评估来自肌营养不良症小鼠模型的分离骨骼肌的等长和离心收缩力

摘要

肌肉功能的测量有助于评估肌肉病理的潜在治疗方法，以及阐明该组织生理学的潜在机制。我们将演示趾长伸肌和膈肌的功能测试前处理。将展示等长收缩和离心收缩的实验方案，并比较代表病理状态的肌营养不良肌肉与野生型肌肉在实验结果上的差异。

摘要

评估肌肉疾病潜在治疗方法的关键在于对肌肉功能进行敏感且可重复的生理学检测。由于许多临床前试验依赖小鼠模型来研究这些疾病，分离肌肉功能检测已成为决定是否将候选药物推进至患者临床试验的“通过/不通过”标准之一。我们将演示用于功能测试的趾长伸肌（EDL）和膈肌的制备方法，这两种肌肉是此类研究中最常使用的组织。EDL肌肉的几何结构非常适合离体肌肉实验：其具有两个易于操作的肌腱，且体积较小，可通过浴槽中的灌流液维持其活性。在肌营养不良动物中，膈肌表现出显著且进行性的病理变化，因此可作为评估多种抗纤维化及促进肌纤维稳定疗法效果的理想平台。本视频将展示常规测试的操作流程，包括等长收缩和离心收缩实验。等长收缩力可反映肌肉力量，而离心收缩则有助于评估肌膜稳定性——后者在多种类型的肌营养不良症中均受到破坏。我们还将提供野生型与肌营养不良型肌肉之间预期实验结果的比较。这些功能学指标可与组织稳态的形态学和生化检测结果相互补充，并结合整体动物的肌肉功能评估，全面反映治疗效果。

引言

肌肉功能测量有助于评估肌肉病理的潜在治疗方法，以及确定该组织生理学机制。对于肌肉疾病而言，小鼠模型已成为理解基因型与表型之间联系的核心工具，并推动相关知识应用于潜在治疗手段的设计与测试。特别是肌营养不良症领域，依赖小鼠模型来评估这些治疗剂，并建立推进至患者临床试验所需的临床前数据。一种常用的结果评估方法是利用离体肌肉功能测定肌肉力量，该方法适用于多种研究。另一种方法是采用离心（即拉长）收缩来检测肌肉膜完整性的变化，这种完整性在杜氏肌营养不良症及其小鼠模型（mdx）中存在缺陷。因此，这类测量方法必须具备高灵敏度和可重复性。

由于小鼠趾长伸肌（EDL）具有理想的几何形态和大小，包括均匀的肌纤维排列方向和明确的肌腱结构，因此被广泛用于离体肌肉功能研究^{2, 5, 6, 10, 12}。关于EDL肌肉等长功能测量的方法已在先前的JoVE出版物⁸以及Treat-NMD标准操作程序（SOP）¹中有所描述。我们在此基础上进一步扩展了这些方法，以同时包括等长收缩和离心收缩的测量。EDL肌肉中可明显观察到疾病特征，包括加剧的变性/再生循环以及收缩力输出下降。

与其他小鼠肌肉相比，小鼠膈肌表现出最快的肌营养不良病理进展¹¹。到6月龄时，累积的纤维化约占肌肉组织的50%。这导致肌肉力量输出显著受损¹¹。因此，能够预防纤维化浸润的治疗药物可在膈肌中进行高效评估。

肌肉中抗肌萎缩蛋白的缺失会导致所有肌肉的脆性增加以及收缩性损伤加重⁹。因此，许多针对杜氏肌营养不良症的治疗方法均以抗肌萎缩蛋白的替代为目标。在评估这些治疗策略时，偏心收缩实验已成为一项关键检测方法，该方法能够区分正常肌肉与肌营养不良肌肉，并可确定某种特定策略在保护肌营养不良肌肉免受收缩性损伤方面的效果^{2, 3, 4, 12}。该实验需要使用一种双模式伺服电机，能够调节和记录肌肉长度与力量，或采用一种独立于力传感器的快速调节长度的方法。

方案

所有实验程序均已通过宾夕法尼亚大学动物照护与使用委员会（IACUC）的审查并获得批准。

1. EDL 解剖与制备（约 30 分钟）

1. 麻醉小鼠，以确保其在操作过程中无疼痛或痛苦，同时维持肌肉通过血液循环充分供氧。我们常规采用腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合剂（100/10 mg/kg）。手术麻醉深度的判断标准为：足底或足趾回缩反射完全消失，以及耳部抽动反应缺失。
2. 用医用胶带固定后肢，去除下肢前侧的皮肤以暴露该区域的肌肉。定期滴加PBS以保持肌肉湿润。
3. 在解剖显微镜下，于膝关节外侧做一小切口，以暴露趾长伸肌（EDL）的近端肌腱。该区域有两条肌腱，均需切断，以便完整取出EDL肌肉。
4. 在内侧踝部，切断趾长伸肌（TA）的肌腱，以暴露趾长伸肌（EDL）的远端肌腱，后者沿该区域延伸 跖骨将趾长伸肌（TA）肌肉轻轻移开，注意不要剪切或触碰其下方的趾短伸肌（EDL）。回到EDL的远端肌腱处，逐一剪断，并将其从踝部拉出。抓住肌腱，轻柔地将EDL肌肉从肢体其余部分分离。肌肉应能从近端自由脱离；若不能，请返回至外侧切口处，确认肌腱是否已完全切断。取出肌肉后置于盛有冷的充氧林格液的解剖皿中。通过肌腱将肌肉固定，使其长度大致处于静息长度，即在活体中自然观察到的长度。 体内肌肉在培养皿中松弛时长度过短，若肌肉牵拉解剖针则过长。
5. 在取出肌肉后，立即通过颈椎脱位处死小鼠。
6. 将缝合线系在肌腱上，尽可能靠近肌肉但不接触肌肉。利用缝合线将肌肉固定在大约静息长度的位置。

2. 膈肌解剖与制备（约30分钟）

1. 若同一只小鼠需进行两次解剖操作，应在麻醉下通过颈椎脱位处死小鼠；否则可先使用 CO₂ 处死，再通过颈椎脱位确认死亡。
2. 在皮肤上做切口以暴露腹腔和胸腔。打开腹腔，于肋骨下方切断体壁。使用骨剪，从膈肌附着点上方开始，沿肋骨走向环绕整个肋笼剪开，并剪断脊柱。剪断穿过膈肌中心的血管，以便于完整取出膈肌。
3. 将膈肌从小鼠体内取出后，置于盛有充氧林格液的解剖皿中。轻轻搅动膈肌以洗去血液，根据需要更换林格液。
4. 从小鼠两侧半侧膈肌中央部分沿肌纤维走向，从中心腱至肋骨处切取一条窄条组织，宽度应为 2–4 mm。使用骨剪在该膈肌条两侧的肋骨上进行剪切，使每侧保留约 1–2 mm 的肋骨突出端。
5. 在中心腱处绑上缝合线。在两侧突出的肋骨末端分别绑上线，再将这两根线绑在一起形成一个大环。
6. 每只小鼠的膈肌可获得两条上述组织条（每侧各一条）。

3. 在力学浴槽中安装肌肉

1. 抓住缝线，并利用这些缝线将肌肉一端固定在刚性支柱上，另一端连接至力传感器。
2. 调整肌肉长度，确保肌肉既无松弛，也不过度拉紧。一个合适的近似值为静息状态下的肌肉长度，即 1.4 - 1.5 倍。
3. 浴槽中应充满充氧的林格氏液，并维持在 22 °C，以延长肌肉在测试期间的稳定性。在进行功能测试前，肌肉应在该浴槽中静置 5 分钟，使其温度充分平衡至 22 °C。

4. 等长收缩

1. 建立超最大刺激条件。将肌肉置于浴槽中后，使用单次0.5毫秒的刺激脉冲引发肌肉收缩，并监测其产生的张力。逐步增加电流强度，直至张力达到最大且稳定水平。在后续实验中，将电流强度设定为超过该水平10%的数值。
2. 确定最佳长度。通过等长单收缩刺激，逐步调节肌肉长度，直至获得最大收缩力。每次收缩之间使肌肉休息约10秒。最佳肌肉长度（L_o当收缩力达到最大时即可获得。使用游标卡尺记录肌肉长度（对于趾长伸肌（EDL），测量肌腱结合处之间的长度；对于膈肌，测量中心腱的肌腱结合处与肌肉在肋骨上的附着点之间的长度）。
3. 最大等长强直收缩力。在L长度下刺激肌肉_o 持续500毫秒，以超最大刺激强度和融合频率（来自频率-力量关系曲线的平台期）施加一系列0.5毫秒的脉冲例如 参考文献： ⁸). EDL 肌肉的平台期通常在 120 Hz 时达到，膈肌肌肉则在 100 Hz 时达到。每块肌肉在相应频率下刺激 3 次，每次刺激组之间休息 5 分钟。

5. 离心收缩

1. 在进行等长收缩和离心收缩之间，使肌肉休息 5 分钟。
2. 以 80 Hz 对肌肉进行等长刺激，前 500 毫秒为等长刺激，随后在最后 200 毫秒刺激期间进行 10% L_o 的拉伸（拉伸速率为 0.5 L_o/秒）。
3. 重复该刺激模式，每次之间休息 5 分钟，直至完成所需次数的离心收缩。
4. 测量每次收缩在拉伸前时间段内的力量。计算第一次与最后一次收缩之间的力量下降值。

6. 从装置上移除肌肉

1. 缩短肌肉长度，以便轻柔地将肌肉从换能器和固定柱上取下，并将其放回盛有林格液的解剖皿中。
2. 移除肌肉上的缝线。
3. 对于EDL肌肉，先将肌肉 blot 两次，然后称重，再进行后续处理（例如 冷冻、固定等）。这对于计算横截面积和比力至关重要。
4. 对于膈肌，用0.1%派洛宁橙（procion orange）——一种细胞膜非通透性染料——浸泡15–20分钟。这将作为解剖损伤的指标。
5. 从骨性附着点及中央腱处分离肌肉，以获得准确的肌肉重量。称重及后续处理前，按上述方法吸干。
6. 计算横截面积（CSA）：
   CSA（mm²）²）＝质量（mg）／［（L_o 毫米）×（升/升）_o) * (1.06 mg/mm³)],
   其中 L/L_o 是肌纤维与肌肉长度的比值（EDL 为 0.45，膈肌为 1.0）⁵ 1.06 是肌肉的密度。

结果

12周龄动物EDL肌肉的等长收缩力预期值如图1所示。由于mdx肌肉存在代偿性肥大，其强直收缩力可能高于同龄野生型对照组。然而，更合适的肌肉功能输出指标是比力（图2），该值通过将收缩力标准化为横截面积来计算。比力反映了肌肉固有的功能能力，当同时考虑绝对收缩力和横截面积时，营养不良肌肉的薄弱性更为明显。在我们的实验中，从10至26周龄的小鼠中分离出的mdx小鼠EDL肌肉，其比力比同龄野生型小鼠低约20–25%。

对于膈肌而言，由于标本是依赖于解剖获得的肌肉片段，因此仅比力（specific force）适用于比较。野生型与mdx小鼠膈肌之间比力的比较反映了该组织中进行性病理变化。等长收缩力随年龄增长而下降（图3），至6月龄时，mdx小鼠膈肌产生的功能输出不超过同龄野生型对照小鼠膈肌肌条的一半。

膈肌测试中离心收缩的一个示例如下所示 图4在野生型（C57）和 mdx 小鼠的膈肌条中，随着后续离心收缩的进行，力量输出均逐渐下降。然而，mdx 小鼠肌肉样本的力量损失更为显著，这可能是由于缺乏肌营养不良蛋白（dystrophin）及其相关蛋白所致。

图1. 12周龄小鼠野生型与mdx小鼠EDL肌肉的等长强直收缩力。由于代偿性肥大，同龄mdx小鼠EDL肌肉的绝对收缩力可能更高。

图 2. 以肌肉横截面积归一化的等长强直力即为比力，显示mdx小鼠的EDL肌肉功能能力较野生型小鼠下降。图中曲线来自与图 1相同的实验小鼠。

图3. 通过比力评估的肌肉力量生成能力进行性下降，在mdx小鼠的膈肌（红色柱）中表现最为明显，相比之下，野生型小鼠（C57，蓝色线）则无明显下降。

图4. 12周龄C57和mdx小鼠膈肌在不同离心收缩次数下的力量损失情况。数据为每种基因型N=4块肌肉的平均值±标准误。

讨论

本文旨在为小鼠两种肌肉——趾长伸肌（EDL）和膈肌——的离体肌肉功能实验提供操作指导。对这两种肌肉的功能评估有助于判断肌肉疾病候选治疗手段是否具有益处。对于这两种肌肉而言，获得可靠数据的关键因素在于精细的解剖过程。因此，在开展功能测试之前，必须先通过练习完善初始的分离步骤。此外，在对肌营养不良肌肉进行比较或不同处理之间进行比较之前，建立正常肌肉的功能基准至关重要。这将确保研究结果不受实验操作者技术差异带来的高变异性影响。使用膜不通透性染料有助于优化解剖制备过程，因为将任何肌肉孵育在含有该染料的溶液中，可使大多数受损肌纤维被标记，从而作为评估解剖成功程度的指标。尽量减少解剖过程中受损的肌纤维数量，有助于优化测量结果。解剖造成的肌纤维损伤比偏心收缩引起的损伤荧光强度更高，因此，若在力学实验过程中也使用该染料，则可通过染料荧光强度来区分这两种类型的损伤。

分离膈肌条时几乎总会造成肌纤维损伤，因为沿纤维长度方向切割时，不可避免地会破坏部分纤维。受损纤维对染料的摄取较强，且这些受损区域通常局限于制备物的外缘。平均而言，我们在肌条两侧各观察到约3层纤维宽度（约120 μm）的损伤带。如果损伤区域超过肌肉总体积的15%，则该数据将被舍弃。膈肌标本在进行功能测量时，其最佳尺寸也存在限制。我们发现，当膈肌条宽度超过5 mm时，由于中心腱仅在一个点固定，标本容易发生自身折叠，从而导致标本的比力下降。我们还发现，过窄的肌条其比力也较低，这可能是由于解剖过程中受损纤维的数量占总纤维数的比例更大所致。例如，若每侧边缘有0.1 mm的损伤，则在4 mm宽的肌条中，非功能性区域占5%（2×0.1 mm / 4 mm肌条）；而若肌条宽度仅为1 mm，则损伤区域将占到整个肌肉制备物的20%。因此，损伤区域的宽度以及整个标本的宽度都是需要严格控制的重要因素。

测量最大等长张力需要刺激肌肉中的所有肌纤维。由于功能装置的各个组件存在极大的差异，因此必须针对每个独立的实验装置确定合适的刺激条件。例如，浴槽的大小或刺激器的类型都可能影响刺激强度。单次电刺激是确定超强刺激条件的合理方法。一旦针对特定装置和肌肉确定了该条件，便可将其用于后续研究。

相比之下，任何特定肌肉的最适长度都需要使用上述迭代过程对每种制备样本进行测量。这可确保粗肌丝与细肌丝的重叠达到最佳状态，从而测得肌肉最大的潜在收缩力。其他方法可能依赖于肌肉横纹相关的衍射图样，但这需要额外的设备，本文未予描述。

我们常规使用500毫秒的刺激持续时间，该参数处于本领域其他研究者所用范围的中段。尽管这可能在肌肉收缩期间引起一定程度的疲劳（表现为最大力量输出出现“下垂”），但这种现象本身具有信息价值。例如，不同类型的治疗（包括针对钙处理的疗法）可能导致疲劳程度的差异，因此收缩过程中力量的下垂可作为改善效果的一个指标。另一方面，力量的下降也可能表明肌腱上的缝线不够紧，在收缩过程中发生了滑脱。若出现这种情况，必须将肌肉从浴槽中取出并重新打结固定。我们还采用一系列3次强直性收缩，以帮助评估制备样本的稳定性。同样，缝线滑脱会导致各次收缩之间的力量下降，需要重新打结。较大的肌肉还可能产生缺氧核心，从而导致实验过程中力量下降。肌肉大小是进行离体肌肉功能测试的一个限制因素，质量超过20 mg的趾长伸肌（EDL）在每次收缩时都会出现力量衰减，且无法通过浴槽灌流维持其功能。膈肌条则不会出现类似问题，因其足够薄，可在浴槽中长时间保持活性。

其他肌肉也可用于独立的肌肉功能研究，包括常用的腓肠肌，但本文未作描述。在制备和功能检测方面，许多相同的操作步骤同样适用于腓肠肌。然而，主要差异在于刺激频率以及离心收缩的参数设置。腓肠肌的功能研究可与另外两种肌肉相互补充，因此应将其视为评估肌营养不良小鼠的“标准组合”之一 ^{4, 7}。

离心收缩可作为收缩脆弱性的指标，因此必须采用一种实验方案，使野生型动物肌肉的收缩力出现适度下降，而未经治疗的肌营养不良肌肉则出现显著的收缩力下降，从而为比较提供较宽的动力学范围。若正常肌肉在离心收缩后未出现任何收缩力下降，提示离心收缩刺激过轻，不足以区分无效治疗与真正有效的治疗。然而，若正常肌肉在离心收缩后出现剧烈的收缩力下降，则可能过于强烈，难以分辨与疾病相关的差异。我们针对趾长伸肌（EDL）和膈肌的实验方案采用0.5 Lo/sec的拉伸速率，产生10%的长度变化。通常进行5次离心收缩，这会导致正常肌肉收缩力轻微下降，而肌营养不良肌肉则出现显著下降。当然，所有这些参数均可调整，例如增加总长度变化、拉伸速率或离心收缩次数，以区分患病肌肉与健康肌肉之间的差异，以及特定突变类型或所研究治疗手段的影响。只要正常肌肉与患病肌肉之间存在明显差异，便可为治疗效果提供一个公认的金标准。

总之，本方案为进行等长收缩和离心收缩实验建立了操作规范，并希望帮助您在实验室中建立该技术时识别并避免潜在的错误。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
体外 肌肉测试系统	Aurora Scientific	1200A
解剖显微镜	Leica	MZ6
ACE 光源	Schott-Fostec	A20500
解剖剪刀	Fine Science Tools	14060-11
斜头解剖剪刀	Fine Science Tools	15006-09
手术刀柄	Fine Science Tools	10003-12	替代解剖工具
弧形手术刀片 #12	Fine Science Tools	10012-00	替代解剖工具
骨剪	Fine Science Tools	16044-10
S&T 缝合打结镊	Fine Science Tools	00272-13
Dumont SS 镊子 - 斜头	Fine Science Tools	11203-25
6-0 编织丝线缝合线	Teleflex Medical	07-30-10
医用胶带	Transpore	3M
盐酸氯胺酮 100 mg/ml	Hospira	NDC 0409-2051-05	终浓度剂量为 80 mg/kg
特拉咪唑注射液（甲苯噻嗪 100 mg/ml）	Vedco	NDC 50989-234-11	终浓度剂量为 10 mg/kg
活性橙 14	Sigma-Aldrich	R-8254
林格溶液组分			溶液经 95% O2 和 5% CO2 平衡，终 pH 值为 7.4
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653	终浓度：118 mM
氯化钾	Fisher Scientific	P217-3	终浓度：4.7 mM
二水合氯化钙	Fisher Scientific	C79-500	终浓度：2.5 mM
磷酸二氢钾	Fisher Scientific	P-285	终浓度：1.2 mM
硫酸镁	J.T. Baker	2500-01	终浓度：0.57 mM
4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）	Fisher Scientific	BP310-500	终浓度：5.95 g/L
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	终浓度：5.5 mM