Valutazione della funzione muscolare del muscolo estensore lungo delle dita Ex vivo E Muscolo tibiale anteriore In situ In Mouse

Sommario

Le variazioni muscolari degli arti proprietà contrattili e passiva meccanici sono biomarcatori importanti per le malattie muscolari. Questo manoscritto descrive test fisiologici per misurare queste proprietà nel lungo delle dita estensore murino e tibiale muscoli anteriori.

Abstract

I movimenti del corpo sono forniti principalmente da funzione meccanica del muscolo scheletrico. Il muscolo scheletrico è costituito da fasci numerose miofibre che sono rivestite da tessuti connettivi intramuscolari. Ogni miofibre contiene miofibrille molti che corrono longitudinalmente lungo la lunghezza del miofibre. Miofibrille sono l'apparato contrattile del muscolo e sono composti da unità ripetute contrattili dette sarcomeri. Un'unità sarcomero contiene filamenti di actina e miosina che sono distanziati dai dischi Z e proteine ​​titin. Funzione meccanica del muscolo scheletrico è definito dalle proprietà contrattili del muscolo e passiva. Le proprietà contrattili vengono utilizzati per caratterizzare la quantità di forza generata durante la contrazione muscolare, il tempo di generazione della forza e del tempo di rilassamento muscolare. Qualsiasi fattore che influenza la contrazione muscolare (come ad esempio l'interazione tra filamenti di actina e miosina, omeostasi del calcio, ATP / ADP rapporto, ecc) influenza la prope contrattileproprietā. Le proprietà passive si riferiscono alle proprietà elastiche e viscoso (rigidità e viscosità) del muscolo in assenza di contrazione. Queste proprietà sono determinate dal extracellulare e le componenti strutturali intracellulari (come titin) e tessuti connettivi (principalmente collagene) ^1-2. Le proprietà contrattili e passiva sono due aspetti inseparabili della funzione muscolare. Per esempio, la flessione del gomito è compiuta dalla contrazione dei muscoli nel vano anteriore del braccio e allungamento passivo dei muscoli nel vano posteriore del braccio. Per comprendere veramente la funzione muscolare, entrambe le proprietà contrattili e passivo dovrebbe essere studiata.

Le proprietà contrattili e / o passivi meccaniche di muscoli sono spesso compromesse nelle malattie muscolari. Un buon esempio è la distrofia muscolare di Duchenne (DMD), un muscolo grave deperimento causata da carenza di distrofina ^3. Distrofina è una prote citoscheletricain che stabilizza la membrana delle cellule muscolari (sarcolemma) ⁴ durante la contrazione muscolare. In assenza di distrofina, il sarcolemma viene danneggiato dalla forza di taglio generata durante la trasmissione della forza. Questa membrana strappo inizia una reazione a catena che porta alla morte delle cellule muscolari e perdita di macchinari contrattile. Di conseguenza, si riduce la forza muscolare e miofibre morti sono sostituiti dai tessuti fibrotici ^5. Questa modifica in seguito aumenta la rigidità muscolare ^6. Misurazione accurata di questi cambiamenti fornisce guida importante per valutare la progressione della malattia e per determinare l'efficacia terapeutica del nuovo gene / cellulare / interventi farmacologici. Qui, vi presentiamo due metodi per valutare entrambe le proprietà contrattili e passiva meccaniche del muscolo estensore lungo delle dita (EDL) muscolare e le proprietà contrattili del tibiale anteriore (TA) muscolare.

Protocollo

1. Valutazione delle proprietà contrattili e passiva del vivo EDL Ex Muscle

Le proprietà contrattili e passivo del muscolo EDL sono misurati ex vivo utilizzando il sistema di scientifico Aurora test muscolare in vitro. Fare riferimento alla Tabella 1 per i materiali e le attrezzature.

1.1 Materiale di preparazione

1. Montare il tessuto-organo bagno assicurando il oxytube all'acqua-giacca bagno tessuto. Fissare la vasca assemblata dell'apparato muscolo montaggio. Collegare la linea di gas al oxytube. Fissare le linee d'acqua di circolazione per l'acqua-bagno giacca tessuto e posizionare la valvola a spillo nella vasca di drenaggio.
2. Accendere la circolazione bagnomaria e regolare la temperatura a 30 ° C ^7. Lasciare 5 PSI (libbre per pollice quadrato) del 95% O CO ₂ -5% ₂ a fluire attraverso il oxytube. Riempire la vasca con il tampone di Ringer. Equilibrare il buffer per almeno10 min con un flusso di gas costante regolando la valvola oxytube.
3. Accendere gli strumenti (stimolatore, dual mode sistema a leva, e l'interfaccia di segnale). Caricare il controllo dinamico del muscolo (DMC) software in base alle istruzioni del produttore.

1,2 dissezione del muscolo EDL

Tutti gli studi su animali devono essere approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso.

1. Anestetizzare il mouse con iniezione intraperitoneale di 2,5 microlitri / g di peso corporeo del cocktail anestetico (fare riferimento alla sezione materiali). Durante tutta la procedura chirurgica, la profondità della sedazione è stata verificata eseguendo un pizzico punta. Un aumento del 10% della dose iniziale anestetico viene somministrato quando necessario per mantenere l'animale in anestesia. Shave dell'arto posteriore. Mantenere la temperatura corporea a 37 ° C prima della procedura di dissezione posizionando il mouse su una piastra elettrica. La temperatura corporea è costantemente monitorata da misurando la temperat rettaleure utilizzando una sonda termica.
2. Posizionare il supino del mouse sulla scheda di dissezione (Figura 1). Togliere la pelle gamba per esporre i muscoli degli arti posteriori. Fissare la gamba sul blocco Sylgard utilizzando due perni, uno dressmaker nel piede e l'altro nel muscolo gracile. Posizionare una lampada di calore sopra il corpo del mouse per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C. Costantemente superfuse tutti i muscoli a vista con tampone di Ringer. Scolare il tampone in eccesso attraverso una linea di vuoto.
3. Esporre il tendine distale del TA e il legamento estensore allo stereomicroscopio da dissezione la pelle verso il piede. Rimuovere delicatamente la fascia che ricopre il muscolo TA. Tagliare il legamento estensore per liberare il tendine distale TA.
4. Tagliare il tendine distale TA e utilizzarlo per staccare il muscolo TA. Rimuovere con cautela il muscolo TA al suo attaccamento prossimale. Posizionare un sottile pezzo di cotone tampone imbevuto di Ringer accanto al muscolo EDL di assorbire emorragia causata dalla rottura del sistema vascolare muscolo TA. Utilizzare la linea del vuoto per rimuovere il tampone in eccesso e sangue.
5. Legare nodi a doppio quadro seguite da un nodo ciclo usando una sutura di seta pane all'incrocio tendine del muscolo (MTJ) del muscolo EDL distale (Figura 2). Fare un'incisione nella porzione distale del muscolo bicipite femorale per esporre il muscolo EDL prossimale. Ripetere la stessa serie di nodi (figura 2) al MTJ del tendine prossimale EDL. Fissare il gancio braccio di leva sia al prossimale o distale i nodi con un doppio nodo quadrato utilizzando la stessa linea di sutura. Tagliare la rimanente linea di sutura.
6. Tagliare il tendine prossimale EDL superiore al nodo sutura prossimale. Sollevare il muscolo EDL con il gancio e tagliare la vascolarizzazione sotto il muscolo. Tagliare il tendine distale EDL inferiore al nodo sutura distale per rimuovere il muscolo EDL da dell'arto posteriore. Coprire l'arto posteriore esposta con un pezzo di cotone imbevuto di buffer di Ringer.
7. Fissare il gancio per il braccio di leva. Allineare il muscolo verticaletra due elettrodi. Fissare la linea di sutura distale al posto fisso. Sollevare il bagno tessuto di immergere il muscolo nel buffer di Ringer. Regolare la tensione di riposo di 1,0 g che utilizza una doppia grossolana / fine fase di traduzione e permettere al muscolo di equilibrare per almeno 10 min.

1,3 di misura delle proprietà contrattili e passivo del muscolo EDL

Utilizzare la tabella 2 per impostare i parametri nel software DMC per ciascuno dei seguenti misurazioni. Analizzare i dati utilizzando l'analisi dinamica muscolare (DMA) del software.

1.3.1 Misurare le proprietà contrattili del muscolo EDL

1. Stimolare il muscolo EDL tre volte a 150 Hz con 60 sec a parte per stabilizzare il muscolo ^8.
2. Stimolare il muscolo EDL a differenti tensioni di appoggio per determinare la lunghezza ottimale (Lo). La lunghezza ottimale è la lunghezza del muscolo in cui si sviluppa la tensione massima contrazione. Lasciare che il muscolorelax per 2 min.
3. Regolare la tensione di riposo a Lo. Misurare la forza muscolare a stimolazione contrazione singola. Determinare la forza assoluta contrazione (Pt), il tempo alla tensione di picco (TPT) e tempo di rilassamento metà (½ RT) del Pt. Lasciare che il muscolo di rilassarsi per 2 min.
4. Regolare la tensione di riposo a Lo. Misurare la forza tetanica muscolare generata a frequenze di stimolazione differenti (50, 80, 100, 120, 150 e 200 Hz). Determinare la forza massima assoluta muscolare tetanica (Po) in caso di forza muscolare raggiunge il massimo. Misurare la TPT e ½ RT del Po ^9.
5. Lasciare che il muscolo di rilassarsi per 5 minuti. Regolare la tensione di riposo a Lo. Applicare 10 cicli di contrazioni eccentriche con 2 minuti di riposo tra i cicli. Calcolare la perdita relativa forza del Po dopo ogni ciclo di contrazione eccentrica.
6. Staccare il muscolo EDL dall'apparecchio e tagliare i tendini sul sito sutura. Determinare il peso umido muscolo e calcolare l'area della sezione trasversale del muscolo (CSA)6,10.

1.3.2 Misurazione delle caratteristiche passive del muscolo EDL

1. Staccare il muscolo controlaterale EDL e collegarlo all'apparecchio, come descritto nella Sezione 1.2, i punti da 2 a 7.
2. Oggetto del muscolo EDL a sei fasi di protocollo che si estende in cui è teso il muscolo a 160 Lo% con un incremento del 10% Lo. Analizzare la tensione-deformazione ⁶ Profilo.
3. Valutare la proprietà viscoso del muscolo EDL misurando la velocità di rilassamento stress (SRR) alle scadenze di seguito dopo l'allungamento e tenendo premuto il muscolo al 10% Min: da picco a 0,1 s post-picco (pp), da 0,1 a 0,2 s pp, da 0,2 a 0,5 s pp, da 0,5 a 1s pp e da 1 a 1,5 s pp
4. Alla fine dello studio, eutanasia il mouse per dislocazione cervicale e / o decapitazione mentre il mouse è ancora sotto anestesia. Staccare il muscolo EDL dall'apparecchio e tagliare i tendini sul sito sutura. Determinare il peso umido muscolo e calcolare il muscolo croce seArea ctional (CSA) ^{6, 10.}

2. Valutazione delle proprietà contrattile del muscolo TA In situ

Le proprietà contrattili del muscolo TA sono misurate con il sistema scientifico Aurora in situ test muscolare. Fare riferimento alla Tabella 1 per i materiali e le attrezzature.

2,1 Attrezzatura preparazione

1. Riscaldare il termo-controllata stadio animale a 37 ° C utilizzando il ricircolo bagnomaria.
2. Accendere gli strumenti (stimolatore, dual mode sistema a leva, e l'interfaccia di segnale). Caricare il software DMC secondo le istruzioni del produttore.

2.2 Preparazione del muscolo TA per la misura della forza in situ

1. Anestetizzare il mouse, la barba l'arto posteriore ed esporre il muscolo TA come descritto nei punti da 1 a 3 nella sezione 1.2.
2. Fate un doppio nodo quadrato intorno alla rotula legamento USIng un pane sutura seta. Fate un doppio nodo quadrato seguito da un nodo anello nella parte MTJ del muscolo TA distale (Figura 2), legare un altro doppio nodo quadrato lasciando un ciclo di ~ 10 mm dal nodo tendine distale TA utilizzando la stessa linea di sutura. Posizionare il secondo doppio nodo quadrato sul lato del circuito.
3. Rimuovere i perni dalla dell'arto posteriore e posizionare l'animale prona. Esporre il muscolo bicipite femorale. Praticare un'incisione sulla linea mediana per rivelare il nervo sciatico. Fate un doppio nodo quadrato attorno l'estremità prossimale del nervo sciatico. Tagliare una parte delle linee di sutura e tagliare il nervo superiore al nodo. Delicatamente, tirare il nervo sciatico verso il ginocchio utilizzando la linea di sutura e cancellare il tessuto connettivo circostante per la liberazione di ~ 5 mm della sua lunghezza. Non allungare il nervo durante questa procedura e costantemente superfuse il nervo con il tampone di suoneria.
4. Preparare il muscolo controlaterale TA come descritto nei punti da 1 a 3. Coprire un dell'arto posteriore esposta con un pezzo di Ringer tampone imbevuto di cotone. Costantemente superfuse entrambi gli arti posteriori con pre-riscaldato (37 ° C) del buffer di Ringer. Rimuovere il tampone in eccesso attraverso una linea di vuoto.
5. Posizionare l'animale prona sulla piattaforma animale. Fissare il supporto del morsetto ginocchio alla piattaforma animale e fissare entrambe le ginocchia al perno di metallo con doppi nodi quadrati utilizzando le linee di sutura del legamento della rotula. Pin entrambi i piedi sul blocco Sylgard con perni sarta. Per bloccare la piattaforma animale nel termocontrollata stadio. Posizionare la lampada di calore per mantenere la temperatura centrale del corpo animale a 37 ° C.
6. Fissare il portaelettrodo alla piattaforma animale e posare il nervo sciatico sull'elettrodo utilizzando la linea di sutura. Tenere l'elettrodo lontano dai muscoli degli arti posteriori. Tagliare il tendine distale TA dell'arto posteriore scoperto presso il sito sutura MTJ. Fissare il tendine distale ciclo TA sutura al gancio braccio di leva. Coprire il muscolo esposta dell'arto posteriore con cotone imbevuto di un tampone di Ringer caldo.

2.3 Misurare le proprietà contrattili del muscolo TA

1. Utilizzare la Tabella 2 per impostare i parametri nel software DMC. Seguire lo stesso protocollo descritto nella Sezione 1.3.1 per determinare le proprietà contrattili del muscolo TA. Analizzare i dati utilizzando il software DMA.
2. Dopo la misurazione di proprietà contrattile, staccare il tendine distale ciclo TA sutura al gancio del braccio livellatore. Rimuovere il muscolo TA. Determinare il peso umido muscolo e calcolare il CSA ^10.
3. Misurare le proprietà contrattili del muscolo TA controlaterale secondo i passi da 1 a 3 sopra. Euthanize il mouse secondo le linee guida istituzionali alla fine dello studio.

Risultati

I seguenti risultati sono una rappresentazione dei nostri rapporti precedenti ^6,9. I dati sono presentati come media ± errore standard della media. Tabella 3 mostra le proprietà morfometriche del muscolo EDL in BL10 normale e distrofina-deficienti (mdx) topi a 4 a 6 mesi di età. Figura 4 mostra rappresentativi proprietà contrattili e passiva del muscolo EDL da BL10 e mdx topo. Le proprietà contrattili del muscolo EDL sono descritti dai seguenti termini tra cui la specifica (forza assoluta divisa per il CSA) forza di contrazione (Figura 4A), specifica la forza tetanica massimale (Figura 4B), TPT e ½ RT dell'assoluto forza massimale tetanica (Figura 4C e D). Il TPT e ½ RT può essere calcolare dalla forza di contrazione assoluta. Il profilo sforzo-deformazione (Figura 4E) e SRR (Figura 4F) unre usato per descrivere le proprietà passive del muscolo EDL.

L'assenza di distrofina ha un impatto significativo sulle proprietà contrattili e passivo del muscolo EDL ^6,9. Twitch specifico e le forze tetaniche sono significativamente ridotti nel muscolo EDL mdx. Il TPT è significativamente più veloce, mentre il ½ RT è significativamente più lenta nel muscolo EDL mdx. Lo sforzo-deformazione profilo suggerisce che la rigidità è significativamente aumentata nel muscolo EDL mdx. Il muscolo EDL mdx produce anche una forza di resistenza significativamente molto più alto (stress passivo) prima di raggiungere la tensione di picco, mentre i post-picco sollecitazioni declinare molto più veloce. Inoltre, la SRR era significativamente superiore nel muscolo EDL mdx rispetto a quella del muscolo EDL BL10.

Analisi statistica

Significatività statistica tra i due gruppi è analizzato dal test t di Student. Per ssignificato tatistical tra più gruppi, Solo andata o due vie analisi ANOVA seguita da analisi post hoc di Bonferroni è consigliato l'utilizzo del software SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC). La differenza è considerato significativo quando p <0,05.

Tabella 1. Materiali e attrezzature.

Esperimento	Tensione a riposo (grammi)	Frequenza degli impulsi (Hz)	Larghezza d'impulso (ms)	Stimolazione durata (ms)	Stretch lunghezza	Stretch durata (ms)	Stretch tasso	Commenti
1. La valutazione delle proprietà contrattili e passiva del vivo EDL ex muscolare
1.3.1 Misurare le proprietà contrattili del muscolo EDL
1. Warm up	1,0	150	0,2	300				Appoggiare il muscolo per 60 secondi tra ogni stimolo. Queste contrazioni tetaniche preliminari stabilizzare il muscolo per le misurazioni successive.
2. Muscolare lunghezza ottimale (Lo)	0.5, 1.0, 1.5 e 2.0	1	0,2	300				Lasciare che il muscolo di rilassarsi per 30 secondi tra ogni stimolo. Misurare la lunghezza ottimale del muscolo utilizzando un calibro digitale.
3. Singolo twitch forza (Pt)	Regolare la tensione di riposo a Lo	1	0,2	300
4. Forza muscolare tetanica	Regolare la tensione di riposo a Lo	50, 80, 100, 120, 150 e 200	0,2	300				Lasciare che il muscolo di rilassarsi per 1 minuto tra ogni stimolo. Determinare la frequenza con cui generare il massimo assoluto tetanica forza (Po).
5. Contrazione eccentrica	Regolare la tensione di riposo a Lo	Usare la frequenza genera la forza massima tetanica (Po)	0,2	700	10% Lo	ultimi 200 ms della durata di stimolazione	Lo 0,5 / sec	Ripetere la contrazione eccentrica per 10 cicli con 2 minuti di riposo tra i cicli.
6. CSA del muscolo EDL							CSA = (massa muscolare (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,44)]. 1,06 g / cm 3 è la densità muscolare e 0,44 è l'EDL lunghezza della fibra muscolare a Lo rapporto.
1.3.2 Misurazione delle caratteristiche passive del muscolo EDL
1. Sei fase di stiramento protocollo	Regolare la tensione di riposo a Lo				10% Lo		2 cm / sec	Ripetere il protocollo estende con un incremento del 10% fino al 160 Lo Lo% viene raggiunto. ALOW 1,5 secondi tra i cicli di stretch.
2. SRR	Regolare la tensione di riposo a Lo				10% Lo		2 cm / sec	SSR è calcolato dividendo la differenza di tensione con il time trascorso tra due punti temporali in un arco di tempo.
2,3 di misura delle proprietà contrattili del muscolo TA
1. Warm up	4.0	150	0,2	300				Appoggiare il muscolo per 60 secondi tra ogni stimolo.
2. Muscolare lunghezza ottimale (Lo)	3.0, 4.0, 5.0, 6.0 e 7.0	1	0,2	300				Lasciare che il muscolo di rilassarsi per 30 secondi tra ogni stimolo. Misurare la lunghezza ottimale del muscolo utilizzando un calibro digitale.
3. CSA del muscolo TA								CSA = (massa muscolare (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,6)]. 0,6 TA è la lunghezza della fibra muscolare alla Lo ratio.

Tabella 2. Parametri per la valutazione delle proprietà meccaniche dei muscoli EDL e TA.

Tensione	Età (mese)	Peso corporeo (g)	EDL peso (mg)	Lo EDL (mm)	EDL CSA (mm 2)
BL10	6	32,03 ± 0,57	13,90 ± 0,77	14,09 ± 0,04	2,12 ± 0,12
mdx	6	35,44 ± 0,42 *	16,73 ± 0,42 *	13,93 ± 0,05 *	2,57 ± 0,07 *

Tabella 3. Caratteristiche morfometriche del muscolo EDL. *, Il valore in mdtopi x è significativamente diversa da quella dei pari età BL10 topi.

Figura 1. Un diagramma schematico della misura bordo del mouse dissezione. Dissezione Il consiglio è composto da un plexiglass ½ pollice di spessore e è stato realizzato presso il negozio istituzionale. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 2. Una serie di immagini digitali che mostrano le fasi di un nodo doppio quadrato seguito da un nodo anello nella parte MTJ. Asterisk, ilEDL muscolare, Freccia, il tendine distale del muscolo EDL.

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Figura 3. Un diagramma schematico della misura piattaforma per test in situ funzione muscolare TA. La piattaforma animale plexiglass e acciaio inox supporto del ginocchio sono stati progettati per il montaggio sul 809B in un apparecchio del mouse situ. *, Asta in acciaio inox (Cat # MPR-2.0 , Siskiyou, Grants Pass, OR), #, portaelettrodo universale (Cat # MXB, Siskiyou, Grants Pass, OR), §, attacco di canna elettrodo (Cat # MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); **, Sylgard blocco. Clicca qui per ingrandire la figura .

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Figura 4. I risultati rappresentativi per le proprietà contrattili e passivo del muscolo EDL. Le proprietà contrattili del muscolo EDL sono caratterizzati dalla forza twitch specifico (A), la forza specifica tetanica (B), il tempo di tensione di picco (C) ed il tempo di rilassamento mezzo (D). Le proprietà passive del muscolo EDL sono valutati dal profilo sforzo-deformazione (E) e la SSR. *, I topi mdx sono significativamente diversi da pari età BL10 topi.

Discussione

In questo protocollo, abbiamo illustrato saggi fisiologici per misurare le proprietà contrattili e passive del muscolo EDL e le proprietà contrattili del muscolo TA. Una delle principali preoccupazioni in studi di fisiologia muscolare è l'ossigenazione del muscolo bersaglio. Per grandi muscoli (come il muscolo TA), il nell'approccio situ è preferito perché la diffusione dell'ossigeno dal buffer di Ringer non può raggiungere il centro del muscolo in un test in vitro. Nell'approccio situ non disturba alimentazione normale sangue e ipossia associata effetti artificiali sono evitati. Il muscolo EDL è uno dei muscoli più comunemente usato in studio fisiologia. Un'adeguata ossigenazione del muscolo intero può essere realizzato in un sistema in vitro a causa delle piccole dimensioni del muscolo. Inoltre, il sistema in vitro fornisce un ambiente chiuso per manipolare le concentrazioni di ioni (Ca ^{2 +,} Na ⁺ e K ⁺⁾ e chimicicals (ATP e glucosio) che sono necessari per la generazione di forza muscolare ottimale. Questo offre una grande opportunità per studiare l'effetto di queste variabili sulla produzione di forza.

Misurazione accurata delle proprietà contrattili e passivo del muscolo degli arti è fondamentale per studiare la funzione del muscolo scheletrico. Cambiamenti caratteristici di queste proprietà sono spesso considerati come i tratti distintivi di varie malattie muscolari. I cambiamenti in questi parametri sono indicatori importanti per determinare se una terapia sperimentale è efficace o meno.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiale	Fabbricante		Caratteristiche e commenti
Tissue-organo bagno	Radnoti LLC, CA, USA		Water-jacket bagno tessuto (Cat # 158351-LL), dispersore del tubo di ossigeno (Cat # 160192), valvola Luer (Cat # 120722)
Circolazione bagno d'acqua	Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti d'America
Gas mix	Airgas Nazionale, Charlotte, Carolina del Nord, Stati Uniti d'America		95% O 2 e 5% CO 2
In funzione dell'apparato muscolo saggio in vitro	Aurora scientifico, Aurora, ON, Canada		Il sistema è costituito da uno stimolatore (Model # 701A), una doppia modalità leverismo (Model # 300C o 305C), un segnale di interfaccia (Model # 604b) e un test apparatus (Model # 800A) per il montaggio in verticale organo bagno tessuto
Nel software muscolare saggio funzione in vitro			Dinamico il controllo muscolare (DMC) di software e di controllo dinamico di analisi dei dati muscolare (DMA) software
Mouse cocktail miscelati in anestesia 0,9% NaCl	Fare riferimento alle linee guida istituzionali		Ketamina (25 mg / ml), xilazina (2,5 mg / ml) e acepromazina (0,5 mg / ml). Tutta la procedura chirurgica, un supplemento del 10% della dose iniziale può essere necessario per mantenere animali sotto anestesia.
Sylgard	Mondiale di precisione dello strumento	Cat # SYLG184
Una misura plexiglas dissezione bordo	In casa progettata		Fare riferimento alla figura 1
Riscaldamento lampada	Tensor Lighting Company,Boston, MA, Stati Uniti d'America		15 Lampada Watt per mantenere il caldo del mouse durante la dissezione
Buffer di Ringer	Le sostanze chimiche sono acquistati da Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti d'America		Composizione in mM: 1.2 NaH 2 PO 4 (Cat # S369), 1 MgSO4 (Cat # M63), KCl 4,83 (Cat # P217), 137 NaCl (Cat # 217), 24 NaHCO 3 (Cat # S233), 2 CaCl 2 (Cat # C79) e 10 di glucosio (Cat # D16). Sciogliere chimici individualmente e mescolare nell'ordine elencato sopra. Conservare a 4 ° C.
Stereo microscopio da dissezione	Nikon, Melville, NY, Stati Uniti d'America
Dissezione strumenti	Strumenti Scienza Fine, Foster City, CA, USA		Pinze, forbici grossa grossa, pinze sottili (dritto e 45 °)
Intrecciato sutura di seta # 4-0	SofSilk USSC Suture, Norwalk, CT, USA	Cat # SP116
Una misura in acciaio inox gancio	Parti piccole, Inc.		2'' a lungo S / S 304V (0,18 diametro'') per il trasduttore di forza 305C o 2.5'' a lungo S / S 304V (0,012 diametro'') per trasduttore 300C (Cat # ASTM A313)
In situ sistema di analisi della funzione muscolare	Aurora scientifico, Aurora, ON, Canada		Il sistema (809B, in apparecchi topo situ) sono costituiti da uno stimolatore (Modello # 701B), un dual-mode leverismo (Modello # 305C), un segnale di interfaccia (Model # 604a) ed un apparato controllato pedana thermo (Model # 809A )
Nel software muscolare saggio funzione in vitro	Aurora scientifico, Aurora, ON, Canada		Dinamico il controllo muscolare (DMC) di software e di controllo dinamico di analisi dei dati muscolare (DMA) software
Una misura TA saggio piattaforma animale	In casa progettata		Fare riferimento alla Figura 2
Una misura in acciaio inox gancio	Parti piccole, Inc.	Cat # ASTM A313	0.5'' a lungo S / S 304V (0,18 diametro'')
Su misura elettrodi di platino 25G	Le imprese Chalgren, Gilroy, CA		A saldare due fili di platino 0,016'' di spessore a due fili elettrici 24G