Isolamento dei miociti atriali umane per misure simultanee di Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitori e correnti di membrana

Niels Voigt; Xiao-Bo Zhou; Dobromir Dobrev

doi:10.3791/50235

Articolo metodologico

Isolamento dei miociti atriali umane per misure simultanee di Ca

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DOI:

10.3791/50235

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3 luglio 2013

Niels Voigt^*¹^,² , Xiao-Bo Zhou^*² , Dobromir Dobrev¹^,²

¹Institute of Pharmacology, University of Duisburg-Essen , ²Division of Experimental Cardiology, University of Heidelberg

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descriviamo l'isolamento di miociti atriali umani, che possono essere utilizzati per Ca intracellulare^{2 +} Misure in combinazione con studi elettrofisiologici di patch-clamp.

Abstract

Lo studio delle proprietà elettrofisiologiche dei canali ionici cardiaci con la tecnica del patch-clamp e l'esplorazione delle cardiaco cellulare Ca ^{2 +} movimentazione anomalie richiede cardiomiociti isolati. Inoltre, la possibilità di indagare miociti da pazienti che utilizzano queste tecniche è un requisito prezioso per delucidare le basi molecolari di malattie cardiache come la fibrillazione atriale (AF). ¹ Qui si descrive un metodo per l'isolamento di miociti atriali umani che sono adatti per entrambi studi di patch-clamp e misurazioni simultanee di concentrazioni intracellulari di Ca ^{2 +.} In primo luogo, appendici atriali giuste ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia a cuore aperto sono tagliate in piccoli pezzi di tessuto ("metodo chunk") e lavati a Ca ^{2 +} soluzione priva. Poi i pezzi di tessuto vengono digeriti in collagenasi e proteasi contenente soluzioni con 20 mM Ca ^{2 +.} Successivamente, i miociti isolati sono harvested per filtrazione e centrifugazione della sospensione tessuto. Infine, il Ca ^{2 +} concentrazione nella soluzione di conservazione delle cellule viene modificata gradualmente a 0,2 mM. Discuteremo brevemente il significato di Ca ^{2 +} e Ca ^{2 +} tampone durante il processo di isolamento e anche fornire registrazioni rappresentativi di potenziali d'azione e correnti di membrana, entrambi insieme con contestuale Ca ^{2 +} misure di transienti, eseguita in questi miociti isolati.

Introduzione

Studiare le proprietà elettrofisiologiche dei canali ionici cardiaci con la tecnica del patch-clamp e l'esplorazione di cellulare Ca ^{2 +} di movimentazione anomalie richiedono cardiomiociti isolati. Questi sono solitamente ottenuti dopo l'esposizione in vitro di campioni di tessuto cardiaco di enzimi digestivi (collagenasi, ialuronidasi, peptidasi ecc). Dal momento che il primo rapporto di isolamento di miociti cardiaci vitali nel 1955 ² una grande quantità di protocolli è stato sviluppato al fine di raccogliere singoli cardiomiociti atriali e ventricolari da specie diverse, tra cui topo, ratto, coniglio, cane, cavia e umani. In questa recensione ci concentriamo su isolamento dei miociti atriali umani. Per quanto riguarda le procedure di isolamento dei miociti da altre specie ci si riferisce al "Worthington Tissue guida dissociazione" fornito da Worthington Biochemical Corp., USA ( www.tissuedissociation.com ).

protocolli di isolamento miociti atriali umani sono generalmente derivati dal metodo descritto da Bustamante, et al. ³ Qui forniamo una descrizione step-by-step di una tecnica, che è tratto da un metodo pubblicato in precedenza, al fine di ottenere miociti atriali adatte non solo per gli esperimenti patch clamp ma anche per simultanei ^{Ca2 +} intracellulare misurazioni. ^4-11

Protocollo

Protocolli sperimentali devono essere approvati dal comitato etico locale e tutti i pazienti hanno bisogno di dare un consenso informato scritto. La nostra ricerca è stato approvato dal Comitato Etico della Facoltà di Medicina di Mannheim, Università di Heidelberg (# 2011-216n-MA) ed è stata eseguita in conformità a tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. Tutti i pazienti hanno dato consenso informato scritto.

0. Ottenere umana tessuto atriale

Durante le procedure di incannulazione routine in pazienti sottoposti a chirurgia a cuore aperto per bypass cardiopolmonare innesto la punta del diritto appendice atriale è solitamente rimosso e può essere utilizzato per l'isolamento di cardiomiociti atriali. Dopo l'asportazione del campione di tessuto viene trasferito immediatamente in un tubo da 50 ml Falcon con sterile Ca ^{2 +} senza soluzione di trasporto contenente 2,3-butanedione monoxime (tabella I, BDM, inibitore contrattile, impedendo miociti contracture). Con i tempi di trasporto tra i 30 ei 45 minuti, non abbiamo riconosciamo un chiaro vantaggio di raffreddamento o di ossigenazione per quanto riguarda sia il numero e la qualità dei isolate cardiomiociti atriali. In generale, il trasporto al laboratorio deve essere il più velocemente possibile. Tuttavia, se tragitto lungo, non può essere evitato, trasporto a 4 ° C in soluzione ossigenata potrebbe essere vantaggiosa.

1. Predisposizioni

Accendere il thermocirculator, che controlla la temperatura del becher incamiciata (Tabella II). Assicurarsi che la temperatura all'interno del bicchiere equivale a 37 ° C. Coprire il becher con un coperchio di vetro per mantenere una temperatura costante all'interno del becher in tutto il processo di isolamento.
Pesare il Collagenasi I e proteasi XXIV in tre bicchieri di vetro e conservarla a temperatura ambiente. Gli enzimi saranno diluiti prima dell'uso.
Conservare 20 ml di Ca ^{2 +} soluzione gratuita in una capsula di Petri a 4 ° C.
Negozio 250 ml di Ca ^{2 +} soluzione libera in un bagno d'acqua a 37 ° C.

2. Pulizia del Tissue

Trasferire il campione di tessuto insieme alla soluzione di trasporto in una capsula Petri (~ 10 cm di diametro) e rimuovere il tessuto adiposo all'incirca usando forbici.
Pesare il campione di tessuto. Tra 200 e 600 mg sono utilizzati per l'isolamento delle cellule. Il restante tessuto può essere congelato in azoto liquido per la successiva analisi biochimica.
Trasferire il campione di tessuto nella capsula di Petri contenente 20 ml di Ca ^{2 +} soluzione a 4 ° C (vedi punto 1.3) e tritare il campione di tessuto in piccoli pezzi di circa 1 mm ³ di dimensione.
Le seguenti operazioni devono essere eseguite a 37 ° C e sotto la continua emissione di gas con il 100% O _2. Una punta di pipetta può essere posizionato sul tubo ossigeno ad evitare forti bubbling e generare il flusso d'aria continuo.
Trasferire i pezzi di tessuto insieme alla soluzione ^{2 +-libero} in Caper il bicchiere con guaina e mescolate con cura per circa 3 minuti con un agitatore magnetico.
Smettere di mescolare e lasciare i pezzi di tessuto di stabilirsi per qualche secondo. Colare attenzione il surnatante con una rete di nylon (200 micron, tabella II). Restituire i pezzi di tessuto trattenuto dalla maglia nel bicchiere con pinze.
Riempire il bicchiere con Ca ^{2 +} soluzione gratuita e ripetere la fase di lavaggio 2.4 e 2.5 due volte.

3. Prima digestione enzimatica

Risospendere i pezzi di tessuto con 20 ml di soluzione enzimatica E1 (Tabella I) contenente collagenasi e proteasi e mescolate con cura per 10 min.
Aggiungere 40 ml di 10 mM CaCl _2-soluzione per ottenere una concentrazione finale di 20 mM Ca ^{2 +.}
Dopo 35 min forzerebbe il surnatante con cura attraverso una maglia di nylon (200 micron, tabella II) in un modo che la maggior parte dei pezzi di tessuto rimangono nel becher. Resto Ritornopiovuto pezzi di tessuto dalla maglia nel bicchiere.

4. Seconda digestione enzimatica

Sospendere di nuovo i pezzi di tessuto con 20 ml di soluzione di enzima E2 contenente collagenasi ho solo (Tabella I). Aggiungere 40 ml di 10 mM CaCl _2-soluzione immediata per ottenere una concentrazione finale di 20 mM Ca ^{2 +.}
Durante il secondo uso forbici digestione di tagliare ulteriormente i coaguli di tessuto di tanto in tanto.
Dopo 5 min prendere un campione con una pipetta Pasteur controlla la dissociazione delle cellule. Ripetere questa operazione ogni 2-3 minuti fino a quando appaiono a forma di bastoncello, cardiomiociti striati.
Smettere di mescolare e lasciare i pezzi di tessuto di stabilirsi per circa 20-30 sec.
Filtrare il surnatante con cura attraverso una rete di nylon (200 micron, tabella II) in una provetta da 50 ml Falcon (metro A). Restituire i pezzi di tessuto trattenuto dalla maglia nel bicchiere.
Risospendere i pezzi di tessuto nel bicchiere con 20 ml Storage soluzione (Tabella I) ¹⁰ e di dissociare ulteriormente le cellule dolce triturazione meccanica utilizzando un 20 ml pipetta sierologica con dispenser. Cercate di evitare la formazione di bolle in quanto le bolle sono dannose per la sopravvivenza delle cellule e di qualità.
Filtrare il surnatante con cura attraverso una rete di nylon (200 micron, la tabella II) in un tubo ml Falcon 50 (metro B).

5. Preparazione finale e regolazione di Finale Ca ^{2 +} Concentrazione

Centrifugare sia Falcon tubi A e B (vedi punto 4.5 e 4.7) a 95 g per 10 min.
Rimuovere il surnatante da entrambi i tubi con attenzione per aspirazione. Fare attenzione a non disturbare il pellet. Scartare il surnatante.
Risospendere pellet in entrambe le soluzione di storage da 1,5 ml (Tabella I) ogni (temperatura ambiente).
Aggiungere due volte 7,5 ml di 10 mM CaCl ₂ soluzione per ogni Falcon e mescolate con cura. Incubare per 10 minuti dopo ogni passaggio.
Aggiungere 15 ml di 10 mM di soluzione di CaCl ₂ per ottenere una finale Ca ^{2 +} concentrazione di 0,2 mM.

6. Caricamento dei miociti con lo fluorescente Ca ^{2 +-Indicatore} Fluo-3 AM (Figura 1)

Trasferire 1,5 ml di sospensione cellulare (tubo A e / o il tubo B) in una provetta per microcentrifuga da 2 ml (provetta Eppendorf).
Le seguenti operazioni devono essere eseguite e considerando la sensibilità alla luce del Ca ^{2 +} indicatore fluorescente Fluo-3.
Sciogliere 50 mg della membrana permeabile derivato estere acetossimetilico di Fluo-3 (Fluo-3 AM, Tabella III) in 44 microlitri della Pluronic F-127 (Tabella III) soluzione madre (20% w / v in DMSO anidro) per ottenere ± 1 mm Fluo-03:00 soluzione madre, che può essere conservato a -20 ° C per un massimo di 1 settimana.
Aggiungere 15 microlitri della Fluo-03:00 soluzione madre alla provetta contenente 1,5 ml di sospensione cellulare (vedi punto 6.1) e agitareattentamente.
Incubare la sospensione cellulare per 10 min in una scatola otticamente opaca.
Centrifugare brevemente a circa 6.000 giri al minuto.
Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 1,5 ml di soluzione del bagno (Tabella IV).
Lasciare la sospensione cellulare per circa 30 min per de-esterificazione prima di iniziare con gli esperimenti.

7. Simultanei patch-clamp e epifluorescente Ca ^{2 +} Misure

Dal momento che le misurazioni di patch-clamp non sono l'argomento principale di questa recensione, rimandiamo il lettore interessato ad altre pubblicazioni che forniscono una descrizione più approfondita di questa tecnica. ^11-14 Per completezza forniamo una breve sintesi di un protocollo per misurare potenziali d'azione o di tipo L Ca ^{2 +} correnti, entrambi con simultanei Ca ^{2 +-registrazioni} transitori.

Durante gli esperimenti miociti sono superfuse a 37 ° C con bagno solutisu (tabella IV) utilizzando un sistema di perfusione rapido (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Per gli esperimenti di tensione-clamp, K ⁺ correnti vengono bloccati aggiungendo 4-aminopiridina (5 mmol / L) e BaCl ₂ (0,1 mmol / L) alla soluzione del bagno. Microelettrodi di vetro borosilicato sono utilizzati e dovrebbero avere la mancia resistenze di 2-5 MW, quando riempita con pipetta soluzione (Tabella V). Oltre al Fluo-03:00 caricando dei miociti (vedere fase 6), Fluo-3 è anche incluso nella soluzione pipetta (Tabella V). Fluorescenza è eccitato a 488 nm e la luce emessa (<520 nm) convertito [Ca ^{2 +]} _i supponendo

figure-protocol-1

dove k _d = costante di dissociazione di Fluo-3 (n 864M), F = Fluo-3 fluorescenza. F _max = Ca ^{2 +-fluorescenza} saturo ottenuto al termine di ogni esperimento ¹² Entrambi i segnali elettrici e epifluorescente Ca ^{2 +} segnali vengono registrate contemporaneamente. I potenziali d'azione sono stimolate a 0,5 Hz in modalità current-clamp con 1 msec attuali impulsi di forza soglia 1.2x. L-tipo Ca ^{2 +-correnti} sono misurati in modalità voltage-clamp utilizzando un potenziale di mantenimento di -80 mV e 100 msec-ramp-impulso a -40 mV per inattivare la rapida Na ^+-corrente, seguito da un 100-msec test-impulso a +10 mV a 0,5 Hz.

Risultati

Figura 2A mostra tre esempi rappresentativi di isolati miociti atriali diritto umano. Per quantificare il rendimento delle cellule abbiamo pipetta 10 ml di sospensione cellulare (passo 5.5) su un vetrino da microscopio CellFinder ( http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html ). Produzioni di cellule mediata della figura 2B indicano chiaramente che vi è una tendenza a produzioni di cellule inferiori in FA cronica (CAF) campioni di pazienti (tubo A: 16.5 ± 3.1 cells/10 microlitri (n = 29) vs 5.1 ± 2.3 cells/10 microlitri (n = 10) in SR e Caf, rispettivamente, p <0,05; tubo B: 17.9 ± 3.9 cells/10 ml (n = 29) vs 5.9 ± 2.0 cells/10 ml (n = 9) in SR e Caf, rispettivamente, p = 0,107).

Esempi rappresentativi di azione-potenziali misurazioni e registrazioni simultanee di Ca ^{2 +} citosolico transienti sono riportati nella figura 3. In circa il 90% delle cellule indagati, tha azione-potenziale-triggered Ca ^{2 +} rilascio provoca chiare e regolari contrazioni delle cellule. Come riportato in precedenza, il potenziale di membrana a riposo, che è un indicatore accettato per l'integrità delle cellule, in media circa -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 miociti / pazienti) e -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 miociti / pazienti ) in SR e Caf, rispettivamente (p> 0,05). ¹⁵ La figura 4 mostra le registrazioni rappresentative simultanee di voltaggio-dipendenti di tipo L di Ca ^{2 +} correnti e Ca ^{2 +} citosolico transienti. Applicazione del non selettivo β-adrenergici isoprenalina agonista (1 mM) aumenta ampiezze di entrambi I _{Ca, L} e Ca ^{2 +} citosolico transitori, suggerendo intatta β-adrenergico cascata di trasduzione del segnale.

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Figura 1. Diagramma di flusso dei miociti Fluo-03:00 caricando protocollo (vedi passo 6,1-6,5). m / v, massa / volume.

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Figura 2. A, con separazione dei diritti umani miociti atriali dopo un'ora in una soluzione di archiviazione. B, Media ± SEM della produzione di cellule contate in 10 ml di cellule in soluzione di conservazione (vedi punto 5.5). n si riferisce al numero di preparati di ciascun gruppo. * P <0.05.

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Figura 3. Registrazioni rappresentative di azione-potenziale-triggered Ca ^{2 +} transitori (CAT) in uno dei miociti atriali da un ritmo sinusale e un chronic paziente fibrillazione atriale. Top: corrente iniettata membrana (I _M) utilizzato per la stimolazione (0,5 Hz). Sotto: Registrazione simultanea di potenziale di membrana (V _M), e il gatto scatenato (in basso). (Rappresentato nuovamente con il permesso di Voigt et al. 2012) ¹⁵

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Figura 4. Registrazioni rappresentativi del (1 mM) effetto isoprenalina su L-tipo Ca ^{2 +} corrente attivata da Ca ^{2 +} transitori (CAT) in uno dei miociti atriali da un ritmo sinusale e un paziente fibrillazione atriale cronica. Top: tensione-clamp protocollo (0,5 Hz). Sotto: Registrazione simultanea di membrana totale netta corrente (I _M), riflettendo prevalentemente di tipo L Ca ^{2 Cat. +} corrente (al centro) e attivato (in basso). (Rappresentato nuovamente con il permesso di Voigt,et al. 2012) ¹⁵

figure-results-5
Tabella I. Solutions.

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Tabella II. Attrezzature specifiche.

figure-results-7
Tabella III. Sostanze per il carico dei miociti con Fluo-3 AM.

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Tabella IV. Soluzione del bagno di patch-clamp.

figure-results-9
Tabella soluzione Pipetta V. per patch-clamp *.

Discussione

Qui si descrive un metodo per l'isolamento di miociti atriali umane da appendici atriali giuste ottenute da pazienti sottoposti a chirurgia a cuore aperto. Per poter utilizzare questi miociti per misure di Ca ^{2 +} citosolico abbiamo adattato un metodo precedentemente descritto ^4-11 omettendo dell'EGTA dalla soluzione di storage.

Già nel 1970 si è osservato che, sebbene miociti dissociano in presenza di Ca ^{2 +} durante la digestione, tutti erano in contrattura e non vitali. ^16,17 Pertanto, isolamento cellulare è eseguita in Ca ^{2 +-soluzione} libera. Tuttavia, la reintroduzione di concentrazioni fisiologiche di Ca ^{2 +} comportato rapida Ca ^{2 +} afflusso e la morte cellulare. Questo è stato descritto come il Ca ^{2 +} fenomeno paradosso originariamente osservata nei cuori perfusi da Zimmerman e Hulsman. ¹⁸ Le modifiche dei terreni di isolamento tra cui la riduzione del pH a 7,0, ^{19 aggiunta di taurina ²⁰ o di piccole quantità di Ca ^{2 +} (vedi punto 3.2 e 4.1), ²¹ come pure la memorizzazione dei miociti isolati in dell'EGTA contenenti storage-soluzione ²² sono state proposte per evitare che il Ca ^{2 +} paradosso. ¹⁷ Tuttavia, è ben noto che Ca ^{2 +} attraverso bufferizzazione EGTA riduce l'ampiezza di tipo L Ca ^{2 +} corrente indotta Ca ^{2 +} transitori ampiezze e comporta un decadimento delle bifasica Ca ^{2 +} transitori. ²³ Pertanto, abbiamo omesso EGTA durante l'intero processo di isolamento per ottenere Ca ^{2 +} transitori con proprietà tipiche e decadimenti monofasici. Per proteggere le cellule dal Ca ^{2 +} paradosso abbiamo aumentato la finale Ca ^{2 +} concentrazione della soluzione di stoccaggio in modo graduale fino a 0,2 mM.}

La scelta di collagenasi è probabilmente la fase più critica per il successo isolamento dei miociti. Coll convenzionaleagenases sono preparazioni grezze ottenute da Clostridium histolyticum e contengono collagenasi oltre ad una serie di altre proteinasi, polysaccharidases e lipasi. Sulla base delle loro collagenasi generali di composizione sono suddivise in diverse tipologie. Worthington ²⁴ Tipi collagenasi I e II sono stati utilizzati con successo per l'isolamento dei miociti atriali umani. ^{4-10,15,25-30} Nel nostro protocollo attualmente descritto si consiglia l'uso di collagenasi tipo I, anche se siamo stati anche in grado di ottenere quantità accettabili di cellule vitali mediante collagenasi di tipo II. Tuttavia, anche all'interno di un unico tipo collagenasi vi è una significativa variazione da lotto a lotto sulle attività enzimatiche. Queste variazioni richiedono un'attenta selezione del lotto e la sperimentazione di vari lotti per ottimizzare la procedura di isolamento. Lo strumento a disposizione batch selezione on-line da Worthington Biochemical Corp. ( http://www.worthington-biochem.com / cls / match.php) può essere usato per trovare batch disponibili con una composizione che ha dimostrato di essere adatto per l'isolamento di miociti atriali umani. Attualmente usiamo collagenasi di tipo I con 250 U / mg attività collagenasi, 345 U / mg attività caseinase, 2.16 U / mg attività clostripain e 0.48 U / mg attività trittico (lotto # 49H11338).

Le cellule ottenute utilizzando la procedura descritta in questo manoscritto possono essere utilizzati entro 8 ore per studi di patch-clamp, Ca ^{2 +} transitori misurazioni e una combinazione di entrambi. ¹⁵ Inoltre, queste cellule consentono misure di contrazione cellulare in risposta alla stimolazione del campo elettrico o stimolazione elettrica usando la pipetta di patch-clamp (osservazioni non pubblicate).

Dichiarazioni

Worthington Biochemical Corp. sostenuto questa pubblicazione per coprire i costi di produzione di file video. I finanziatori non aveva alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

Ringraziamenti

Inoltre, ringraziamo i cardiochirurghi dell'Università di Heidelberg per la fornitura di tessuto atriale umano e Claudia Liebetrau, Katrin Kupser e Ramona Nagel per l'eccellente supporto tecnico. Un ringraziamento speciale anche a Andy W. Trafford per i suoi utili suggerimenti e consigli durante la creazione dei Ca ^{2 +} misure transitorie. Gli autori desiderano esprimere la loro gratitudine più profonda per i membri del Dipartimento di Farmacologia e Tossicologia (testa: Ursula Corvi) del Dresden University of Technology per l'opportunità che ci hanno offerto di apprendere le tecniche di base e le competenze in elettrofisiologia cellulare e l'isolamento dei cardiomiociti.

Ricerca degli autori è sostenuta dal tedesco Research Foundation (Do769/1-1-3), il ministero federale tedesco dell'Istruzione e della ricerca attraverso la Fibrillazione Atriale Rete di competenza (01Gi0204) e il Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare, l'Unione europea attraverso l'EuRete pea per la ricerca traslazionale nella fibrillazione atriale (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, progetto di integrazione di grandi dimensioni, Proposta N. 261057) e l'europeo-nordamericano Atrial Fibrillation Research Alliance (ENAFRA) concessione di Fondation Leducq (07CVD03).

La panoramica schematica mostrata nel file video è stato prodotto usando Servier arte medica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
			Soluzione di trasporto
Albumina	Sigma-Aldrich	A3059	Soluzione di conservazione: 1%
BDM	Sigma-Aldrich	31550	Soluzione di trasporto: 30
DL-b-idrossi-b-butirrico	Sigma-Aldrich	H6501	Soluzione di conservazione: 10
Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270	Soluzione di trasporto: 20 Soluzione priva di Ca2+: 20 Soluzione enzimatica E1 ed E2: 20 Soluzione di conservazione: 10
Acido L-glutammico	Sigma-Aldrich	G1251	Soluzione di conservazione: 70
KCl	Merck	1049360250	Soluzione di trasporto: 10 Soluzione priva di Ca2+: 10 Soluzione enzimatica E1 ed E2: 10 Soluzione di conservazione: 20
Kh2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	Soluzione di trasporto: 1,2 Soluzione priva di Ca2+: 1,2 Soluzione enzimatica E1 ed E2: 1,2 Soluzione di conservazione: 10
MgSO4	Sigma-Aldrich	M9397	Soluzione di trasporto: 5 Soluzione priva di Ca2+: 5 Soluzione enzimatica E1 ed E2: 5
MOPS	Sigma-Aldrich	M1254	Soluzione di trasporto: 5 Soluzione priva di Ca2+: 5 Soluzione enzimatica E1 ed E2: 5
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Soluzione di trasporto: 100 Soluzione priva di Ca2+: 100 Soluzione enzimatica E1 ed E2: 100
Taurina	Sigma-Aldrich	86330	Soluzione di trasporto: 50 Soluzione priva di Ca2+: 50 Soluzione enzimatica E1 ed E2: 50 Soluzione di conservazione: 10
Collagenasi I	Worthington	4196	Soluzione enzimatica E1 ed E2: 286 U/ml
Proteasi XXIV	Sigma-Aldrich	P8038	Soluzione enzimatica E1 ed E2: 5 U/ml*
pH			Soluzione di trasporto: 7,00 Soluzione priva di Ca2+: 7,00 Soluzione enzimatica E1 ed E2: 7,00 Soluzione di conservazione: 7,40
aggiustato con			Soluzione di trasporto: NaOH 1 M Soluzione priva di Ca2+: NaOH 1 M Soluzione enzimatica E1 ed E2: NaOH 1 M Soluzione di conservazione: KOH 1 M
Concentrazioni espresse in mM se non diversamente indicato. BDM, monossima del 2,3-butanedione. *La proteasi XXIV è inclusa solo nella soluzione enzimatica E1.
Tabella I. Soluzioni.


Maglia di nylon (200 μm)	VWR-Germania	510-9527
Beccherino a doppia parete	VWR	KT317000-0050
Tabella II. Attrezzature specifiche.


Dimetil solfossido	Sigma-Aldrich	D2650
Fluo-3 AM (confezione speciale)	Invitrogen	F-1242
Pluronic F-127	Invitrogen	P6867
Tabella III. Sostanze per il caricamento dei miociti con Fluo-3 AM.


4-aminopiridina*	Sigma-Aldrich	A78403	Soluzione di bagnatura: 5
BaCl2*	Sigma-Aldrich	342920	Soluzione di bagnatura: 0,1
CaCl2 × 2H2O	Sigma-Aldrich	C5080	Soluzione di bagnatura: 2
Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270	Soluzione di bagnatura: 10
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Soluzione di bagnatura: 10
KCl	Merck	1049360250	Soluzione di bagnatura: 4
MgCl × 6H2O	Sigma-Aldrich	M0250	Soluzione di bagnatura: 1
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	Soluzione di bagnatura: 140
Probenecid	Sigma-Aldrich	P8761	Soluzione di bagnatura: 2
pH			Soluzione di bagnatura: 7,35
aggiustato con			Soluzione di bagnatura: HCl 1 M
Tabella IV. Soluzione di bagnatura per il patch-clamp. *4-aminopiridina e BaCl sono inclusi solo negli esperimenti di voltage-clamp.


Sale potassico del DL-aspartato	Sigma-Aldrich	A2025	Soluzione per pipetta: 92
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	Soluzione per pipetta: 0,02
GTP-Tris	Sigma-Aldrich	G9002	Soluzione per pipetta: 0,1
HEPES	Sigma-Aldrich	H9136	Soluzione per pipetta: 10
KCl	Merck	1049360250	Soluzione per pipetta: 48
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Soluzione per pipetta: 1
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383	Soluzione per pipetta: 4
Fluo-3**	Invitrogen	F3715	Soluzione per pipetta: 0,1
pH			7,20
aggiustato con			KOH 1 M
*Tabella V. Soluzione per pipetta per patch-clamp.** Nei giorni dell’esperimento, la soluzione per pipetta viene conservata sul ghiaccio fino all’uso. *Il Fluo-3 viene aggiunto da una soluzione madre 1 mM nei giorni dell’esperimento.

Riferimenti

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