Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

Sommario

Si descrive un metodo per l'imaging di risposta anti-cancro In vivo E alla risoluzione di singola cellula.

Abstract

Il microambiente tumorale gioca un ruolo fondamentale nella iniziazione del tumore, la progressione, metastasi, e la risposta alle terapie anti-tumore. Tridimensionali di co-coltura sistemi sono spesso utilizzati per spiegare le interazioni tumore-stroma, compreso il loro ruolo nella risposta ai farmaci. Tuttavia, molte delle interazioni che avvengono in vivo nel microambiente intatto non può essere completamente replicata in queste impostazioni in vitro. Pertanto, la visualizzazione diretta di questi processi in tempo reale, è diventato uno strumento importante per capire le risposte alle terapie tumorali e individuare le interazioni tra cellule tumorali e lo stroma che possono influenzare queste risposte. Qui forniamo un metodo per utilizzare la microscopia confocale filatura disco di vivo, topi anestetizzati osservare direttamente la distribuzione di droghe, le risposte delle cellule tumorali e le variazioni tumore-stroma interazioni in seguito alla somministrazione di terapia sistemica in modelli di cancro al seno. Si descrivono le procedure per labeling componenti tumorali diverse, il trattamento degli animali per l'osservazione di risposte terapeutiche, e la procedura chirurgica per l'esposizione di tessuti tumorali per immagini fino a 40 ore. I risultati ottenuti da questo protocollo sono filmati time-lapse, in cui i processi come l'infiltrazione di droga, morte delle cellule tumorali e la migrazione delle cellule stromali possono essere valutati utilizzando software di analisi delle immagini.

Introduzione

Tumori solidi sono costituiti da due compartimenti principali: le cellule tumorali e le componenti stromali (sia cellulare e non cellulare) che aiutano a mantenere un ambiente adatto per la crescita tumorale ^1. Questi componenti stromali giocano un ruolo critico nello sviluppo, progressione e metastasi di molti tipi di tumori, compresi quelli del seno ^2-5. L'ambiente stromale influenza anche le risposte terapeutiche ^2,4,5. Così, determinando come le cellule tumorali rispondono alle terapie convenzionali e romanzo nel contesto del microambiente intatto è importante per la nostra comprensione della biologia del cancro e migliorare attuali strategie terapeutiche. Inoltre, definendo le modalità di cellule di cancro-stroma interazioni cambiano in seguito alla somministrazione della terapia è fondamentale per la comprensione della biologia di recidiva tumorale.

Organotipiche co-coltura di sistemi sono stati utili per lo studio delle interazioni tumore-stroma ^{6, ma è evidente che i metodi attualmente disponibili non correttamente ricapitolare il microambiente intatta tumorale in vitro, in particolare per quanto riguarda la funzione vascolare e reclutamento di cellule immunitarie. Infatti, le risposte delle cellule tumorali a terapie che vengono osservate in vitro sono spesso significativamente differenti da quelle osservate in vivo, in cui il microambiente è intatto 5. Così, in modelli in vivo per lo studio del tumore-stroma interazioni e il loro impatto sulla risposta terapeutica può rispecchiare meglio i meccanismi clinicamente rilevanti 7.}

Il mezzo principale di studiare le risposte a terapia antitumorale in vivo sono passati attraverso le misurazioni di dimensione del tumore e la valutazione istologica dei tessuti provenienti da animali trattati o pazienti. Tuttavia, i progressi nella microscopia a fluorescenza e giornalisti nel corso degli ultimi due decenni hanno permesso la visualizzazione di processi inter-e intracellularead alta risoluzione in un animale vivo, anestetizzati (intravitale imaging) ^8. Queste tecnologie microscopia intravitale hanno dimostrato di essere particolarmente utile per spazialmente e temporalmente la dissezione nella dinamica in vivo del tumore-stroma interazioni con risoluzione cellulare e sub-cellulare ^8,9.

Processi che sono stati svelati da imaging intravitale includono antitumorale citotossicità delle cellule T ^10,11, interazioni tra cellule T e cellule mieloidi ^12, la dinamica dei cambiamenti nella composizione collagene e organizzazione dopo il trattamento terapeutico ^13, macrofagi-dipendente intravasation cellula tumorale e metastasi ^14, e la permeabilità vascolare ^15.

Ci sono tre requisiti principali per l'imaging intravitale. Questi includono la preparazione adeguata e l'esposizione di tessuti per l'imaging, l'etichettatura fluorescente delle componenti del tessuto di interesse, e di una coppia di microscopia-camera sistema in grado di acquisire immagini ^16. Le strategie più comuni utilizzati per rispondere a queste esigenze sono: 1) preparati eterotopiche (ad esempio, l'inoculazione del orbitale orecchio o con gli occhi), permanente Imaging per Windows o preparati esteriorizzato (ad esempio, lembo di pelle dorsale), 2) transgenici fluorescenti e giornalisti.. iniettabili fluorescenti di etichettare componenti del tessuto e 3) sistemi di microscopia confocale multiphoton o in coppia con tubi fotomoltiplicatori o charge-coupled device (CCD), rispettivamente ^9. Usiamo un modello preparato chirurgicamente lembo cutaneo per esporre la ghiandola mammaria inguinale per l'imaging in animali anestetizzati che esprimono transgeni codificanti reporter fluorescenti. Immagini sono ottenute in un periodo di 12 a 40 ore utilizzando un CCD intensificata (ICCD) fotocamera accoppiato con quattro laser filatura sistema microscopio confocale disco ^17. Imaging in questo modo ci ha permesso di studiare i processi, come nella distribuzione di farmaci in vivo, la fase-dipendente chrisposte emotherapeutic, il tipo di chemioterapia morte cellulare, e il comportamento delle cellule mieloidi ^5.

Forniamo un protocollo per l'imaging intravitale delle risposte delle cellule tumorali di terapia antitumorale e tumore-stroma interazioni in modelli murini di cancro al seno. Questo protocollo può essere utilizzato per monitorare i comportamenti e la morte di entrambe le cellule tumorali e componenti stromali con una vasta gamma di etichette fluorescenti transgenici e iniettabili sia in modelli transgenici e il trapianto per periodi fino a 40 ore in una singola sessione di imaging.

Protocollo

Tutte le procedure descritte devono essere effettuate in conformità con le linee guida e le norme per l'uso di animali vertebrati, inclusa l'approvazione preventiva da parte della cura locale Animal Istituzionale e del Comitato uso.

1. Generazione di tumori mammario del topo per l'imaging (transgenici o ortotopico)

1. Generare i tumori mammari per l'imaging che utilizzano modelli murini geneticamente modificati (ad esempio virus del tumore mammario del topo lunga ripetizione terminale [MMTV]-polioma mezzo T antigene [PyMT] o il ratto C3 (1) promotore guidato antigene T grande (Tag) di SV40 [C3 ( 1)-Tag] modelli) o modelli trapianto ortotopico (singenici, allogenica o xenogenica).
2. Etichetta le cellule tumorali attraversando modelli geneticamente modificati con linee giornalista transgeniche (ad esempio ACTB-ECFP) o utilizzare la manipolazione ex vivo di cellule tumorali primarie o linee cellulari (trasduzione ad esempio) seguita da trapianto. Per un protocollo campione per ortotopico trapianto, see ^18.

2. Componenti visualizzazione del microambiente tumorale o sub-cellulari Componenti

1. Visualizzazione componenti tumore usando etichette transgenici. Crossbreed geneticamente modelli tumorali con topi reporter transgenici (ad esempio, c-fms-EGFP per le cellule mieloidi o ACTB-H2B-EGFP per nuclei) o utilizzare i topi, come destinatari di trapianto, tessuti etichettati. Questo consente la visualizzazione di cancro cellula-stromali interazioni cellulari in risposta alla terapia o cambiamenti nucleari associati alla morte cellulare, rispettivamente.
2. Visualizzare il microambiente con iniettabili. Una grande varietà di agenti (ad esempio fluorescente anticorpi o coloranti chimici) può essere usato per etichettare vari componenti del tumore. A seconda del tempo di dimezzamento del colorante e la risposta è interessato uno in tracking, il iniettabile può essere somministrato prima dell'inizio di imaging o durante la sessione di imaging per via endovenosa (iv.) O intraperitoneally (ip., Figura 1).

3. Microscopi e software di imaging

1. Microscopio. Una varietà di sistemi microscopio e software può essere utilizzato per l'imaging di topi vivi. I sistemi più comunemente usati sono microscopi confocali o multifotone. Usiamo un micro-lensed microscopio disco rotante confocale (Technologies Solamere, Salt Lake City, UT) con una fotocamera ICCD (XR-Mega-10EX S-30, Stanford Photonics, Palo Alto, CA).
2. Imaging software. Usiamo il aperta μManager source software (Vale Lab, University of California, San Francisco [UCSF]).
3. Immagine analisi. Usiamo Imaris (Bitplane), Volocity (PerkinElmer), e ImageJ (National Institute of Health [NIH]) per l'analisi delle immagini.

4. (Pre)-trattamento degli animali per l'imaging

1. Inguinali tumori mammari sono ottimali per l'imaging utilizzando il nostro protocollo quando il diametro più lungo misura circa 8 mm o meno di pinza di misuraement.
2. Per gli animali di imaging trattati con un inibitore piccola molecola, anticorpo terapeutico o farmaco chemioterapeutico, iniziare il trattamento prima o durante l'imaging come richiesto per l'esperimento. Per esempio, l'imaging di stravaso farmaco e distribuzione richiede la somministrazione dopo l'imaging è stato avviato (Film 1 e 2), mentre l'imaging di morte cellulare indotta dalla doxorubicina farmaco chemioterapico è meglio catturato avviando immagini 24 ore o più dopo trattamento farmacologico (Film 3 e 4).

5. Preparazione di Saline per il mantenimento Osmolarità Idratazione e sangue dell'animale durante Imaging

1. Prelevare circa 1 ml di 1x PBS in una siringa da 1 ml. Ioduro di propidio (PI, Invitrogen, 1 mg / ml, 1:15 diluito) può essere aggiunto a questa soluzione che verrà periodicamente somministrato (ip.) Durante la sessione di imaging. Ciò consentirà per l'imaging dei nuclei di cellule morte o morenti che hanno membrane cellulari permeabili. PI ha una molto breve half-vita nel sistema vascolare e deve quindi essere somministrato durante la sessione di imaging.
2. Collegare un set alato infusione (23 gauge, ¾ dell'ago pollici, 12 in pollici) per la siringa e spingere la soluzione attraverso il tubo fino a una goccia di uscite di soluzione salina la punta dell'ago al termine del tubo.
3. Rimuovere la siringa dal set di infusione, e riempire con la soluzione appropriata salina.
4. Riattaccare la siringa al set di infusione, facendo attenzione a non introdurre bolle nella linea.

6. Preparazione del sistema di anestesia isoflurano

1. Aggiungere acqua al nebulizzatore e avvitarlo in posizione. Ciò umidificare i gas consegnati animale, evitando irritazione dei polmoni e prolungare la sopravvivenza degli animali sotto lungo termine anestesia.
2. Riempire il serbatoio isoflurano sulla riga superiore. ATTENZIONE: isoflurano è un anestetico potente che può colpire anche il ricercatore. Sistemi di aspirazione adeguati dovrebbe be per garantire che i gas in eccesso vengono rimossi dalla zona.
3. Accendere sia il serbatoio di ossigeno ed i serbatoi di azoto e regolare il flusso. L'azoto dovrebbe essere di circa 1,0 L / min, mentre l'ossigeno deve essere di circa 0,2 L / min (~ 21%).
4. Accendere la (in-house) vuoto. Il vuoto dovrebbe essere di circa 1,2 L / min.
5. Confermare che la linea anestesia alla camera di induzione è aperta, e le linee a l'area chirurgia e il microscopio sono chiuse.
6. Verificare che il sacco polmone lattice collegata al sistema di anestesia viene gonfiato. Se la borsa non si gonfia, sostituirlo.
7. Controllare il diaframma di gomma su ciascuno dei Coni consegnano anestesia alla fase microscopio e la piattaforma chirurgica. Se la gomma comincia a sottile, sostituirlo.

7. Preparazione di strumenti chirurgici e piattaforma chirurgica

1. Attivare uno sterilizzatore a caldo tallone e portarlo> 200 ° C.
2. Lavare gli attrezzi chirurgici in acqua e sapone(Una coppia di pinze [preferibilmente con denti] e forbici per tagliare attraverso la pelle dell'animale, una coppia di pinze [preferibilmente zigrinata] e forbici per ulteriore esposizione del tumore).
3. Sterilizzare gli strumenti chirurgici per almeno 30 secondi con la modalità hot tallone sterilizzatore (in alternativa, gli strumenti chirurgici possono essere sterilizzati in autoclave in anticipo).
4. Lasciate che gli strumenti chirurgici rinfrescarsi facendo in modo di evitare di contaminare gli strumenti sterilizzati.
5. Raccogliere il coperchio di un dispositivo di raffreddamento di spedizione polistirolo. Questo sarà il tuo piattaforma chirurgica.
6. Posizionare un pezzo di un soaker laboratorio sulla parte superiore del coperchio polistirolo (sufficiente a coprire).
7. Applicare un cono con una linea al sistema di anestesia per il soaker laboratorio con del nastro da laboratorio (1 "nastro funziona meglio qui). Inserire un G 18 x1 ½" ago attraverso il nastro nel coperchio di polistirolo su entrambi i lati del cono di mantenere il cono fissato in posizione.
8. Mettere da parte il Betadine, garze sterili, due salviette isopropanolo al 70%, un microscopiopezzi di diapositive, colla Krazy, e 4 di nastro di laboratorio (½ "larghezza).

8. Preparazione del Microscopio

1. Accendere il microscopio, la fotocamera e il computer che esegue il microscopio.
2. Accendere la termocoperta.
3. Se un microscopio invertito deve essere utilizzato, in un apposito inserto fase devono essere progettati con porte di imaging corrispondenti alla posizione delle ghiandole mammarie inguinali. Pulire la fase di inserire bene con acqua e sapone e asciugare. Utilizzare nastro di laboratorio (½ "funziona meglio) per garantire la copertura in vetro (# 1.5 spessore) tramite le porte di imaging e pulire l'intera superficie con il 70% di isopropanolo. Coprire il palco con garza sterile per la protezione contro la contaminazione. Posizionare l'inserto fase in fase di e lasciare asciugare all'aria.
4. Strappare 4-6 pezzi di nastro lab (1 "larghezza), circa 6 pollici di lunghezza e di collegarli a lato del microscopio. Questi pezzi di nastro viene utilizzato per posizionare l'anestesia cono fornire all'animale und fissarlo.
5. Strappare due pezzi in più di nastro (larghezza ½ pollici) che sono circa un pollice di lunghezza. Questi saranno utilizzati per mantenere l'ago a farfalla consegna PBS al mouse e il vetrino utilizzato per esporre il tumore in atto.

9. L'esposizione della ghiandola inguinale mammaria per l'imaging

1. Anestetizzare l'animale in una camera di induzione con 4% isoflurano con il 21% di ossigeno e azoto equilibrio (portata a circa 1,0 L / min) come gas di trasporto. Questo dovrebbe richiedere 2-4 minuti.
2. Trasferire il mouse per la piattaforma chirurgica una volta respirare profondamente e lentamente, con la superficie ventrale rivolta verso l'alto. Aprire la linea di anestesia alla piattaforma chirurgica e chiudere la linea anestesia alla camera di induzione, in questo per evitare una pressione troppo alta nel sistema anestesia. Ridurre la concentrazione di isoflurano dal 4% al 2,5% in questo momento.
3. Controllare il ritiro riflesso pedale per confermare che l'animale è sufficientemente Anesthetized per la procedura chirurgica eseguendo un pizzico zampa. L'animale è adeguatamente anestetizzato se non reagisce (contrazione per esempio o arricciare la coda) per il pizzico zampa. Se l'animale reagisce al pinch zampa, aumentare la concentrazione di isoflurano.
4. Fissare le membra del mouse alla piattaforma chirurgico con nastro di laboratorio (½ "nastro funziona meglio per questo).
5. (Facoltativo) Una volta che l'animale è fissata alla piattaforma chirurgica, i capelli possono essere rimossi dalla superficie ventrale utilizzando un rasoio elettronico. Se depilazione chimica è preferito, questa deve essere eseguita 24-48 ore prima dell'intervento. Rimozione dei peli prima dell'intervento aiuta a prevenire la contaminazione del sito di imaging, come capelli randagi può indurre risposte immunitarie forti ed acute.
6. Disinfettare la superficie ventrale dell'animale con il 70% salviette isopropanolo e Betadine.
7. Utilizzando il primo paio di forbici sterili e pinze (con i denti), fare una ventrale incisione mediana sottocutaneache va da ~ 3 mm sopra l'uretra al processo xifoideo. Fare attenzione a non bucare o tagliare attraverso il peritoneo.
8. Utilizzando la seconda coppia di forbici o forcipi sterili (seghettato), staccare delicatamente la pelle, con la ghiandola inguinale mammaria collegato, dalla cavità peritoneale.
9. Prendere un vetrino per microscopio e posizionarlo contro il lembo cutaneo generato nel passaggio precedente. Posizionare il vetrino in modo che la massa del tumore siederà piatto una volta che il mouse viene posto sul piatto, e non interferisce con la mobilità degli arti posteriori.
10. Una volta che il vetrino è stata posizionata correttamente, collegare la diapositiva alla superficie esterna della pelle con colla (ad es., Krazy Glue).

10. Posizionando il mouse sullo stage

1. Rimuovere il nastro di laboratorio di fissaggio degli arti dell'animale alla piattaforma chirurgica.
2. Aprire la linea di anestesia alla fase microscopio e chiudere l'anestesiaSIA linea alla piattaforma chirurgica, in questo ordine.
3. Trasferisci velocemente l'animale sul palco microscopio.
4. Una volta che l'animale è stato trasferito, posizionare e fissare la linea anestesia e cono correttamente (utilizzando ad esempio nastro lab) per assicurare che il mouse rimane anestetizzata ed è in una posizione confortevole.
5. Esporre il tumore in modo che sia posizionato sopra e al centro di una delle coperte da vetro di copertura porte di imaging in fase microscopio.
6. Con gli oculari, verificare che il tumore è posizionato correttamente, e delicatamente nastro lungo il vetrino da microscopio. Il vetrino deve essere fissato liberamente così il flusso di sangue al tessuto non sia ostruito. Taping premuto il vetrino da microscopio aiuta a ridurre al minimo gli artefatti di imaging introdotti dalla respirazione degli animali.
7. Inserire la linea indwelling intraperitoneale con infusione a farfalla allegato insieme ad un 1-ml siringa contenente sterile 1x PBS o soluzione salina (eventualmente contenente un colorante come PI) preparata sotto # 5. Inject l'animale con 100 pl quando l'ip. linea è inserita. Da questo punto di tempo fino al termine della sessione di imaging, iniettare l'animale con 50 microlitri di soluzione salina a intervalli di 1 ora (o 25 microlitri di soluzione salina con PI ogni 30 min).
8. Per monitorare i segni vitali dell'animale, collegare una sonda ossimetro (per esempio sistema MouseOx da Starr Life Sciences, Inc.) ^19.
9. Coprire il mouse con una coperta di riscaldamento per prevenire l'ipotermia.

11. Acquisizione di immagini

Il software open source μManager (Vale Lab, UCSF) è utilizzato per acquisire time-lapse immagini. I dati grezzi è stata compilata in Imaris (Bitplane) software, e può essere ottenuto manualmente da osservatori indipendenti, o analizzati in entrambi i software di immagine Imaris o altre analisi (ad esempio Volocity [PerkinElmer] o ImageJ [NIH]).

12. Eutanasia

Alla fine della sessione dell'immagine (1-40 ore, a seconda del tipo di processo analizzato), l'animale è eutanasia.

1. La concentrazione di isofluorano è aumentata al 4%.
2. L'animale viene osservato fino 30 sec dopo lo afferra respirazione e quindi rimosso dal palco.
3. Dislocazione cervicale viene eseguita per garantire che l'animale è stato eutanasia.

13. Rappresentante dei risultati

Imaging intravitale utilizzando questo metodo consente la visualizzazione diretta di vari processi, tra cui la somministrazione di farmaci per i tumori, stravaso e distribuzione del farmaco una volta che raggiunge il tumore, la morte delle cellule dopo trattamento terapeutico, e tumore-stroma interazioni in risposta alla morte cellulare ^5. Per osservare l'arrivo di un farmaco per il tumore e la sua distribuzione in seguito stravaso nei tessuti tumorali, l'animale viene iniettata mentre le immagini vengono acquisite. Anche se diverse classi di chemotherapeutics sono debolmente fluorescente (come doxorubicina), molti non sono. Fluorescentemente destrani coniugati possono essere utilizzate come marcatori surrogati per il drug delivery e diffusione nei tessuti. Figura 2 e film 1 mostra l'arrivo di un fluoresceina isotiocianato (FITC)-coniugato 2 MD destrano (Invitrogen, 1 mg / ml 1xPBS) iniettata iv. in un tumore di MMTV-PyMT; ACTB-ECFP mouse.

Dopo l'arrivo del farmaco nel tumore, stravaso e diffusione attraverso i tessuti possono essere esposte per determinare sia il intravascolare emivita di un farmaco e farmaco distribuzione ^5. Film 2 mostra lo stravaso e distribuzione di Alexa Fluor-647-coniugato 10 kD destrano (Invitrogen, 1 mg / ml in 1 x PBS) iniettata iv. in un (1) C3-Tag; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP del mouse durante l'esposizione. Dopo la compilazione di filmati time-lapse in Imaris (Bitplane), intravascolare emivita di distribuzione e di droga è quantificato. Per misurare intravascolare emivita, L'intensità di fluorescenza media nei vasi sanguigni tumorali ad ogni tempo viene calcolato ed in funzione del tempo. Distribuzione del farmaco è quantificato come area per cento dell'area tumorale totale è positivo per il farmaco.

Oltre a monitorare la cinetica di rilascio di farmaci per i tumori, è spesso importante per determinare come i tumori rispondono alla terapia. Come terapie anticancro sono attesi per indurre la morte cellulare, ioduro di propidio (PI) colorazione o modifiche strutturali nucleari può essere usato come marcatore di farmaco-indotta morte cellulare ^5. Figura 3 mostra la risposta del tumore alla doxorubicina citotossico chemioterapico in MMTV -PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP mouse. In questo triplo transgenico MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animale, ECFP etichette al seno cellule tumorali (blu), e le etichette EGFP cellule mieloidi (verde). L'animale ripreso durante questa sessione è stata somministrata la doxorubicina 18 ore prima di imaging è iniziata e PI è stato consegnato ip tutto tegli sessione di imaging come descritto sopra. Le cellule tumorali (ACTB-ECFP etichettatura) appaiono come blu, e le cellule morte o morenti apparire come rosso (colorazione PI). Le serie storiche qui presentate mostra induzione di doxorubicina-dipendente morte cellulare nel corso del tempo. Per quantificare l'induzione della morte cellulare nei tumori, lo stesso tipo di analisi utilizzato per determinare la distribuzione di farmaci viene utilizzato, in cui l'uscita è quantitativa dell'area percentuale per area tumorale totale che è positivo per PI.

Imaging ad alto ingrandimento può fornire informazioni sul tipo di morte cellulare che le cellule tumorali subiscono ^5. Movie 3 mostra i risultati di un esperimento di imaging per rilevare le modifiche nucleari tipiche di morte cellulare per apoptosi in risposta alla terapia sistemica con doxorubicina. Per visualizzare i nuclei, l'animale ripreso durante questa sessione ospita il ACTB-H2B-EGFP giornalista al posto del c-fms-EGFP giornalista, quindi i nuclei delle cellule tumorali sono etichettati in verde. Questo MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ACTB-H2B-EGFP animale era administered doxorubicina (8 mg / kg in 1 x PBS) ip 24 ore prima dell'inizio del film, e ha ricevuto iniezioni orarie di 1 x PBS contenenti PI (Invitrogen, 1 mg / ml di soluzione diluita 1:15). I cambiamenti strutturali nei nuclei delle cellule tumorali può essere osservato in un cellulare per apoptosi accanto alle celle che hanno subito necrosi (PI-positive cellule che mostrano minimi cambiamenti nella morfologia nucleare). Nuclei delle cellule apoptotiche fine diventa rosso dovuto alla captazione di colorazione PI (non mostrato). Il numero di eventi di tessuto necrotico e apoptotico è quantificata manualmente per ogni punto di tempo sulla base di PI-positività e la morfologia nucleare.

Chemioterapia morte cellulare indotta da cancro spesso si traduce in un reclutamento reattiva di cellule immunitarie nei tumori ^2,4,5. Figura 4 mostra un esempio di questa reazione stromale al trattamento acuto con doxorubicina. Il MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; animale c-fms-EGFP ripreso qui è stato somministrato doxorubicina (8 mg / kg in 1 x PBS) ip . circa 20 ore prima dell'inizio di imaging, e ha ricevuto oraria PI ip iniezioni. per la durata dell'esperimento per visualizzare morte cellulare. I tempi indicati rappresentano il numero di ore dopo il trattamento doxorubicina, e la barra di scala rappresenta 100 pm. In questo esperimento, le cellule mieloidi infiltrarsi in aree di morte cellulare, come indicato dalle frecce bianche. Per quantificare infiltrazione mieloide cella in tumori dopo doxorubicina somministrazione, lo stesso tipo di analisi utilizzato per determinare la distribuzione di farmaci e la risposta del tumore alla chemioterapia viene utilizzato, se l'uscita quantitativa è un'area cento per area tumorale totale che è positivo per EGFP.

Oltre a visualizzare la risposta complessiva stromale alla chemioterapia, specializzati risposte stromali possono anche essere visualizzati ^5. Film 4 mostra la fagocitosi di materiale cellulare necrotico da una cellula vicina. Il materiale rosso nucleare può essere visto essere ingerito da una cella con una large nucleo intatto verde, che è tipica dei macrofagi. Il MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; ACTB-H2B-EGFP animale ripreso durante questa sessione è stato somministrato doxorubicina (8 mg / kg in 1 x PBS) ip. 24 ore prima dell'inizio del film. L'animale ha ricevuto iniezioni orarie di 1 x PBS contenente PI (Invitrogen, 1 mg / ml di soluzione diluita 1:15). Nuclei (ACTB-EGFP etichettatura) appaiono come verde, ma diventa rosso come cella subiscono necrosi.

Figura 1. Etichettatura del campione delle diverse componenti tumorali utilizzando etichette transgenici e iniettabili Si tratta di un triplo transgenico MMTV-PyMT,. ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animale in cui sono etichettati cellule tumorali in blu attraverso l'espressione di ECFP e cellule mieloidi sono etichettati in verde attraverso l'espressione di EGFP da un mieloide-specifico promotore. L'animale è stato iniettato con ioduro di propidio (PI, rosso, ~ 0,07 mg / ml in PBS 1X) durantela sessione di imaging per visualizzare morte cellulare. PI etichette del DNA, ma attraversa solo le membrane cellulari delle cellule morte o morenti. Barra di scala = 100 micron.

Figura 2. Stravaso farmaco e distribuzione nei tumori Questo doppio transgenico MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP animale in cui sono etichettati cellule tumorali in blu attraverso espressione di ECFP stato iniettato con FITC-coniugato 2 MD destrano (verde) durante la sessione di imaging per visualizzare come farmaci raggiungere i tumori dopo iniezione iv (blu). Tempo dopo l'imaging è stato avviato è indicato. Barra di scala = 100 micron.

Figura 3. Cancro risposta cellulare alla terapia sistemica. Un MMTV-PyMT; ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animali trattati con il chemioterapicodoxorubicina farmaco prima imaging, e iniettati con PI (rosso, ~ 0,07 mg / ml in PBS 1X) per etichettare morte cellulare. Questa serie immagine mostra l'accumulo di colorazione PI nel tempo (come indicato dalle frecce bianche), che rappresenta il trattamento di induzione di morte cellulare doxorubicina seguente. Tempo indicato è il tempo dopo il trattamento con doxorubicina. Le immagini sono proiezioni di massima intensità di un z-stack contenenti tre immagini nella z. Barra di scala = 100 micron.

Figura 4. Risposta delle cellule mieloide alla chemioterapia in un MMTV-PyMT; ACTB-ECFP,. C-fms-EGFP tripla di topo transgenico somministrata doxorubicina 20 ore prima di imaging L'animale ha ricevuto ip oraria. iniezioni di PI (rosso, ~ 0,07 mg / ml in PBS 1x) per marcare le cellule morte. Questa serie immagine mostra l'accumulo di EGFP-positive cellule mieloidi (come indicato dalle frecce bianche) nel tempo a seguito doxorubicin trattamento. Questa risposta immunitaria reattiva ha dimostrato di impedire risposta terapeutica a diverse classi di chemioterapie ^4,5. Tempo indicato è il tempo dopo il trattamento con doxorubicina. Le immagini sono proiezioni di massima intensità di un z-stack contenenti tre immagini nella z. Barra di scala = 100 micron.

Movie 1. . Consegna della droga in un tumore Questa è un'arma a doppio transgenico MMTV-PyMT; ACTB-ECFP animale in cui sono etichettati in blu le cellule tumorali attraverso l'espressione di ECFP. L'animale è stato iniettato un MD 2 FITC-destrano coniugato (verde) durante la sessione di imaging per visualizzare come farmaci raggiungere i tumori dopo iniezione iv. Barra di scala = 100 micron. Clicca qui per visualizzare filmati .

Movie 2. Infiltrazione della droga nel tessuto tumorale Un triplo transgenico C3 (1)-Tag,. ACTB-ECFP, c-fms-EGFP animale in cui le cellule tumorali sono laBeled in blu attraverso l'espressione di ECFP e cellule mieloidi etichettati in verde attraverso l'espressione di EGFP è stato iniettato iv con Alexa Fluor 647-coniugato 10 kD destrano (rosso). Il campo visivo viene visualizzata immediatamente dopo l'iniezione con destrano. Il destrano etichetta inizialmente il sistema vascolare, extravasates rapidamente nel tessuto tumorale, e viene infine ripreso da macrofagi. Barra di scala = 100 micron. Clicca qui per visualizzare filmati .

Movie 3. Imaging dei cambiamenti nucleari dopo la chemioterapia morte cellulare indotta da questo triplice transgenici MMTV-PyMT;. ACTB-ECFP; H2B-EGFP animale è stato iniettato con doxorubicina prima di imaging. Morfologia nucleare (verde), come monitorato mediante espressione di un H2B-EGFP proteina di fusione, permette la visualizzazione diretta dei cambiamenti nucleari indotta da chemioterapia strutturali tipiche dell'apoptosi come visto per la cella in alto a destra. L'animale received mezz'ora ip. iniezioni di PI (rosso) per la durata della sessione di imaging per marcare le cellule morte e morenti. Ora è giunto il momento indicato dopo il trattamento con doxorubicina 24 ore. Le immagini sono state acquisite con un alto obiettivo da ingrandimento (40x, NA 1.1, lente di acqua). Barra di scala = 15 micron. Clicca qui per visualizzare filmati .

Movie 4. Imaging dei cambiamenti nucleari e l'assorbimento di materiale cellula morta dopo la chemioterapia morte cellulare indotta da questo triplo transgenico MMTV-PyMT,. ACTB-ECFP; H2B-EGFP animale è stato iniettato con doxorubicina prima di imaging. Morfologia nucleare (verde), come monitorato mediante espressione di un H2B-EGFP proteina di fusione, permette la visualizzazione diretta dei cambiamenti nucleari indotta da chemioterapia strutturali. L'animale ha ricevuto mezz'ora ip. iniezioni di PI (rosso) per la durata della sessione di imaging per marcare le cellule morte e morenti. Le immagini sono state acquisitecon un alto ingrandimento lente obiettivo (40 x, ​​NA 1.1, lente acqua). La mancanza di grandi cambiamenti strutturali prima dell'etichettatura con PI e il cambiamento della morfologia nucleare e la perdita di segnale GFP è indicativo di necrosi simile morte cellulare. Il materiale morto è visto essere occupato da una cellula con un nucleo grande, che è tipica dei macrofagi. Ora è giunto il momento indicato dopo il trattamento con doxorubicina 24 ore. Barra di scala = 10 micron. Clicca qui per visualizzare filmati .

Discussione

Le risposte dei tumori a terapie sistemiche in vivo può essere notevolmente diverse da quelle delle cellule tumorali in vitro, come il microambiente influenza sia la risposta acuta e ricaduta ^5. Uno dei maggiori ostacoli alla esplicitazione nei percorsi di chemioresistenza in vivo è la complessità delle interazioni tra cellule tumorali e il loro micro. In particolare, poiché tumori solidi hanno sviluppato un equilibrio tra cancro e cellule stromali, perturbazioni di un componente, come la morte cellulare che si verifica durante il trattamento antitumorale, può provocare effetti drammatici sulla organizzazione dei tessuti.

La tecnica di imaging intravitale qui fornite permette la visualizzazione diretta del cancro cellula-stroma interazioni all'interno dei tumori di topi anestetizzati dal vivo, durante il trattamento con farmaci anti-cancro. Usiamo microscopia confocale disco rotante, che ha una profondità relativa penetrazione limitata (v. ¹⁷ ), ma le tecniche chirurgiche ed etichettatura può essere utilizzato con altri tipi di microscopia. Filmati acquisiti da questi esperimenti possono essere utilizzati per monitorare i processi che includono cambiamenti di intensità di fluorescenza (ad esempio a causa di infiltrazioni di una popolazione etichettati o induzione della morte cellulare), la motilità cellulare, distribuzione di iniettabili (ad esempio per monitorare perdita vascolare), e co- localizzazione di segnali fluorescenti ^5,12,17,20.

Noi di routine topi di immagine per più di 6 ore e di imaging eseguita anche per oltre 18 ore. Ciò richiede mantenendo i topi continuamente sotto anestesia per questi periodi di tempo lunghi. Con l'anestesia adeguata, oltre il 90% dei nostri animali sopravvivono 6 ore, e circa l'80% sopravvive più di 18 ore. I dettagli su come eseguire a lungo termine anestesia sono stati pubblicati in precedenza ^19. Nella nostra esperienza, cinque fattori sono fondamentali: evitare l'ipotermia, evitare la disidratazione, mantenendo fisiologiche nel sangue i livelli di saturazione di ossigeno, ucantare gas umidificato vettore per isoflurano, e mantenere gli animali al più basso livello di anestesia in cui essi non mostrano segni di dolore. Per mantenere la temperatura corporea, teniamo topi sotto una coperta riscaldata (a 38 ° C). Per evitare la disidratazione, si iniettano piccole quantità di soluzione salina ip durante tutta la procedura di imaging intero. Per mantenere fisiologici livelli di saturazione dell'ossigeno nel sangue, si parte con il 21% di ossigeno nel gas di trasporto (piuttosto che il comunemente usato 100%). Questo ci permette di aumentare i livelli di ossigeno per via inalatoria se un topo - ore in un esperimento - mostra una diminuzione della saturazione di ossigeno nel sangue. Nella nostra esperienza, aumentare i livelli di ossigeno per via inalatoria in quel momento (ad esempio, per il 30-40%), quasi sempre si stabilizzerà l'animale consentendo ore di immagini aggiuntive. Il livello ottimale di anestesia è per la maggior parte dei mouse conseguiti con 1-1,5% isoflurano e si traduce in tassi di 60-65/min respiro e pulsazioni di 400-450/min. Nei nostri esperimenti di imaging, si utilizzano principalmente modello di topo transgenicos (MMTV-PyMT e C3 [1]-Tag) in cui i tumori sono multifocali, consentendo l'imaging di lesioni multiple in diverse fasi della progressione tumorale in parallelo alle posizioni x, y multipli durante una sessione di imaging. Questo diminuisce preoccupazioni riguardanti mouse-a-mouse variazione rispetto a esperimenti volti a identificare risposte terapeutiche stadio-dipendenti, e riduce il numero di animali necessari per l'imaging.

Il MMTV-PyMT modello (e di altri modelli di cancro spontanee) passare attraverso stadi progressivi istopatologici che possono essere rilevate durante l'esposizione intravitale, anche se la messa in scena patologica delle lesioni tumorali che si possono fare durante l'esposizione intravitale è diverso e meno dettagliata, di quella di sezioni istologiche ^5,17. Al contrario, i modelli di trapianto tendono a riflettere i tumori in fase avanzata meglio, come le cellule tumorali in genere sono isolati da tumori avanzati. Tali modelli sono quindi più suscettibili allo studio del tumore-stromainterazioni di tumori in fase avanzata che differenze in queste interazioni tra diverse fasi.

Mostriamo alcuni esempi di come immagine cambia nucleari strutturali che si verificano dopo la morte cellulare indotta dalla terapia. In assenza di un trattamento anti-cancro, questa strategia etichettatura può invece essere utilizzata per la divisione cellulare immagine in situ, chiarire, ad esempio, come la proliferazione cellulare e dormienza è influenzata dal microambiente. In futuro, marcatura fluorescente di componenti mitocondriali possono consentire di immagine cambia mitocondriali che si verificano durante la morte cellulare per apoptosi.

In questo protocollo, abbiamo anche mostrato esempi di come immagine del cancro delle cellule immuni interazioni delle cellule dopo la terapia, ma altri componenti microambientali possono anche essere visualizzati e creata l'immagine. Esistenti linee giornalista transgeniche per i componenti stromali includono quelli per i fibroblasti (ad es., FSP1-EGFP ^17, αSMA-RFP ^21, COL1A1-EGFP ²¹⁾ o cellule del sistema vascolare (es. Tie2-GFP ^22; VEGF-GFP ^23).

Intravitale imaging consente la visualizzazione in tempo reale delle interazioni e processi che avvengono in vivo somministrazione di chemioterapia seguente. Con la tecnologia attualmente disponibile, abbiamo fatto importanti progressi nella comprensione di come cellule mieloidi influenzare la risposta terapeutica, tuttavia, perché il microambiente tumorale è così complesso, grandi progressi sono ancora necessari per iniziare a scavare meccanicamente nei processi sottostanti ambiente-mediata resistenza ai farmaci. Uno dei progressi più importanti ancora richiesti è l'identificazione di migliori marcatori per specifiche popolazioni cellulari. L'importanza di migliori marcatori è ben illustrato con due dei componenti più importanti cellule stromali del microambiente tumorale mammario, fibroblasti e cellule immunitarie. α-muscolo liscio actina (αSMA) viene spesso utilizzato per identificarefibroblasti, ma la proteina è espressa da cellule muscolari lisce vascolari e cellule mioepiteliali ^24. Così, anche se αSMA-GFP topi reporter esiste, determinare il tipo specifico di essere cellula seguente durante un esperimento di imaging intravitale è impegnativo. Analogamente, un singolo marcatore fluorescente come EGFP espresso sotto il c-fms promotore più spesso identificare sottopopolazioni di cellule immunitarie ^12,17. Così, anche se uno vorrebbe idealmente utilizzare un singolo marcatore per identificare un tipo specifico cellulare la complessità della biologia sottostante rappresenta una sfida importante nell'utilizzo questo approccio.

Una parziale soluzione a questo problema è di utilizzare etichette iniettabili per differenziare ulteriormente sottopopolazioni di cellule che esprimono il reporter fluorescente stessa. Per esempio, destrani fluorescenti sono ripreso da macrofagi e può essere usato per etichettare le sottopopolazioni di macrofagi che sono etichettati da c-fms-EGFP e Fsp1-EGFP topi reporter transgenici ^{17. Anticorpi coniugati a sonde fluorescenti sono stati utilizzati per identificare le sottopopolazioni specifiche (ad esempio il Gr1-positivo popolazione di cellule mieloidi etichettati da c-fms-EGFP giornalista 17).}

A differenza di curve di risposta del tumore generati dal calibro di misura, che forniscono poche informazioni sui meccanismi su come e perché i tumori rispondono alla terapia somministrata, o una serie istologico derivati ​​da tessuti raccolte in diversi momenti che richiedono grandi coorti di animali, la nostra tecnica fornisce diretta, informazioni quantificabili sulla dinamica della morte cellulare e le interazioni di cellule stromali con cellule tumorali in coorti piccole. Così, il vantaggio di utilizzare la procedura riportata qui è che fornisce informazioni dinamiche sulle risposte farmacologiche nel contesto di un microambiente tumorale intatta in tempo reale. Tali informazioni possono portare a intuizioni importanti nei processi di fondo che guidano le risposte terapeutiche ^{5 <}/ Sup>.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
			Reagente
MMTV-PyMT topi	Jackson Laboratory	2374
C3 (1) Tag-topi	Jackson Laboratory	13591
ACTB-ECFP topi	Jackson Laboratory	3773
ACTB-H2B-EGFP topi	Jackson Laboratory	5418
1 x PBS	Made in-house
2 MD Destrano, fluoresceina coniugato	Invitrogen	D-7137	Ricostituire in dH 2 O (4 mg / ml, conservare a -20 ° C), diluire a 1 mg / ml in 1 x PBS
10 kD destrano, Alexa Fluor 647-coniugato	Invitrogen	D-22.914	Ricostituire in dH 2 O (4 mg / ml, conservare a -20 ° C), diluire a 1 mg / ml in 1 x PBS
Doxorubicina cloridrato	Sigma-Aldrich	44583	Ricostituire in dH 2 O e conservare a 4 ° C; diluire in 1 x PBS
Isothesia (isoflurano)	Butler Animal Health di alimentazione	029450	250 ml
Propidio ioduro	Invitrogen	P3566	1 mg / ml, diluito 1:15 in 1 x PBS
Azoto
Ossigeno
			Attrezzatura
18G x 1 ½ "ago smussatura regolare	BD	305196
μManager	Vale Lab, UCSF	www.micro-manager.org	Software open-source
Tampone imbevuto di alcool	BD	326895	70% di alcol isopropilico tamponi
Anestesia sistema	Imaging Products molecolari, Co.
Copertura in vetro	Corning	2940-245	No. 1 ½, 24x50 mm, disinfettare con il 70% salviette isopropanolo
Rezza spugne garza (sterile)	Kendall	6939
Vetro microscopio diapositive	Corning	2948-75x25	Pre-pulite, se non pre-lavaggio, disinfettare con il 70% salviette isopropanolo
Temprati forbici sottili	Strumenti Scienza Belle	14090-11	2 coppie, in acciaio inossidabile, forte affilati come punte, punta diritta, 26 tagliente mm, 11 cm di lunghezza
Coperta riscaldata	Gaymar Industries
Hot tallone sterilizzatore	Strumenti Scienza Belle	18000-45	Attivare circa 30 minuti prima dell'uso; sterilizzare strumenti a> 200 ° C per 30 sec
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Krazy Glue	Prodotti di Elmer	KG484
Laboratorio nastro (½ ")
Laboratorio nastro (1 ")
Coperchio diuna spedizione polistirolo raffreddamento			Questo sarà utilizzato come piattaforma chirurgica
Micro dissettore	Roboz	RS-5153	1x2 denti, una leggera curva, 0,8 mm di larghezza, punta 4 "lunghezza
Micro dissettore	Roboz	RS-5135	Dentata, leggera curva, 0.8 larghezza punta mm 4 "lunghezza
Microscopio			Spinning-disco confocale, XYZ fase Piezo, capablility epifluourescence 17,25
Microscopio fase di inserimento	Applicata strumentazione scientifica		Personalizzato fabbricato, con due porte di imaging circolari
MouseOx ossimetro, software e sensori	STARR Life Sciences	www.starrlifesciences.com
Nalgene Versi Super-Dry lab inzuppatori	Thermo Scientific	74218-00	Tagliare in quarti per il rivestimento piattaforma chirurgica
Nebulizzatore	Salter Labs	8901	Utilizzato per umidificare i gas, previene le irritazioni dei tessuti polmonari
Slip-siringa monouso tubercolina (1 ml)	BD	309659
Surflo alato set d'infusione	Terumo	SV-23BLK	X 23G ¾ "ultra sottile ago, 12" tubo
Betadine Spray	Purdue Pharma	BASP3H