Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l'analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Sommario

Un protocollo per l'analisi delle nanoparticelle di monitoraggio (NTA) e high-throughput citometria a flusso per valutare nanoparticelle polimeriche consegna del gene è descritto. NTA è utilizzato per caratterizzare la distribuzione delle particelle nanoparticelle dimensioni e la distribuzione delle particelle per plasmide. High-throughput citometria a flusso consente quantitativa valutazione di efficacia di trasfezione per una libreria di biomateriali di consegna del gene.

Abstract

Non virale trasferimento genico utilizzando nanoparticelle polimeriche è emerso come un approccio interessante per la terapia genica per trattare malattie genetiche ¹ e come una tecnologia per la medicina rigenerativa ^2. A differenza dei virus, che hanno notevoli problemi di sicurezza, nanoparticelle polimeriche possono essere progettati per essere non tossico, non immunogenica, non mutagena, più facile da sintetizzare chimicamente versatile, in grado di trasportare più carichi di acido nucleico e biodegradabili e / o l'ambiente reattivo. Polimeri cationici auto-assemblano con DNA carico negativamente tramite interazione elettrostatica per formare complessi dell'ordine di 100 nm, che sono comunemente denominate nanoparticelle polimeriche. Esempi di biomateriali utilizzati per formare nanoscala policationici nanoparticelle di consegna del gene includono polilisina, polyphosphoesters, poli (amidoamines) s e polietilenimmina (PEI), che è un non-degradabile off-the-shelf polimero cationico comunemente utilizzato per la consegna di acido nucleico ^1,3. Poli (beta-amminoestere) s (PBAEs) sono una nuova classe di polimeri cationici ⁴ che sono idroliticamente degradabili ^5,6 e hanno dimostrato di essere efficace nel gene delivery a hard-trasfezione tipi cellulari quali cellule endoteliali retiniche (HRECs) ^7, topo cellule epiteliali mammarie ^8, cervello umano cellule tumorali ⁹ e macrovascolari (vena ombelicale umana, HUVEC), cellule endoteliali ^10.

Un nuovo protocollo per caratterizzare nanoparticelle polimeriche che utilizzano l'analisi delle nanoparticelle di monitoraggio (NTA) è descritto. In questo approccio, sia la distribuzione della dimensione delle particelle e la distribuzione del numero di plasmidi per particella si ottengono ^11. Inoltre, un elevato throughput a 96 pozzetti per saggio di transfezione piastra screening rapido dell'efficacia trasfezione di nanoparticelle polimeriche è presentato. In questo protocollo, poli (beta-ammino estere) s (PBAEs) sono usati come modello polimeri e cellule retiniche umane endoteliali (HRECs) sono usati come modEL cellule umane. Questo protocollo può essere facilmente adattato per valutare qualsiasi nanoparticella polimerica e qualsiasi tipo di cellule in un multi-pozzetto formato lastra.

Introduzione

La determinazione del numero di plasmidi complessati per nanoparticelle è importante progettare nanoparticelle efficaci strategie basate consegna del gene, in particolare per co-fornitura di plasmidi multipli al bersaglio stessa cella, come spesso è richiesto in cellule staminali riprogrammazione studi ^12. Alcuni approcci per calcolare il numero di plasmidi associati a una singola nanoparticella sono stati descritti, e ogni approccio ha degli inconvenienti nelle tecniche utilizzate per la stima ^13-16. Quantum dot (QD) etichettatura combinata con TEM è stato utilizzato per stimare plasmidi per particella in chitosano base di nanoparticelle. Stima con questa tecnica QD è complicato a causa della necessità di etichettare il DNA, che potrebbero alterarne le proprietà auto-assemblaggio, la possibilità che incapsulato DNA non marcato non è direttamente rilevato; plasmidi potenzialmente sovrapposti e QDs nelle immagini TEM 2D di particelle, e altre ipotesi semplificatrici ^13. Un approccio alternativo, che è unApplicabile quando microdomini ordinati esistono in particelle è stato utilizzato per studiare Lipopolyamine-DNA mediante crio-microscopia elettronica a trasmissione (crio-TEM), X-ray scattering e light scattering dinamico (DLS) ^14,15. Purtroppo, materiali come le nanoparticelle polimeriche esaminati qui non sono applicabili in questo metodo. . In un altro studio, Collins et al utilizzata una particella flusso tecnica di analisi di immagine per studiare (Lys) _16-peptide contenente / DNA, tuttavia, il metodo può valutare, grandi dimensioni micron particelle ^16. Così, abbiamo recentemente messo a punto un nuovo metodo di analisi e flessibile per quantificare il numero di plasmidi nanoparticelle per ^11.

Protocollo

1. Semina cellulare

1. Non consentono alle cellule di crescere fino a overconfluency. Utilizzare le cellule di passaggio in anticipo in cui trasfezione delle cellule primarie.
2. Ventiquattro ore prima della trasfezione, le cellule Tripsinizzare, contare le cellule utilizzando un emocitometro, e diluire la sospensione cellulare con supporti per ottenere la densità cellulare desiderata (cellule / volume). Cellule nel tessuto semi trasparente cultura trattata con fondo piatto da 96 pozzetti con un serbatoio e pipette multicanale. La densità scelto dovrebbe dare 70-80% di confluenza del giorno di trasfezione. Ad esempio, come mostrato nella Tabella 1, le cellule sono state diluite da 25 a 50 cellule / mL per i dati riportati qui di trasfezione.

2. Cella Transfection

1. Diluizione di polimero e delle scorte del DNA. Scongelare polimero e soluzioni madri DNA a temperatura ambiente (RT). Diluire soluzione di polimero e stock soluzione di DNA, separatamente in chiaro piastre a 96 pozzetti utilizzando una pipetta di dodici canali, Con il solvente appropriato concentrazioni necessarie per ottenere il peso di polimero desiderato rapporto peso DNA (peso / peso). In questo caso, il solvente è scelto di sodio 25 mM tampone acetato (pH = 5,2).
   1. DNA diluizione. Tipicamente, DNA conservati a 1 mg / ml è diluito in tampone di acetato di sodio ad una concentrazione da 0,03 a 0,06 mg / ml in un chiaro non-tessuto cultura-trattati piastra a 96 pozzetti (un pozzetto per una singola formulazione). Tabella 2 mostra il tipico protocollo di diluizione DNA per una singola formulazione usato per trasfettare quattro pozzi replicati in una piastra a 96 pozzetti seminati con cellule del punto 1.
   2. Polimero di diluizione. La 100 mg / ml di polimero / DMSO soluzione viene diluita in tampone sodio acetato in funzione della concentrazione necessaria per ottenere il polimero di DNA desiderato peso / peso rapporto. La gamma di peso / peso rapporti tipicamente utilizzati per il trasferimento genico con poli (beta-ammino estere) s (PBAEs) è di 20 a 100. Polimeri PBAE vengono prima diluito a 10 mg / ml, seguito dalla diluizioneROTOCOLLO come mostrato nella Tabella 3. Le diluizioni polimero può essere eseguita in un chiaro non-trattati coltura tissutale a 96 pozzetti che corrisponde all'orientamento campione della piastra di diluizione DNA.
2. Nanoparticelle formazione. Aggiungere la soluzione PBAE ad un volume uguale di soluzione di DNA plasmidico utilizzando un dodici canali pipetta e mescolare energicamente. Lasciate che la miscela incubare a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire l'auto-assemblaggio.
3. Nanoparticelle trasfezione. Seguendo autoassemblaggio, 20 pl nanoparticelle sono aggiunti per pozzetto al mezzo di coltura a gocce utilizzando il dodici canali pipetta. Replica pozzi sono lasciati non trattati o sono trasfettate con i reagenti disponibili in commercio come controlli. Le cellule trasfettate sono incubate a 37 ° C per 2-4 ore e poi i pozzetti vengono sostituiti con mezzi freschi (100 pl / pozzetto). La scelta del tempo di incubazione dipende dalla linea cellulare, condizioni di coltura, e il sistema di transfezione. La differenza di trasfezioneefficienza e tossicità cellulare a causa del periodo di incubazione variabile sarà quantificato mediante il protocollo di analisi descritto nel passaggio 3.

3. Analisi di efficienza di trasfezione e tossicità cellulare

Efficienza di trasfezione è analizzato visivamente con un microscopio a fluorescenza e quantificato utilizzando un citofluorimetro 48 ore dopo la trasfezione. Tossicità cellulare viene analizzato visivamente con un microscopio a fluorescenza e quantificato utilizzando la CellTiter 96 acquosa Un dosaggio 24 ore dopo la trasfezione.

1. Microscopia a fluorescenza. Analizzare visivamente i pozzetti per l'espressione del gene reporter transfettate (per esempio, EGFP o DsRed) utilizzando il canale appropriato fluorescenza. Acquisire immagini per ogni pozzetto, scegliendo campi di vista che rappresentano adeguatamente l'efficienza di trasfezione per le formulazioni particolari (Figura 1). Prendere nota di qualsiasi tossicità cellulare osservata visivamente.
2. Citometria a flusso.
   1. Utilizzare pipette multicanale per preparare la piastra a 96 pozzetti per la citometria a flusso. Lavare con PBS, Tripsinizzare con 30 pl / pozzetto di tripsina / EDTA, neutralizzare con 170 microlitri tampone FACS (PBS + 2% FBS), pipetta su e giù in ciascun pozzetto, anche intorno ai bordi, e trasferire l'intero 200 microlitri volume ciascun pozzetto in pozzetti in un pallone a fondo o V-bottom piastra a 96 pozzetti.
   2. Centrifugare la piastra a 130 xg per 5 minuti a 4 ° C.
   3. Rimuovere supporti 170 ul cellule da ogni bene e pipetta per risospendere evitando bolle. Per utilizzare una vitalità macchia come ioduro di propidio (PI), aggiungere 10 ml di FACS tampone + PI (50:1 FACS buffer: PI di diluizione, la concentrazione magazzino PI 1 mg / ml) in ciascun pozzetto. Porre immediatamente sul ghiaccio e coprire dalla luce.
   4. Avviare il flusso C6 Accuri citometro, il HyperCyt 96 pozzetti attaccamento, e il software HyperView. Utilizzare Progettazione HyperView e le schede del protocollo di scegliere il p appropriataTipo di ritardo, il layout piastra, e le altre impostazioni, come shake / SIP / risciacquo / agitare tempo. Per il protocollo di cui sopra, i seguenti parametri sono stati usati, un pre-piastra prime per un minuto, e una pre-piastra agitare per 30 secondi a 2400 rpm. Tempo Sip è stato fissato per 15 sec a 15 giri al minuto, una sonda di risciacquo ogni bene per 2 secondi, e un inter-e agitare ogni 12 pozzi per 12 secondi a 2.400 giri al minuto. L'inter-shake pozzo è importante per mantenere le cellule disperse nei media, nonché per migliorare la capacità di elaborare i dati includendo pause temporizzati tra gruppi di pozzetti (in questo caso 12 sec).
   5. Utilizzare la scheda di identificazione Beh HyperView per elaborare i dati e separati nel bene appropriato (Figura 2). Al fine di identificare i singoli pozzetti, può aiutare a utilizzare il filtro del rumore del software, così come tra una base anche filtro sotto le impostazioni avanzate.
   6. Quantificare la percentuale di cellule vive positivamente trasfettate con gating opportuno separare pop diversomentari (Figura 3). In primo luogo visualizzare i dati di flusso su un grafico a dispersione FSC e SSC, al fine di separare le cellule dai detriti (Figura 3A). Se ioduro di propidio (PI) è stato utilizzato, porta la popolazione di cellule individuale e vista che i dati su un terreno FSC vs FL3 in modo da separare le cellule vive da cellule morte e gate di cellule vive. Al fine di quantificare il numero di cellule trasfettate, vedi la popolazione cellulare diretta sui canali appropriati, per esempio, GFP può essere visto in FL1. Utilizzando la popolazione non trattata, porta le cellule non trattate per identificare il segnale di fondo (Figura 3B). Le cellule trasfettate positivamente può quindi essere isolato utilizzando questo cancello e visualizzando le popolazioni trasfettate utilizzando sia dispersione e grafici di contorno (Figura 3C e 3D). Ci può essere un continuum di cellule trasfettate positivamente, come cellule diverse saranno transfettate a diversi gradi di fluorescenza.
3. CellTiter 96 acquosa Un saggio
   1. Transfettare un'altra piastra esattamente nello stesso modo per misurazioni tossicità cellulare.
   2. Premix 1 ml di CellTiter 96 Una soluzione acquosa di test con 10 ml supporti freschi. Rimuovere i supporti dalle cellule e utilizzare una pipetta multicanale aggiungere 110 microlitri della soluzione premiscelata + supporto per pozzetto.
   3. Misurare l'assorbanza a 490 nm ogni intervallo ore 1-4 ore finché la assorbanza dal pozzo con condizione non trattata è nel range lineare del saggio. Include quattro pozzi di controllo con i media solo + soluzione per una lettura assorbanza di fondo.
   4. Valori medi l'assorbanza delle quattro pozzi replicati per condizione e sottrarre l'assorbanza di fondo media da ogni media. Normalizza la media corretta per ogni condizione trattata alla media corretta della condizione non trattata per determinare la vitalità cellulare per cento.

_title "> 4. nanoparticelle Sizing con NTA e plasmidi Calcoli particella per

1. Primo il sistema fluidica del NS500 NanoSight eseguendo la pompa diluente in avanti a circa 1/5th la massima velocità e la pompa di campionamento indietro a circa 1/10th la velocità massima. Continuare fino a quando il sistema fluidico è lavata con diluente.
2. Preparare le nanoparticelle da analizzare. Nel caso di PBAEs, separatamente diluire il DNA plasmidico magazzino (1 mg / ml) e PBAE magazzino (100 mg / ml) in tampone sodio acetato (25 mM, pH 5) in provette Eppendorf.
3. Diluire la concentrazione di DNA plasmidico a 0,06 mg / ml. Concentrazione del polimero può variare a seconda del desiderato rapporto peso-peso di polimero DNA (ad esempio, per 60 peso / peso di particelle, polimero viene diluito a 3,6 mg / ml).
4. Aggiungere la soluzione di polimero ad un volume uguale di soluzione di DNA plasmidico e mescolare vigorosamente. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti per permettere l'auto-assemblaggio.
5. Diliuto la soluzione di nanoparticelle 100 volte in PBS affinché la concentrazione nanoparticelle di essere nel range appropriato per NTA e per ottenere un volume finale di almeno 500 microlitri.
6. Caricare il campione nella Nanosight ponendo la provetta caricamento nel campione provetta Eppendorf (Figura 4A). Assicurarsi di non introdurre bolle d'aria.
7. In modalità di cattura, aumentare il livello di fotocamera finché le particelle non può essere visto. Regolare il fuoco in modo che le particelle guardare liscia (Figura 4A e 4B).
8. In modalità standard, regolare il livello di fotocamera oltre il punto che tutte le particelle possono essere visti sullo schermo. Quindi diminuire il livello fotocamera al livello più basso in modo tale che le particelle possono ancora essere osservati. Se un livello intermedio fotocamera è necessario, andare in modalità avanzata e modificare l'otturatore della fotocamera e ottenere ai livelli appropriati.
9. Controllare visivamente per assicurarsi che non ci sono fra 20 - 100 particelle sul screen. Un numero ideale per il monitoraggio delle nanoparticelle è di circa 50 particelle. Se ci sono troppi o troppo pochi, lavare l'NS500, regolare la diluizione in PBS, e ri-caricare il campione.
10. Regolare la durata di acquisizione in base alla tabella delle modalità standard. Tipicamente 30 - 60 sec è una lunghezza di cattura appropriata (Figura 4B).
11. Per caricare il campione successivo, lavare l'impianto, poi ri-caricare il nuovo campione.
12. Una volta che i video vengono catturati, procedere alla fase di elaborazione con l'apertura di un file video.
13. Ci sono un certo numero di parametri che possono essere sintonizzati per elaborare meglio un video (Figura 4C). L'obiettivo è quello di selezionare parametri che meglio catturare ogni particella sullo schermo, come indicato da un segno di croce rossa sullo schermo per ogni particella (Figura 5).
14. Aumentare il guadagno dello schermo per vedere meglio le particelle. In modalità standard o avanzata, selezionare la regolazione automatica per i parametri da clicking le caselle appropriate. Nel caso che le impostazioni auto non adeguatamente selezionare particelle, deseleziona la casella e impostare manualmente i parametri (Figura 4C).
15. Una volta che tutte le particelle vengono raccolte sullo schermo, fare clic sul pulsante processo del software per elaborare il file video (Figura 4C). Questo fornisce la distribuzione della dimensione delle particelle, medie dimensioni, così come la concentrazione di particelle.
16. Al fine di assicurarsi che la concentrazione di particelle è accurata, modificare la diluizione PBS, ad esempio aumentando la diluizione di 2x, e ripetere la procedura precedente. Misurazione diluizioni multiple dello stesso campione è raccomandata per assicurare che la misura della concentrazione del campione è accurato. Una buona gamma per la misura è 10 ⁷ -10 ⁹ particelle / ml.
17. Verificare che tutti i plasmidi sono incorporati in nanoparticelle eseguendo elettroforesi su gel delle nanoparticelle e valutare se un DNA libero è presente.Se non tutti i plasmidi sono incapsulati, utilizzare tecniche standard per misurare l'assorbanza DNA per quantificare totale plasmidi incapsulati.
18. Per calcolare il numero medio di plasmidi per particella, dividere la concentrazione totale incapsulato plasmide dalla concentrazione di particelle misurata NTA. Per stimare il plasmide per la distribuzione di particelle campione, prima usare l'istogramma delle particelle NTA dimensioni per calcolare la frazione di volume di 1-nm ciascun bin di particelle. Moltiplicate questa distribuzione frazione di volume per l'importo totale plasmide per ottenere il numero di plasmidi in ogni bin. Dividere questi numeri per il numero di particelle in ciascun bin di ottenere il numero di plasmidi-per-particelle per ogni dimensione delle particelle (Figura 6).

Risultati

La figura 1 mostra una immagine di fluorescenza microscopia di un esempio di trasfezione successo HRECs con il plasmide EGFP. L'immagine brightfield è utile per garantire che le cellule mantengono la loro morfologia normale. Inoltre, saggi di vitalità cellulare, come saggi MTS o simili, può essere utilizzato per valutare la tossicità delle nanoparticelle ^7. Citometria a flusso, come descritto, può essere usato per quantificare l'efficienza di trasfezione. Quando si utilizza il HyperCyt multi-...

Discussione

I protocolli sopra descrivono metodi di valutazione dell'efficacia trasfezione di formulazioni di nanoparticelle, così come un modo per caratterizzare la dimensione delle particelle e caricamento DNA delle nanoparticelle. Il numero di plasmidi per particella è un parametro importante che può aiutare a prevedere l'efficacia della particella e può essere utilizzato anche per la determinazione della dose. Monitoraggio analisi delle nanoparticelle può essere eseguita in una gamma di differenti soluzioni acquose, com...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
			Reagente
Soluzione tampone fosfato, 1x (PBS)	Invitrogen	10010
EGM-2MV BulletKit	Lonza	CC-3202
Tripsina	Invitrogen	25300
Tampone acetato di sodio	Sigma-Aldrich	S7899	Diluire a 25 mM in acqua deionizzata
Dimetilsolfossido	Sigma-Aldrich	276855
pEGFP DNA	Elim Biopharmaceuticals	NA
DNA DsRed	Addgene	21718
PEI, ramificato	Sigma-Aldrich	408727
CellTiter 96 acquose One	Promega	G3580
			Materiale
Cancella fondo piatto piastra a 96 pozzetti, sterile	Sarstedt	82.1581.001
Cancella fondo rotondo piastra a 96 pozzetti, sterile	Sarstedt	82.1582.001
12 canali Finnpipette	Thermo Scientific	NA	5-50 e 50-300 microlitri
Microscopio a fluorescenza	Zeiss	NA	Numero di modello: AX10
C6 Accuri citofluorimetro	BD Biosciences	NA
HyperCyt allegato	Intellicyt	NA
NS500	NanoSight	NA