Ex Vivo Blood Red emolisi test cellulare per la valutazione degli agenti Endosomolytic pH-sensibile per la consegna dei farmaci citosolico Biomacromolecular

Sommario

Un saggio di emolisi può essere usato come un rapido, ad alta resa di schermo citocompatibilità sistemi di rilascio di farmaci e l'attività endosomolytic per la consegna del carico intracellulare. Il saggio misura la rottura di membrane eritrocitarie in funzione del pH.

Abstract

Doppi strati di fosfolipidi che costituiscono endo-lisosomiale vescicole possono rappresentare un ostacolo alla consegna di farmaci biologici a bersagli intracellulari. Per superare questo ostacolo, una serie di trasportatori di farmaci sintetici sono stati progettati per interrompere attivamente la membrana endosomiale e consegnare cargo nel citoplasma. Qui, descriviamo il saggio emolisi, che può essere usato come un rapido, ad alta resa per la schermata citocompatibilità e attività endosomolytic dei sistemi intracellulari drug delivery.

Nel saggio emolisi, globuli rossi umani e materiali di prova sono co-incubate in tampone a pH definiti che imitano extracellulari, endosomali precoce e tardiva endo-lisosomiali ambienti. A seguito di una fase di centrifugazione a pellet intatti cellule rosse del sangue, la quantità di emoglobina rilasciata nel terreno viene misurata spettrofotometricamente (405 nm per migliore dinamica). Il rosso per cento rottura delle cellule del sangue viene poi quantificato rispetto al controllo positivo samples lisate con un detergente. In questo sistema modello la membrana eritrocitaria funge da surrogato per la membrana lipidica a due strati che racchiudono endo-lisosomiale vescicole. Il risultato desiderato è emolisi trascurabile a pH fisiologico (7,4) ed emolisi robusta in endo-lisosomiale intervallo di pH da circa pH 5-6,8.

Introduzione

Sebbene vi siano molti potenziali obiettivi terapeutici impatto elevato all'interno della cellula, la consegna intracellulare di agenti rappresenta una sfida significativa. Spesso, i farmaci biologici, in particolare, vengono internalizzati dalle cellule e trafficata in vescicole che o portare al degrado del loro contenuto tramite l'endo-lisosomiale via, o vengono trasportati indietro fuori dalla cellula tramite esocitosi. ¹ In quest'ultimo processo, il pH interno delle vescicole viene acidificata a circa 5-6, che è il pH ottimale per l'attività di enzimi che funzionano in questo vano, ad esempio il lisozima. ²

Protocollo

1. Preparazione e sterilizzazione di buffer e agenti di test

1. 150 mM NaCl tampone: sciogliere 4,383 g di cristalli di NaCl in 500 ml di acqua Nanopure.
2. Buffer pH: Preparare tamponi fosfato a pH 5.6, 6.2, 6.8, e 7.4 mescolando quantità appropriate di monobasico e sodio fosfato bibasico. Se i campioni devono essere sottoposti a valori di pH più bassi (pH <5.6) poi un buffer più appropriato, come il tampone citrato, dovrebbe essere usato. Ricette del buffer sono facilmente disponibili, e un esempio di riferimento è stato fornito qui ^12.
3. Sterilizzare tutti i buffer notato in precedenza attraverso una bottiglia-top gli asp....

Risultati

In genere, gli agenti che presentano ideale pH-dipendente comportamento emolitica hanno il più alto potenziale per la consegna citosolico di farmaci, acidi nucleici, o altre molecole bioattive. Questo è esemplificato da Agent # 1 come rappresentato in figura 2, che presenta emolisi minima a pH 7,4, ma un forte aumento comportamento emolitica a intervalli di pH endosomiali (<6,5). Alcuni agenti possono esibire livelli significativi di comportamento emolitica a intervalli di pH fisiologici (Agent.......

Discussione

pH-sensibili polimeri o altri agenti destinati endosomolytic funzione può essere rapidamente ed efficacemente proiettato sulla base di lisi dei globuli rossi a pH incontrate in endosomi (Figura 1; pH 6,8 - endosoma precoce, pH 6,2 - endosoma tardi, pH 5,6 - lisosoma). ^14-17 pH-dipendente emolisi è stato utilizzato per schermare la capacità dei vettori di mediare endosomal rilascio di peptidi terapeutici biomacromolecular (ad esempio, siRNA, ODN, proteine), ed i risultati di questa an.......

Materiali

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubi	Fisher Scientific	22-253-145	Per la raccolta del sangue
BD Vacutainer sangue aghi di raccolta, 20,5 scartamento	Fisher Scientific	02-665-31	Per la raccolta del sangue
BD Vacutainer tubo porta / ago Adattatore	Fisher Scientific	22-289-953	Per la raccolta del sangue
BD Marca isopropilico tamponi imbevuti di alcool	Fisher Scientific	13-680-63	Per la raccolta del sangue
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	Per la raccolta del sangue
Acido cloridrico (conc.)	Fisher Scientific	A144-500	Per la regolazione del pH del D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Controllo positivo
Dulbecco PBS	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 sterile monouso Bottle-Top Unità Filtro con membrana SFCA	Fisher Scientific	09-740-44A
BD piastre a 96 pozzetti, a fondo piatto, di coltura trattata con polistirolo	Fisher Scientific	08-772-2C	Per piastra di lettura al termine del saggio.
BD piastre a 96 pozzetti, fondo tondo, di coltura trattata con polistirolo	Fisher Scientific	08-772-17	Per incubazione di globuli rossi con agenti sperimentali.