Articolo metodologico

Analizzando lo sviluppo delle cellule di Schwann Murine lungo gli assoni in crescita

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DOI:

10.3791/50016

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21 novembre 2012

 , 
1Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg , 2Department of Neuroanatomy, University of Heidelberg, 3FRIAS, University of Freiburg

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo una delle cellule di Schwann (SC) saggio transizione, in cui SC sono in grado di sviluppare lungo gli assoni si estendono.

Abstract

Lo sviluppo dei nervi periferici è un processo intrigante. I neuroni inviano assoni per innervare obiettivi specifici, che negli esseri umani sono spesso più di 100 cm di distanza dal soma del neurone. Sopravvivenza neuronale durante lo sviluppo dipende destinazione fattori di crescita derivati ​​ma anche sul supporto di cellule di Schwann (SC). A questo fine assoni ensheath SC della regione del soma neuronale (o il passaggio dalla centrale per il sistema nervoso periferico) alla sinapsi o giunzione neuromuscolare. Le cellule di Schwann sono derivati ​​della cresta neurale e la migrazione come precursori lungo gli assoni emergenti fino a quando l'assone è coperto con SCS. Ciò dimostra l'importanza di SC migrazione per lo sviluppo del sistema nervoso periferico e sottolinea la necessità di studiare questo processo. Al fine di analizzare lo sviluppo SC, una messa a punto è necessario che accanto alle SC comprende anche la loro substrato fisiologico per la migrazione, l'assone. Grazie allo sviluppo intrauterino (mus musculus). Per ovviare a questo, abbiamo adattato il ganglio cervicale superiore (SCG) tecnica di espianto. Dopo il trattamento con il fattore di crescita nervosa (NGF) espianti SCG estendere assoni, seguiti da precursori SC migrano lungo gli assoni dal ganglio alla periferia. La bellezza di questo sistema è che la SC sono derivati ​​da un pool di SC endogena e che migrano lungo i loro assoni proprie fisiologici che crescono contemporaneamente. Questo sistema è particolarmente interessante, in quanto lo sviluppo SC lungo gli assoni possono essere analizzati con time-lapse imaging, aprendo ulteriori possibilità di acquisire conoscenze in migrazione SC.

Protocollo

1. Preparazione del gel di collagene

  1. Preparare un mezzo magazzino, contenente 455 microlitri MEM 10x, 112 microlitri NaHCO 7,5% 3, 50 microlitri glutammina e NaOH. La concentrazione e la quantità di NaOH dipende dalla coda di topo preparazione collagene (vedere 1.2), il volume finale del mezzo magazzino essendo 1.000 microlitri.
  2. Preparare coda di topo collagene secondo Ebendal (1). Conservare la soluzione di collagene a 4 ° C. Una degradazione del collagene soluzione non poteva essere osservato. Dopo la preparazione di un nuovo gruppo, valutare la concentrazione di NaOH necessaria per il mezzo stock (vedere 1.1). Utilizzare il pH del mezzo indicatore per la titolazione della quantità e concentrazione di NaOH. 800 microlitri acido coda di topo collagene deve girare una tonalità di rosso quando miscelato con 210 ml di mezzo di brodo. Se la concentrazione di NaOH è troppo bassa la soluzione di collagene diventa giallo, per l'indicatore di pH del mezzo. Aggiungi il collagene al mezzo e mescolare senza prodottiucing bolle. Eseguire questi passaggi su ghiaccio. La polimerizzazione si verifica entro 2 ore dopo la soluzione di collagene e il mezzo magazzino sono stati mescolati e la nuova soluzione viene incubata a 37 ° C. Prova questo prima di iniziare un esperimento. 1.3) Mescolare 800 ml di soluzione di collagene con pl 210 di media stock (vedi 1.2). Posto 100 pl di questa soluzione in pozzetti di una slitta 8 camera bene. Incubare i vetrini a 37 ° C, 5% di CO 2 e umido in una cella incubatore. Preparare i gel di collagene sotto un banco di coltura cellulare e condizioni sterili. Il collagene gelatinizes entro 2 ore.

2. Dissezione di SCGS embrionali

  1. Harvest embrioni di topo gravide tempo (E16-18) dall'utero e tenerli in PBS fino a nuovo necessario.
  2. Staccare un embrione dalla membrana amniotica. Decapitare il caudale dell'embrione del livello clavicolare. Fissare la testa su un piatto fondo di silicio con "insetto-aghi". Il lato ventrale della testa deve affrontare a voi und si deve vedere la regione sottomandibolare. Il fissaggio per un facile preparazione.
  3. Rimuovere la pelle della regione sottomandibolare destra e sinistra e con essa la sottocutaneo tessuto connettivo.
  4. Rimuovere le ghiandole salivari sottomandibolari dalla loro posizione per cancellare la vista sulla ioide, i muscoli infrahyoidal e il muscolo sternocleidomastoideo.
  5. Rimuovere questi muscoli con attenzione per eliminare la vista sulla laringe e della trachea. Rimuovere la trachea e la laringe. Le arterie carotidi sono quindi visibili da entrambi i lati sui muscoli prevertebrali. Il SCG si trova nella biforcazione delle arterie carotidee e ha una forma ovale. Rimuovere con attenzione i gangli e metterli in PBS. Rimuovere i gangli delicatamente dagli strumenti di dissezione se sono aderiscano. E 'vantaggioso utilizzare pinze nonché un porta aghi montato con un "ago insetto" per la rimozione SCG.
  6. Una volta in PBS, memorizzare i gangli a temperatura ambiente in PBS fino sezionato enougangli gh. Quindi pulire i gangli dai vasi sanguigni e tessuto connettivo. Eseguire la dissezione SCG e pulizia sotto un microscopio da dissezione posta sotto un banco di flusso laminare.
  7. Infine, posizionare i gangli espiantato sui gel di collagene gelatinizzati con l'aiuto della siringa aghi montati su una siringa per facilitarne la movimentazione.
  8. Incubare le espianti SCG sul collagene gelificato in un incubatore per colture cellulari a 37 ° C, con il 5% di CO 2 e condizioni umide.

3. Trattamento di espianti SCG

  1. Dopo 1-2 ore di incubazione, coprire il collagene espianto SCG contenente terreno con 100 microlitri Neurobasal coltura cellulare contenente B27 supplemento, glutammina e antibiotici. Ora i pozzetti dei vetrini camera contiene un volume di 200 pl (100 microlitri gel e 100 microlitri media). Aggiungere altri 200 pl di mezzo, ma ora contenenti NGF (60 ng / ml) per facilitare la crescita assonale. Di conseguenza la concentrazione finale NGF è di 30 ng / ml.
    1. Per studiare l'insorgenza di SC migrazione, aggiungere ulteriori fattori direttamente al giorno in vitro 0 (DIV0). Sciogliere i fattori a medio NGF, contenenti, in doppia concentrazione necessaria (2).
    2. Al fine di analizzare l'impatto sulla SC, che ha già iniziato la migrazione lungo gli assoni, aggiungere ulteriori fattori a DIV3 fino DIV4 (fermata potenzialità dell'esperimento). A tal fine, rimuovere attentamente 180 microlitri della soluzione, a DIV3, e aggiungere 200 microlitri NGF nuovo mezzo e contenente gli elementi complementari di interesse a doppia concentrazione (2).

4. Time-lapse imaging

Utilizzare un microscopio invertito per le analisi. Vari obiettivi possono essere utilizzati, definire il campo di vista e l'ingrandimento. Un aspetto importante, tuttavia, è la distanza di lavoro dell'obiettivo utilizzato, come l'imaging degli espianti SCG viene eseguita attraverso il vetrino e il collagenegel. Il frame rate di registrazione di 1/10-30 minuti ha mostrato buoni risultati (2). Tuttavia, questo aspetto deve essere adattata alla domanda scientifica. Una telecamera CCD normale può essere utilizzato per l'acquisizione dell'immagine. Per l'imaging time lapse una coltura cellulare camera di incubazione deve essere attaccata alla fase del microscopio. Incubare il tessuto durante l'esposizione a 37 ° C, con il 5% di CO 2 e condizioni umide. Avviare il sistema di incubazione uno ora prima dell'inizio imaging. Ciò consente alle parti microscopio (es. obiettivo) compresa la camera di scorrimento per regolare la temperatura e impedisce derive termiche indotte. Definire le aree specifiche di analisi (entro il espianto e tra espianti diversi) con l'aiuto del software microscopio e con un programma di controllo fase motore (installazione multiposizione) per le analisi simultanee di diverse condizioni applicate agli espianti SCG. Per time-lapse immagini dei tessuti di tipo selvatico e tessuti di animali transgenici può essere utilizzatosegnando la SC (S100B: GFP) (3). Per fluorofori immagini una sorgente di luce fluorescente deve essere attuata nel setup micropscope. Utilizzare i filtri standard.

5. Quantificazione dei SC distanze di migrazione

  1. Al punto finale (DIV4 per esempio), fissare il gel di collagene con il 4% PFA nella scatola di controllo per ora 3-4. Consecutivamente lavare i gel di collagene 5 volte per 10 minuti con PBS. Applicare protocolli standard per l'immunoistochimica (2). Se siete nuovi alla preparazione di SCGS, verificare l'identità del ganglio come un ganglio simpatico di immunoistochimica contro la tirosina idrossilasi (TH), un marcatore per le cellule catecolaminergici comune. Durante immunoistochimica (dopo l'anticorpo primario), trasferire i contenenti gel di collagene explant a piastre da 24 pozzetti, che hanno un volume maggiore, che è vantaggioso per il lavaggio del gel.
  2. Dopo immunoistochimica, posizionare con attenzione il gel di collagene su vetrini. Attentamenterimuovere la soluzione restante e lasciare asciugare il collagene / ridursi a due dimensioni. Questo permette facili misurazioni di distanze (2). Dopo questo, montare i campioni.
  3. Infine, misurare le distanze di migrazione con l'aiuto di Figi (NIH) software. Nessun plugin speciali sono necessari a tal fine. Per consentire misurazioni corrette in pm, controllare i metadati corretto imaging e le impostazioni con il Fiji, l'immagine e la scala. Utilizzare Fiji anche per la quantificazione delle cellule.

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Risultati

Crescita assonale è facilitato dal SCG espianti seguito al trattamento con NGF (4) (regime film S1 Figura 1 schema). Questo processo è facilmente visibile da qualsiasi microscopio invertito e può essere seguito da time-lapse imaging (film S2). Se uno scienziato è una novità per la dissezione SCG da embrioni di topo si consiglia vivamente una validazione della tecnica da un semplice anti-tirosina idrossilasi (TH) immunoistochimica. TH è un marker comune per i neuroni catecolamine (in que...

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Discussione

Lo sviluppo del sistema nervoso periferico è un processo eccitante. Quando l'elaborazione è completata, assoni sono ensheathed da SCS per tutta la lunghezza, che può, in esseri umani, spesso oltre 100 cm. A tal fine il numero corretto dei SCs necessari deve essere stabilito durante lo sviluppo e la SCS devono anche muoversi lungo assoni si estendono verso la periferia per garantire la copertura completa assonale. Questo vale per assoni unmeylinated mielinizzati ma anche per. In entrambi i casi tutti assoni sono in c...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Vogliamo ringraziare Arumae Urmas per la condivisione di un protocollo di collagene e Jutta Fey e Ursula Hinz per un'eccellente assistenza tecnica. Inoltre vogliamo ringraziare Christian F. Ackermann, Ulrike Engel e la Nikon Imaging Center presso l'Università di Heidelberg e anche per Joachim Kirsch aiuto gentile per il Shoting video. Il lavoro è stato parzialmente finanziato attraverso la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nome del reagente / materiale Azienda Numero di catalogo Commenti
MEM 10x Gibco 21430
Bicarbonato di Sodio (7,5%) Gibco 25080
Glutammina Gibco 25030
NaOH Merck 109137
NGF Roche 1058231 R & S # 556-NG-100
Medio Neurobasal Gibco 21103
B27 Supplemento Gibco 17504
antibiotici Gibco 15640
d-PBS Gibco 14040
aghi insetti FST 26002-20
siringa con ago Braun BD # 300013
8 Fare scorrere camera ben Lab tek 177402

Riferimenti

  1. Ebendal, T. Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).
  2. Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons. PloS One. 6 (12), e28692(2011).
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