Neonatale Elettroporazione zona subventricolare

Summary

Dimostriamo una tecnica minimamente invasiva denominata neonatale elettroporazione zona subventricolare. La tecnica consiste nell'iniettare DNA plasmidico nei ventricoli laterali di cuccioli neonati e l'applicazione di corrente elettrica per fornire e manipolare geneticamente le cellule staminali neurali

Abstract

Cellule staminali neurali (NSC) linea ventricoli postnatali laterali e danno luogo a diversi tipi cellulari che includono neuroni, astrociti e cellule ependimali ^1. La comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della NSC auto-rinnovamento, l'impegno, e la differenziazione è fondamentale per sfruttare il loro potenziale unico per riparare il cervello e capire meglio disturbi del sistema nervoso centrale. Metodi precedenti per la manipolazione dei sistemi di mammifero richiede l'impegno lungo e costoso dell'ingegneria genetica a livello animale intero ^2. Così, la maggior parte degli studi hanno esplorato le funzioni di molecole NSC in vitro o in invertebrati.

Qui, una dimostrazione della tecnica semplice e rapida per manipolare NPC neonatali che si riferisce a come neonatale zona subventricolare (SVZ) elettroporazione. Tecniche simili sono state sviluppate una decina di anni fa per studiare cellule staminali neurali embrionali e hanno aiutato studi sulla cortica^3,4 l di sviluppo. Più di recente questo è stato applicato per studiare il proencefalo roditore postnatale ^5-7. Questa tecnica comporta l'etichettatura robusto SVZ cellule staminali neurali e la loro progenie. Così, postnatale SVZ elettroporazione fornisce un costo e un'alternativa tempo efficace per mammiferi ingegneria genetica NSC.

Protocol

Questa procedura è in conformità con i requisiti IACUC Yale. Gli scienziati dovrebbero fare in modo che le linee guida IACUC sono approvati e seguiti secondo le proprie esigenze istituzionali.

1. Sezione 1. Preparazione di Pipette DNA, soluzioni, e vetro

1. Generazione di elevata purezza (OD 260/280> 1,80) ad alta concentrazione (mg / ul> 2.5) privo di endotossine DNA.
2. Preparare soluzione fisiologica 0,9% e filtro sterile attraverso un filtro 22 micron.
3. Posto 10 centimetri tubi di fuoco lucido vetro borosilicato capillari (OD: 1,5 mm, ID: 1.10 mm) in un modello PP-830 Narishige PC-10 estrattore pipetta di vetro....

Results

Neonatali subventricolare elettroporazione risultati della zona nella etichettatura di quasi tutti glia radiale contigua alla dorsale, zona dorsale subventricolare laterale e laterale seguendo il movimento "spazzare" dell'elettrodo pinzetta (Figura 1E). Tuttavia, elettroporazione può essere adattato al requisito dell'esperimento rispettivo ma non spazzare l'elettrodo e utilizzando il posizionamento e l'orientamento specifico come dettagliato nel video. Ad esempio, poiché localizzata dorsalmente glia rad.......

Discussion

Qui dettaglio la tecnica di elettroporazione neonatale SVZ, una tecnica per etichettare in modo rapido e robusto e manipolare le cellule staminali SVZ e la loro progenie. Ci sono diversi vantaggi che elettroporazione ha rispetto ad altre tecniche. Prima, data l'etichettatura focale di cellule, si è in grado di discernere cellule effetti autonomi e non autonomi cella. In secondo luogo, la manipolazione genetica utilizzando sistemi inducibili permette di confrontare gli effetti prima o dopo l'integrazione sinaptic.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Heavy Tubi lucido borosilicato	Sutter Instrument	BF150-110-10
Doppio-Stage Glass Micropipetta Puller	Narishige	PC-10H
Fast Green	Fischer Scientific	0521192205
ECM 830 Onda quadra generatore di impulsi	Harvard Apparatus	45-0052
Tweezertrodes	Harvard Apparatus	45-0488
Fibra ottica Sorgente luminosa	Fisher Scientific	12-562-36
Tungsteno alogenalampada	USHIO America, Inc	1002247
Picospritzer II	Parker Instruments	052-0312-900