epiteliale (organoidi) può essere separato dal stroma digerito sequenziale per filtrazione su membrane di porosità fissa. A seconda delle dimensioni dei pori, frazioni possono essere ottenute costituito grandi duttali / alveolare pezzi più piccoli, cluster alveolari, o cellule stromali. Abbiamo osservato una crescita superiore in cui le culture vengono avviate come organoidi piuttosto che come dissociated singole cellule. Collocamento di organoidi nella cultura che utilizzano piccole-stress che inducono i media supporta crescita a lungo termine del HMEC normale con marcatori di lineage diversi tipi (mioepiteliali, luminale, progenitore) ^4-5. Un numero sufficiente di cellule possono essere ottenute dal tessuto di un individuo per permettere ampia esame sperimentale utilizzando lotti cellulari standardizzati, nonché di interrogazione utilizzando modalità ad alto rendimento.

HMEC coltivata sono stati impiegati in una vasta gamma di studi che hanno esaminato i normali processi che regolano la crescita, la differenziazione, l'invecchiamento e la senescenza, e come questi processi normali sono stati alterati durante la trasformazione immortale e maligna ^4-15,16. Gli effetti della crescita in presenza di materiale di matrice extracellulare, altri tipi cellulari, e / o di cultura 3D può essere confrontato con la crescita su plastica ^5,15. HMEC Colta, a partire da cellule normali, fornire un sistema sperimentale trattabili per esaminare i fattori chepuò spingere o prevenire l'invecchiamento umano e carcinogenesi.

Protocollo

1. Tissue Processing e digestione

1. Ottenere tessuto mammario umano come materiale di scarto da procedure chirurgiche. Mammoplasties di riduzione in grado di fornire cellule normali o benigna; fibroadenomi e gynecomastias fornire cellule benigne, non-tessuti tumorali mastectomia controlaterale (periferica o ad un tumore, o sottocutanea) fornire cellule che possono variare da normale a benigni a microtumors contenenti. Garantire l'approvazione IRB corretta esiste prima di ottenere il materiale di scarto. Tutto il materiale deve essere trattato in trasmissione ematica regolamenti patogeni.
2. Materiale in contenitori sterili contenenti tampone o supporti (ad esempio 1:1 Medio Eagle modificato da Dulbecco e di Ham F-12) supplementato con 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml streptomicina, 5 pg / ml Fungizone, 50U/ml polimixina B, e 10% siero fetale di bovino, e il trasporto al laboratorio a 4 ° C. Mammoplastica tessuto di riduzione possono essere conservati o spediti a 4 ° C per 72 ore, senza alterare in modo significativo dola vitalità delle cellule bsequent. Piccoli pezzi di non-riduzione del tessuto mastoplastica possono richiedere l'elaborazione più rapida.
3. Separare le zone epiteliali dalla matrice stromale del tessuto adiposo, tessuto connettivo e dei vasi sanguigni utilizzando una combinazione di sterili bisturi, pinze e forbici. Tagliare pezzi di tessuto con le forbici e metterlo in un piatto di vetro di grandi dimensioni sterile (ad esempio, 150 mm). Delicatamente sezionare le aree epiteliali, che appaiono come filamenti bianchi incorporate nella matrice stromale yellower, utilizzando le pinze per tenere il materiale e il bisturi per raschiare il materiale grossolanamente grassa. Per facilitare la digestione, tagliare il tessuto epiteliale in pezzi più piccoli di 3-4 mm ~ utilizzando bisturi opposte e posto in una provetta da 50 ml. Se grandi quantità di tessuto sono in fase di elaborazione, fresche lame di bisturi può essere necessaria. Rimuovere il materiale grasso dal piatto per lo smaltimento secondo le norme istituzionali.
   1. Nei tessuti fibrosi pesantemente (ad esempio, per via sottocutanea mastectomies con grave malattia fibrocistica), non ci sarà più solido bianco, non-epiteliale materiale. Può essere difficile sezionare le cellule epiteliali di tali matrici fibrose. Grossi pezzi di materiale fibroso può essere tagliato in pezzi più piccoli che sono quadrati di 1-3 mm ~ zona e digerito separatamente.
4. Posizionare il tessuto epiteliale sezionato in un tubo da centrifuga conica (50 ml o 15 ml) con il tessuto comprendendo non superiore ad un terzo del volume del tubo. Portare il tubo fino a volume, lasciando solo un piccolo spazio d'aria per consentire la miscelazione durante la rotazione, utilizzando una miscela di digestione tessutale (DME/F-12 o equivalente, 10 pg / ml di insulina, antibiotici come sopra, e la concentrazione finale di 10 % FCS, 200 U / ml di collagenasi greggio e 100 U / ml ialuronidasi.
5. Posizionare le provette su un rotatore tubo HulaMixer e ruotare a 360 ° a 8 giri durante la notte a 37 ° C.
6. Centrifugare le provette a 600 xg per 5 min. Eliminare il grasso supernatante e medio termine per lo smaltimento secondozione alle norme istituzionali.
7. Controllare il completamento della digestione diluendo una piccola aliquota del pellet in mezzo. Digestione è completa quando l'esame microscopico mostra grumi di cellule (organoidi) con strutture liscia appare duttali, alveolare, o duttale-alveolare liberi da allegata stroma (Figura 1A). Tessuti mastoplastica riduttiva di solito mostrano ancora stroma allegato dopo la digestione durante la notte e richiederà ancora del tempo di digestione.
   1. Risospendere il pellet non digeriti in miscela fresca di digestione tessutale e re-incubare con rotazione a 37 ° C per un'altra ora 4-12. Ripetere i punti 1.6 e 1.7. Se la digestione è ancora incompleta, aggiungere nuovamente miscela di digestione al pellet e re-incubare con rotazione a 37 ° C per una notte. La concentrazione di enzimi può essere ridotta per evitare sovratensioni digestione overnight.
8. Quando la digestione è completa, centrifugare le provette a 600 xg per 5 minuti, aspirare il digestione mix, Risospendere il pellet in media, più antibiotici a circa 15 ml/50 ml tubetto, 5 ml/15 ml tubetto.

2. Filtrazione e congelamento di materiale digerito

1. Trasferire aliquote di sedimento risospeso su una sterile filtro da 100 micron su un tubo da 50 ml sterile. Far defluire medie nel tubo, poi rilavare le organoidi il top 1-2x volte con 2-3 ml di terreno. Ripetere finché tutti i pellet risospeso è stato trasferito. Se ci sono troppe organoidi sul filtro e il mezzo più drena facilmente, utilizzare un nuovo filtro (s) per il materiale rimanente. Capovolgere con attenzione il filtro (s) su un'altra provetta sterile e lavare i organoidi nel tubo con più media. Questo è il 100 Piscina organoid pm.
2. Prendere il materiale che drenato nel tubo originale 50 ml e ripetere il processo di 2,1 utilizzando un filtro 40 micron, per ottenere la piscina organoid 40 micron, che contiene principalmente strutture alveolari. Il materiale scaricato in thtubo e costituisce la piscina filtrato, che contiene singoli ciuffi / piccola di cellule mesenchimali ed epiteliali e piccoli pezzi di sistema vascolare.
3. I pellet 100 pm, 40 pm, e piscine filtrato a 600 xg per 5 min.
4. Aspirare il supernatante, ricostituire ciascuna provetta in CPM II (DME/F-12 o equivalente con 44% FCS e il 6% DMSO) con circa 1 ml di CPMII per 0,1 ml di pellet imballato. Conservare a 4 ° C.
5. Seed un piatto di prova per le 2 piscine organoid ponendo 0,1 ml di materiale risospeso in 35 mm goccia piatto di coltura dei tessuti in plastica a goccia come in 3.2. La piscina filtrato può essere direttamente seminate su plastica con terreno di coltura tissutale di fibroblasti (DME/F-12 o equivalente con 10 pg / ml di insulina e il 10% FBS).
6. Aliquotare il restante materiale risospeso in fiale Nunc congelamento tipo (1 ml / fiala da 2 ml). Congelare la notte a -80 ° C e poi a trasferire rapidamente conservazione in azoto liquido. Non abbiamo osservato alcuna significativa perdita di vitalitànelle nostre fiale originali congelati dalla fine degli anni 1970.

3. Semina organoidi surgelati e Subculture delle colture primarie

1. Scongelare rapidamente la fiala contenente i organoidi congelato in un bagno d'acqua a 37 ° C. Le sementi organoidi in 2 a 10 (di solito ~ 6) 60 mm, piatti o 1-3 piatti 100 mm, a seconda stima visiva del numero di organoidi nella fiala. Organoidi circa 20-40 seminate in ogni antenna di 60 mm è ottimale.
2. Organoidi scongelati sono accuratamente messi, goccia a goccia, sulla superficie piatto con una pipetta da 1 ml o pipetta Pasteur per una distribuzione uniforme della organoidi. Organoidi accostate avrà uno spazio limitato per conseguenza, dando luogo a un minor numero di cellule sottocultura o congelamento. Evitare di graffiare la superficie del piatto (le cellule tendono a non crescere oltre superfici graffiate). Attendere 1-2 minuti per consentire ai organoidi da allegare e poi aggiungere lentamente mezzo di crescita per evitare di spostare le organoidi (ad esempio 2-3 ml/60 piatto mm). Ioncubate a 37 ° C in incubatore umidificato CO _2. Queste sono le colture primarie. Al momento stiamo utilizzando M87A + ossitocina (X) mezzo per la crescita più robusta HMEC (Figura 2).
3. Dopo 1 giorno, controllare che i organoidi sono allegati. Aggiungere mezzo supplementari (ad esempio 2-3 ml/60 piatto mm). Migrazione cellulare dalle organoidi dovrebbero essere visibili da 24-48 ore, e la crescita mitotica 48-72 ore dopo la semina (Figura 1B, C). A volte attacco è scarsa dopo 24 ore, in particolare se placcatura organoidi overdigested o organoidi da donne anziane, ma la maggior parte preparati allegherà entro 72 ore. Piccoli pezzi di vascolarizzazione possono attaccare e dare origine a outgrowth fibroblasti cellule (Figura 1D).
4. Alimentare culture almeno 3 volte alla settimana. Le cellule coltivate in M87A-tipo di supporto crescere fino a confluenza vicino entro 5-8 giorni, a seconda della densità di semina.
5. Se vi è significativa crescita dei fibroblasti, tripsinizzazione differenziale (DT), basato suldistacco rapido fibroblasti dalla superficie plastica, è necessario rimuovere i fibroblasti. Quando le macchie epiteliali diventano grandi mezzi di comunicazione, aspirato, piatto di lavaggio (ad esempio, 1-2 ml/60 piatto mm) con STE (soluzione salina, 0,05% tripsina, 0,02% EDTA), aspirato, aggiungere fresco STE 0,5 ml e lasciare a temperatura ambiente per circa 1 min con continua osservazione microscopica. Quando i fibroblasti staccare le cellule epiteliali, ma sono ancora aderenti, delicatamente ma nettamente battere il lato del piatto contro una superficie dura per rimuovere i fibroblasti e quindi rapidamente aspirare. Risciacquare una volta con PBS, e aspirare nuovamente. Culture pesantemente contaminati con fibroblasti può essere necessario un ulteriore DT.
6. Subculture colture primarie quando grandi macchie epiteliali sono presenti, ma prima di confluenza. La densità di semina organoid e attaccamento influenza il tempo necessario. Per mantenere la coltura primaria e per generare più colture secondarie, distanziati nel tempo, eseguire Trypsinizations parziali (PT).
7. Aspirare il terreno, lavare un piatto di 60 mm con 1-2 STE ml, aggiungere 0,5 ml STE fresco di piatto. Osservare distacco delle cellule al microscopio a temperatura ambiente per 1-5 min, con colpi delicato del piatto per promuovere distacco cellulare. Tripsinizzazione deve essere interrotto quando ~ 50% delle cellule sono staccate. All'inizio TP di solito hanno un rapido distacco delle cellule. Per la successiva TP, le cellule possono essere posizionati a 37 ° C per una più rapida distacco, con attento monitoraggio, come tutte le cellule possono venire rapidamente.
8. Aggiungere 2 ml di siero contenenti i media al piatto, repipette per lavare, e versare in un tubo sterile 15 ml. Ripetere 2x con altri mezzi ~ 1-2 ml, aggiungendo il lavaggio al tubo. Rialimentazione il piatto principale e tornare alla incubatrice. Contare le cellule nel tubo con l'emocitometro. PT può essere ripetuto circa 4 a 8 volte con una buona ricrescita delle cellule nei piatti primari e equivalente crescita a lungo termine dei secondari subcoltura o congelate (cellule di secondo passaggio sono chiamati secondari, una volta reinoculate, le cellule non sono loprimarie nger). Una volta organoid materiale non è più presente nelle colture primarie, secondarie subcoltura mostrano un calo potenziale a lungo termine della popolazione raddoppio.
9. 1. Per sottocultura di secondari, le cellule di semi direttamente dal tubetto in piatti. Semina di 1-2 x 10 ⁵ cells/100 piatto mm in un mezzo robusto come M87A + X porterà a confluenza in 4-7 giorni. Aggiungiamo tossina del colera al mezzo di secondo passaggio per accrescere il potenziale proliferativo, tossina colerica è omesso in coltura primaria perché porta alla conseguenza cella multilivello dalle organoidi.
   2. Per congelamento come secondari, tubo pellet a 600 xg per 5 min, e risospendere in CPMII con una densità finale di 10 ⁶ cellule / ml. Aliquotare cellule risospese in fiale tipo Nunc congelamento, congelare per una notte a -80 ° C e poi trasferire rapidamente allo stoccaggio in azoto liquido.
10. Si consiglia di congelare le cellule del PT prima custodia, eutilizzare cellule dal PT seconda sottocultura. Ulteriori terminali possono essere congelati per un uso futuro.

Risultati

Figure rappresentative per tessuti adeguatamente digeriti a organoidi e posti in coltura sono mostrati nella Figura 1. Tessuto non completamente digerito mostrerà materiale ancora applicata all'esterno di queste strutture, e probabilmente un po 'la crescita fibroblastica cellule in coltura primaria, che richiede DT da rimuovere. Tessuto Overdigested mostrerà frontiere esterne meno liscia, e potrebbe richiedere più tempo per fissare in coltura primaria. Conseguenza epiteliale dovrebbe iniziare entro 48-72 ore (1B, C). Piccoli pezzi di vascolarizzazione (1D) può essere una fonte di conseguenza cellule mesenchimali. Escrescenze epiteliali mostrano popolazioni morfologicamente eterogenee, con le popolazioni proliferative che contengono miscele di cellule con marcatori associati a mioepiteliali, progenitore, e lignaggi luminale (1E, 3C-E). La crescita dei mezzi di comunicazione di stress basse come M87A integrati con la tossina del colera e l'ossitocina sosterrà superiore a lungo terminecrescita del normale pre-stasi HMEC rispetto alle precedenti formulazioni media (Figura 2). M87A-tipo di supporto anche sostenere la crescita delle cellule progenitrici luminali e attraverso passaggi 4-8 (Figure 3C-E, 4), in seguito, la maggior parte delle cellule mostrano i marcatori lignaggio solo mioepiteliali. HMEC coltivate su plastica possono mantenere la loro capacità di formare 3D corretta autorganizzazione in micropatterned 3D pozzetti con cellule luminali interni alle cellule mioepiteliali (Figura 4A, B), e di formare strutture organizzate quando piastrate in Matrigel (4C, D).

Figura 1. Organoidi HMEC e la cultura primaria. (A) Organoid mostrano duttale-alveolare struttura dopo la digestione e la filtrazione. (B, C) che mostrano organoidi struttura alveolare duttale e 2 giorni dopo il posizionamento in coltura primaria, di notare la outgr cella inizialeowth (frecce bianche). (D) vaso sanguigno piccolo attaccato e con l'avvio conseguenza fibroblasti da culture stesse B, C. (E) escrescenza delle cellule epiteliali dalla cultura organoid primario dopo 4 giorni. Lignaggi sono identificati da colorazione con anticorpi anti-K14 (rosso) e K19 (verde); nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Luminal (K14-/K19 +, verde), mioepiteliali (+ K14 / K19-, rosso), e progenitore (+ K14 / K19 +, giallo), le cellule sono visibili. Cellule non marcate vengono osservati nel nucleo organoid dovuta alla penetrazione anticorpo incompleto.

Figura 2. Organoidi crescita di culture HMEC in diverse formulazioni dei media. Ottenuti da un individuo, campione 184, sono stati avviati in coltura primaria con diverse formulazioni media. Migliore crescita a lungo termine è ottenuto utilizzando la nostra formulazione più recente, M87A + ossitocina (X) ^4. Questo terreno supporta anchecrescita di linee multiple HMEC (vedi fig. 1E). Un precedente formulazione dei media, MM ^{3, a} condizione di crescita meno robusta, mentre un privi di siero media, MCDB170 (commerciale MEGM) ¹⁷ porta alla rapida induzione della chinasi ciclina inibitore p16 ^INK4A e selezione per le cellule aberranti ^7,11,13.

Figura 3. Confronto di diversità lignaggio in organoidi incolti e HMEC coltivate a 4 analisi ^° passaggio. (A, B) FACS di un incolto, organoid dissociato enzimaticamente per (A) espressione di EpCAM e CD49f/alpha 6 integrina, e (B) CD227/Muc1 e CD10/CALLA. (C, D) analisi FACS di 4 ^° passaggio pre-stasi HMEC per l'espressione di (C) e EpCAM CD49f/alpha 6 integrina, e (D) e CD227/Muc1 CD10/CALLA. P identificabiliopulations sono etichettati come LEP (che esprime luminale marcatori EpCAM o CD227), MEP (che esprime mioepiteliali marcatori CD49f o CD10), o PROG (arricchito in CD49f + / + EpCAM popolazione). Si noti che durante l'adeguamento alla regolamentazione cultura dei cambiamenti EpCAM e CD49f rispetto al organoidi incolte. (E) Unsorted HMEC e FACS arricchito di LEP e MEP al 4 ^° passaggio colorati per l'analisi di immunofluorescenza di cheratina K14 (MEP marker) e K19 (LEP marcatore) per verificare l'identificazione lignaggio. Macchiato nuclei con DAPI appaiono blu.

Figura 4. HMEC coltivate sono capaci di formare strutture organizzate in vivo con simili rapporti lignaggio quando messo in microambienti adeguati. (A) Pre-stasi 4 ^° passaggio HMEC erano FACS arricchito into luminale LEP e lignaggi MEP mioepiteliali per mezzo di marcatori per CD227 e CD10, con questi lignaggi verificati da espressione di K14 e K19 (non mostrato). (B) In caso di miscela insieme in micropatterned pozzetti, le cellule in coltura sono stati in grado di auto-organizzazione in doppi strati con MEP sulla parte esterna e interna LEP [adattato da Chanson et al. ^5]. Marcato in modo fluorescente LEP (verde) e MEP (rosso) sono stati ripresi con un microscopio confocale a 0 ore, 24 ore, e 48 ore dopo l'aggiunta al micropozzetti (superiore). Controllo HMEC sono stati arbitrariamente etichettati con etichette fluorescenti rossi o verdi (in basso). (C) campo immagine luminosa di FACS arricchiti di cellule progenitrici (cKit +) placcato in 3D (Matrigel) cultura e coltivate per 18 giorni. Strutture risultanti possono presentare morfogenesi alveolare. (D) Le strutture sono stati estratti da Matrigel e colorate per rilevare K14 e K19; nuclei sono state contrastate con DAPI. Analisi di immunofluorescenza mostra strutture organizzate con la corretta pola luminale e basalirezza.

Discussione

L'umano mammario metodo di lavorazione dei tessuti qui presentato permette di ottenere pure cellule epiteliali mammarie derivante dalla commistione eterogenea di tipi di cellule nel cuore umano. Filtrazione attraverso i pori di dimensione fissa consente la separazione delle diverse frazioni della ghiandola mammaria (ad esempio, duttale e dotto-alveolare vs alveolare) della matrice stromale digerito. Isogeniche fibroblasti mammaria può essere ottenuta per abbinare le cellule epiteliali. Congelato materiale digerito ha mantenuto una buona vitalità da oltre 30 anni. Questo metodo ha lavorato con successo su tutti i tessuti mammari, ma molto fibrosi, ed è semplice da eseguire. Altre variazioni della lavorazione dei tessuti mammario esistono che non forniscono frazioni epiteliali che sono il più vitale, pulito, o separati. Collocamento di organoidi trasformati in coltura con bassi stressanti media come M87A permette crescita a lungo termine del HMEC lignaggio con marcatori multipli. HMEC che sono state coltivate su plastica ancora mantengono la capacità di generite strutture 3D con normale in vivo-come rapporti lignaggio. Queste culture HMEC sono adatti per un'ampia indagine sperimentale, tra cui ad alto rendimento, di normale comportamento HMEC e fattori che possono inibire o spingono senescenza e trasformazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetro Petri 15 centimetri	VWR	89000-308
Scissors 6.5 "	VWR	82027-594
Pinze 8 "	VWR	82027-436
Bisturi monouso	Miltex	4-411
Collagenasi	SIGMA	C0130
Ialuronidasi	SIGMA	H3506
Insulina	SIGMA	I5500
DMSO	SIGMA	D8418
Pennicillin / streptomicina	Life Technologies	15140-122
Fungizone	Life Technologies	15290-018
Polimixina B solfato	Life Technologies	21850-029
Siero fetale bovino	Life Technologies	26140-087
Tripsina 0,05% 100 ml	Life Technologies	25300-054
DMEM/F12	Life Technologies	11039-021
HulaMixer	Life Technologies	159-20D
Cella filtro 100 um	BD Falcon	352360
Cella filtro 40 micron	BD Falcon	352340
Provette 15 ml	Greiner Bio-One	188-261
Provette 50 ml	Greiner Bio-One	227-261
Piatti TC 10 centimetri	Greiner Bio-One	664-160
Piatti TC 6 centimetri	Greiner Bio-One	628-160
Fiale criogeniche	Nalgene	5000-1020
Heamocytometer	Hauser scientifico	1490
Centrifuga	Eppendorf modello	5702