Muskelfunktion målinger bidrager til evalueringen af potentielle lægemidler for muskel patologi, såvel som til bestemmelse af mekanismer bag fysiologi i dette væv. Vi vil demonstrere udarbejdelsen af extensor digitorum longus og mellemgulvet muskler for funktionel test. Protokoller for isometriske og excentriske kontraktioner vil blive vist, samt forskelle i resultater mellem dystrofiske muskler, der repræsenterer en patologisk tilstand, og vildtype muskler.
Kritisk for evalueringen af potentielle lægemidler til muskelsygdom er følsomme og reproducerbare fysiologiske vurderinger af muskelfunktion. Fordi mange prækliniske forsøg er afhængige af musemodeller for disse sygdomme, har isoleret muskelfunktion blevet en af standarderne for go / Nogo beslutninger i bevægelse lægemiddelkandidater frem i patienter. Vi vil demonstrere udarbejdelsen af extensor digitorum longus (EDL) og mellemgulvet muskler for funktionel test, der er de fremherskende muskler anvendt til disse undersøgelser. Den EDL muskel geometri er ideel til isolerede muskel præparater, med to lettilgængelige sener, og en lille størrelse, der kan understøttes af superfusionsapparatet i et bad. Membranen udviser dyb progressiv patologi i dystrofe dyr, og kan tjene som en platform for at vurdere mange potentielle terapier imødegåelse fibrose og fremme myofiber stabilitet. Protokoller for rutinemæssig afprøvning, herunder isometrisk og eccentrisk sammentrækninger, vil blive vist. Isometrisk kraft tilvejebringer vurdering af styrke og excentriske kontraktioner fremme evalueringen sarcolemma stabilitet, der er afbrudt i mange typer af muskeldystrofier. Sammenligninger af de forventede resultater mellem muskler fra vildtype og dystrofisk muskler vil også blive givet. Disse foranstaltninger kan supplere morfologiske og biokemiske målinger af væv homeostase, såvel som hele dyr vurderinger af muskelfunktion.
Muskelfunktion målinger bidrager til evalueringen af potentielle behandlinger for muskel patologi, såvel som til bestemmelse af mekanismer bag fysiologi i dette væv. For muskel sygdom, har brugen af musemodeller blevet et centralt element for at forstå sammenhængen mellem genotype og fænotype, og for at udvide denne viden i design og afprøvning af potentielle lægemidler. De muskeldystrofier især påberåbt har på mus til at evaluere disse midler og etablere prækliniske data, der kræves for at komme videre til forsøg i patienter. En hyppig effektmål bruger isoleret muskel funktion til at bestemme styrken, som gælder for en lang række undersøgelser. En anden foranstaltning er anvendelsen af excentriske, eller forlængelse, for sammentrækninger bestemme ændringer i muskel membranintegritet, som er deficient med Duchenne muskeldystrofi, og musemodellen for denne sygdom (MDX). Derfor er det vigtigt, at disse typer af measuremforældre til at være følsom og reproducerbar.
Muse extensor digitorum longus (EDL) muskel er blevet anvendt i vid udstrækning til isolerede muskelfunktion grund af sin ideelle geometri og størrelse, herunder ensartet fiberorientering og endelige sener 2, 5, 6, 10, 12. Fremgangsmåder til EDL muskler isometriske funktionelle målinger er blevet beskrevet i en tidligere publikation Jove 8, såvel som i behandlingen NMD SOP 1. Vi har udvidet beskrivelse af disse metoder til at omfatte både isometriske og excentriske kontraktioner. Kendetegnende for sygdom er tydelig i EDL, herunder heighted cykler af degeneration / regenerering og formindsket kraft output.
Musen membran udviser den hurtigste patologiske progression af muskelsvind i forhold til andre muskler i mus 11. Ved 6 måneders alderen, omfatter kumulativ fibrose omkring 50% af musklen. Dette resulterer i signifikant impaired force output 11. Derfor kan terapeutiske midler, der kan forhindre fibrotisk infiltration afvikles effektivt i membranen.
Tabet af dystrofin i muskel fører til øget skrøbelighed og øget kontraktile skader i alle muskler 9. Derfor er mange behandlinger for Duchenne muskeldystrofi er gearet til dystrophin udskiftning. Som sådan er et assay, der er blevet af afgørende betydning for evaluering af disse strategier excentrisk kontraktion, som kan skelne mellem normal og dystrofisk muskel og bestemme, hvilken nytte en særlig strategi til beskyttelse af en dystrofisk muskel fra kontraktile skader 2, 3, 4, 12. Denne procedure kræver enten en dual-mode servomotor, som kan modulere / record længde og styrke, eller en fremgangsmåde til tilpasning af længden hurtigt adskilt fra en krafttransducer.
Målet med denne artikel er at give vejledning til at udføre isoleret muskel-funktionen på to muskler fra mus – EDL og mellemgulvet. Evaluering af disse muskler kan give indsigt i, hvorvidt terapeutiske kandidater til muskel sygdom er gavnlige. For begge muskler, er den vigtigste faktor i at få solide data en ren dissektion. Ved at praktisere og perfektionere den oprindelige isolering trin er vigtigt, før du flytter ind på funktionelle test. Desuden er indførelse af funktionelle benchmarks for normal muskel kritisk inden du gør sammenligninger til dystrofisk muskel, eller mellem behandlingerne. Dette vil sikre, at undersøgelsens resultater ikke under høj variabilitet bibringes ved evnen hos den person der udfører forsøgene. Anvendelsen af en membran impermeabel farvestof kan hjælpe med at optimere dissektion præparat, inkubering af en muskel i en opløsning indeholdende et sådant farvestof vil markere de beskadigede fibre, og kan tjene som et indeks for dissection succes. Minimering af antallet af fibre beskadiget i musklen vil bidrage til at optimere målingen. Fibrene beskadiget ved dissektion fluorescerer meget mere lyst end dem beskadiget ved excentrisk kontraktion, og så hvis farvestoffet også anvendes under den mekanik proces, kan man bruge intensiteten af farvestoffet til at skelne mellem de to typer af skader.
Dissektion af membran strimler vil næsten altid fiberbeskadigelse, fordi ved at skære langs længden af fibrene, nogle uundgåeligt blive ødelagt. Farvestofoptagelse er stærk i disse beskadigede fibre, og disse er normalt begrænset til de ydre kanter af præparatet. I gennemsnit observere vi et bånd af beskadigede fibre, som er ~ 3 fibre i bredden (~ 120 um) på hver side af musklen strimlen. Hvis den beskadigede bånd omfatter mere end 15% af musklen, så den går data tabt. Membranen præparat har også begrænsninger på den optimale størrelse for funktionelle foranstaltninger. Det har vist sig, at stykker af diaphragm, der er større end 5 mm begynder at folde sig på sig selv, idet den centrale senen slips kun på et punkt. Dette resulterer i nedsat specifik kraft i præparatet. Vi har også fundet, at smalle strimler også har lavere specifik kraft, som vi finder fordi antallet af fibre beskadiget under dissektion omfatter en større del af den samlede fibermængde nummer. For eksempel, hvis 0,1 mm på hver side er beskadiget så er 5% (2×0.1 mm / 4 mm strimler) af musklen præparat, der ikke bidrager til at tvinge, hvorimod hvis strimlen er kun 1 mm, derefter 20 % af musklen præparatet er beskadiget. Således kan både bredden af den beskadigede region samt bredden af hele præparationen er vigtige faktorer til kontrol.
Målinger af maksimal isometrisk spænding kræver, at alle muskelfibre i en muskel er stimuleret. Fordi der er enorm variabilitet i de dele af en funktion apparatur, skal det bestemmes for hvert enkelt sætop. For eksempel kan bath størrelse eller type af stimulatoren påvirke intensiteten af stimulering. Twitch stimulation er en fornuftig måde at afgøre supramaximal stimulation betingelser. Når dette er fastlagt for en særlig opsætning og muskel, kan det anvendes til efterfølgende undersøgelser.
I modsætning hertil bør den optimale længde af en given muskel, der skal måles for hvert præparat ved hjælp af den iterative proces beskrevet ovenfor. Dette sikrer, at tykke og tynde filamenter overlap er optimal, og den maksimale potentielle kraft produktionskapacitet måles. Alternative procedurer kan stole på diffraktionsmønstrene forbundet med muskel riller, men det kræver ekstra udstyr ikke er beskrevet her.
Vi rutinemæssigt bruger 500 ms stimulation varigheder, der falder i midten vifte af denne parameter anvendes af andre forskere på dette område. Selv om dette kan medføre en vis træthed af musklen under sammentrækning, hvilket er tydeligtaf en "synke" i den maksimale kraft produktionen, kan dette i sig selv være oplysende. For eksempel kan en forskel i træthed opnås ved forskellige behandlinger, herunder dem, der er målrettet calcium håndtering, således nedsynkningen gældende i aktiv kontraktion kan tjene som et indeks for forbedringer. Alternativt kan tabet af kraft viser, at suturerne på senerne ikke er tætte nok, og at de glider under sammentrækning. Musklen skal fjernes fra badet og suturerne skal re-bundet, hvis dette sker. Vi bruger også en serie på 3 tetaniske sammentrækninger, som hjælper vurdere stabiliteten af præparatet. Igen vil sutur glider føre til tab af kraft mellem veerne, som kræver sutur re-binde. Store muskler kan også generere anoxiske kerner, som fører til tab af kraft i protokollen. Muskel størrelse er en begrænsende faktor for at udføre isoleret muskelfunktion test, hvor EDL muskler med masser på over 20 mg mister kraft med hver entretion, og som ikke kan understøttes af superfusionsapparatet i et bad. Membran strimler lider ikke af de samme komplikationer, fordi de er tynde nok til at have langvarig levedygtighed i badet.
Andre muskler kan anvendes til isoleret muskelfunktion, herunder soleus-muskel, der er almindeligt anvendt, men ikke er beskrevet her. Mange af de samme procedurer kan vedtages for soleus med hensyn til forberedelse og den funktionelle test. Imidlertid de væsentligste forskelle er i stimuleringen frekvens, og parametrene for excentriske kontraktioner. Anvendelse af soleus til funktion supplerer de to andre muskler, og så det bør betragtes som en del af en "standard pakke" for at vurdere dystrofe mus 4, 7.
Excentrisk kontraktion giver et indeks for kontraktile skrøbelighed, og det er vigtigt at bruge en protokol, der resulterer i beskedne tab af kraft i musklerne fra vildtype dyr og et betydeligt tab af kraft iubehandlede dystrofiske muskler, så der er et stort dynamikområde for sammenligninger. En mangel på nogen kraft tab i normale muskler viser, at den excentriske kontraktion er for mild, og vil ikke være hensigtsmæssige til at skelne mellem terapier, der ikke er effektive og dem, som drages fordel. Dog kan en dramatisk tab af kraft i normale muskler udsat for excentrisk kontraktion være for stor til at drille de forskelle, der er forbundet med sygdommen. Vores protokol for EDL og membranen anvender en 0,5 Lo / sek stretch rate til at producere en 10% længde forandring. Vi udfører typisk 5 excentriske kontraktioner, der resulterer i en lille tab af magt i normale muskler og et betydeligt tab af kraft i dystrofe muskler. Ganske vist kan alle disse parametre varieres for at forøge den samlede længdeændring, graden af strækning, eller antallet af excentriske kontraktioner for at skelne forskelle mellem sygt og sundt muskelvæv samt om virkningerne af en specifik type af mutation eller tEHANDLING man studerer. Så længe der er en markant forskel mellem normale og sygdomsramte muskler, så er der en guld standard for at nå til i form af behandlinger.
Sammenfattende fastslår denne protokol retningslinjer for udførelse af isometriske og excentriske kontraktioner, og forhåbentlig identificerer de potentielle faldgruber for at undgå, når du indstiller denne teknik op i dit laboratorium.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Paul D. Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
in vitro Muscle Test System | Aurora Scientific | 1200A | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | |
ACE light source | Schott-Fostec | A20500 | |
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
Angled dissecting scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | alternate dissecting tool |
Curved scalpel blades #12 | Fine Science Tools | 10012-00 | alternate dissecting tool |
Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | |
S&T suture tying forceps | Fine Science Tools | 00272-13 | |
Dumont SS forceps – angled | Fine Science Tools | 11203-25 | |
Braided silk suture size 6-0 | Teleflex Medical | 07-30-10 | |
Medical tape | Transpore | 3M | |
Ketamine hydrochloride 100 mg/ml | Hospira | NDC 0409-2051-05 | Final Dose is 80 mg/kg |
TranquiVed Injection (xylazine 100 mg/ml) | Vedco | NDC 50989-234-11 | Final Dose is 10 mg/kg |
Reactive orange 14 | Sigma-Aldrich | R-8254 | |
Ringers Solution Components | Solution is gas equilibrated with 95% O2 and 5% CO2, final pH 7.4 | ||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Final Concentration: 118 mM |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | Final Concentration: 4.7 mM |
Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | Final Concentration: 2.5 mM |
Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | P-285 | Final Concentration: 1.2 mM |
Magnesium sulfate | J.T. Baker | 2500-01 | Final Concentration: 0.57 mM |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher Scientific | BP310-500 | Final Concentration: 5.95 g/L |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Final Concentration: 5.5 mM |