Articolo metodologico

Ex utero elettroporazione e Espianti intero emisfero: un semplice metodo sperimentale per gli studi del primo sviluppo corticale

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DOI:

10.3791/50271

⸱

3 aprile 2013

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Physiology, SUNY Upstate Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un procedimento di espianto che coinvolge Ex utero Elettroporazione, la dissezione e la cultura di interi emisferi cerebrali dal mouse embrionale. La preparazione facilita studi farmacologici e analisi della funzione del gene durante le prime fasi dello sviluppo corticale.

Abstract

Sviluppo corticale comporta complesse interazioni tra neuroni e non neuronali elementi, comprese le cellule precursori, i vasi sanguigni, le meningi e relativi matrice extracellulare. Perché offrire un ambiente appropriato organotipica, espianti fetta corticali sono spesso usati per studiare le interazioni che controllano la differenziazione neuronale e lo sviluppo. Anche se utile, il modello di espianto fetta possono soffrire di inconvenienti tra cui aberrante laminazione cellulare e la migrazione. Qui riportiamo un intero sistema cerebrale espianto emisfero per gli studi di primo sviluppo corticale che è più facile da preparare rispetto fettine corticali e spettacoli coerenti migrazione organotipica e laminazione. In questo sistema modello, laminazione precoce e modelli di migrazione procedere normalmente per un periodo di due giorni in vitro, compreso il periodo della scissione preplate, durante il quale prospettiva strato corticale sei forme. Abbiamo poi sviluppato un ex elettroporazione in utero (EUEP)approccio che ottiene un successo ~ 80% in termini di orientamento espressione GFP ai neuroni in via di sviluppo nella corteccia dorsale mediale.

L'intero modello di espianto emisfero corticale rende sviluppo precoce accessibili per l'elettroporazione, l'intervento farmacologico e approcci di imaging dal vivo. Questo metodo evita l'intervento chirurgico sopravvivenza richiesto in utero elettroporazione (IUEP) approcci, migliorando sia la trasfezione e areale coerenza targeting. Questo metodo faciliterà studi sperimentali neuronale proliferazione, migrazione e differenziazione.

Introduzione

Le forme di mammifero attraverso la corteccia cerebrale concertata proliferazione, migrazione e differenziazione dei neuroni successivamente generati. Ogni neurone è nato nella zona ventricolare (VZ) e migra dal VZ nella zona intermedia (IZ), formando la piastra corticale (CP) 1. Come passano attraverso diversi domini corticali, i neuroni migrano visualizzare molteplici modalità di migrazione 2,3 che dipendono dall'ambiente extracellulare e altri elementi cellulari (es glia radiale) all'interno del tessuto di sviluppo. Neuroni corticali quindi arrestare migrazione in alto della piastra di formatura corticale nei processi coincidenti arresto migrazione neuronale e 4 dendritogenesis.

Sviluppo corticale è iniziata tra i giorni embrionali 11-13 (E11-13) 5 tramite la costituzione dello strato primordiale plessiforme 6 o preplate (PP), uno strato di neuroni pionieri che sovrasta il VZ. Potenzialestrato 6 neuroni corticali (cioè i neuroni corticali prima nati nel VZ) poi orientare la loro somata in un modello stereotipato e fondersi in uno strato distinto all'interno del PP 7. Questi eventi dividere il preplate in un superficiale marginale (futuro strato corticale 1) e una zona profonda, quest'ultimo composto da cellule a piastra (strato corticale transitoria 7). Questo processo, chiamato scissione preplate, è un evento fondamentale per la crescita futura della corteccia cerebrale 8.

Molte mutazioni genetiche sono state identificate che inficiano vari aspetti dello sviluppo corticale 9. Sviluppo corticale possono essere influenzate negativamente da esposizione a sostanze tossiche ingerite come la cocaina 10 e alcool 11. Perché malformazioni corticali che si presentano durante lo sviluppo sono tra i probabili disturbi neurologici (autismo es. schizofrenia), indagini empiriche delle perturbazioni allo sviluppo corticale sono inerentily importante. E 'quindi di notevole importanza per stabilire approcci per studiare lo sviluppo corticale che consentono analisi rapide di effetti genetici o tossina, ma che conserva anche le possibili interazioni tra i neuroni di differenziazione, altri tipi di cellule e la matrice extracellulare (ECM) durante questo primo periodo di sviluppo del cervello 12 .

Espianti fetta 13 hanno fornito un tale sistema e sono stati ampiamente utilizzati per saggiare sviluppo corticale neuroni 14-16. Tuttavia, i saggi fetta possono soffrire l'inconveniente che la migrazione neuronale e laminazione può essere anormale 17 forse a causa di danni alle cellule meningee che circondano il cervello in via di sviluppo e ancorare il radiali gliali patibolo. Come le fibre radiali gliali sono un importante substrato per la migrazione dei neuroni corticali 18 interruzione della lamina basale mediante tranciatura può interrompere localmente radiale architettura gliali e portare a alterata migrazione corticale. Inoltre la slisuperfici ced di espianti fornisce una regione di cellule morte che possono alterare la normale composizione della ECM in queste aree.

Approcci più recenti hanno concentrato la loro analisi su cellule trova nel cuore della slice che sono circondati da adeguati tipi di cellule sane e ECM. Tuttavia, in alcuni casi, questi nuovi approcci possono richiedere che l'originale fetta spessa colta essere crio-sezionato o paraffina sezionata dopo fissazione in modo che l'interno relativamente normale della fetta è reso disponibile per l'analisi 19-21. Sia il vibratomo originale sezionamento per preparare le fette diretta cultura nonché la successiva criosezionamento fette fissi per analisi richiede cura e sforzo per questi saggi lavorare.

Per fornire un semplice, approccio complementare allo studio dei primi stadi dello sviluppo corticale, abbiamo modificato una fetta approcci esistenti da 13 a facilitare gli studi di primo sviluppo corticale. Abbiamo sviluppato un whole espianto emisfero modello simile a un modello esistente E14 emisfero che ha coinvolto le culture si stringono a 65 rotazioni al minuto e consentito la crescita organotipica per 16-18 ore 22,23. Nel nostro approccio, espianti emisfero interi sono posti sulla membrana semipermeabile 13 con in un'atmosfera di cultura ossigeno 21,24 estendere organotipica crescita corticale per 48 ore. Questo approccio consente inoltre di elettroporazione coerente di sviluppo neuroni corticali. Gli embrioni vengono rimossi dall'utero e elettroporate introdurre DNA plasmidico e telencefalo viene sezionato. Ogni emisfero è isolato e posizionato lato mediale su un collagene rivestita filtro. L'espianto viene poi coltivata per un periodo di 48 ore, un periodo che comprende splitting preplate 8. Durante il periodo di coltura, L6 neuroni sviluppano da precursore differenziato neurone 25, correttamente posizionata all'interno della piastra corticale. Durante questo periodo in via di svilupponeurone è circondato dalla ECM appropriata e tipi cellulari che confrontano la cella corrispondente in vivo. Questo sistema si è già dimostrato utile nel decifrare gli eventi cellulari che stanno alla base tossicità dell'etanolo 26 strato 6 formazione e preplate scissione 7,25.

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Protocollo

1. Elettroporazioni utero Ex con Expression Proteina Fluorescente Verde Plasmid

  1. Soluzioni di iniezione di DNA plasmidici sono preparati con CAG-eGFP DNA 27 diluito alla concentrazione finale di lavoro di 0,33 mg / ml in DDH 2 O. Qiagen Endo-Free Maxi-Preps sono utilizzati per purificare il plasmide da batteri trasformati. Veloce colorante verde a ~ 0,02% (w / v finale) viene aggiunto alla soluzione di DNA come tracciante iniezione.
  2. Per preparare l'area chirurgica, spruzzare banco e la fase microscopio da dissezione con una soluzione di etanolo al 70% e asciugare. Spruzzare forbici chirurgiche e pinze con il 70% di etanolo prima della dissezione e asciugare.
  3. Timed incinte svizzeri / Webster dighe sono sacrificati su E13 da trasferire in una camera riempita con CO 2 da una bombola sotto pressione e la diga è monitorato fino a quando tutto il movimento si è fermato per almeno 1 min. Dopo il sacrificio da CO 2 inalazione gli embrioni vengono rimossi dall'utero e collocati inuna capsula di Petri contenente 10 centimetri ghiacciata Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS).
  4. Attenzione sezionare ogni embrione dalle membrane che circondano extraembrionali e tenere in ghiaccio-freddo HBSS.
  5. Trasferire ogni embrione singolarmente per un piatto secondo cm 10 Petri contenente HBSS freddo. Utilizzare una siringa Hamilton da iniettare 2-3 microlitri della miscela DNA veloce verde nel ventricolo dell'emisfero cerebrale sinistro, avendo cura di iniettare in una zona corticale spazialmente separata dalla zona corticale per analisi future.
  6. Per electroporate, tenere l'embrione delicatamente con una pinza e leggermente posizionare la paletta positiva dell'elettrodo pinzetta sulla linea mediana dorsale della testa e leggermente posizionare la pala negativo sotto il mento embrione. Elettroporazioni sono conseguiti con un elettroporatore BTX830 programmato per fornire cinque impulsi 30 V della durata di 50 msec, separati da 950 msec. Queste impostazioni sono per il modello BTX830. Altri sistemi possono essere utilizzati secondo INSTRUCTIO produttorens.

2. Tutta la Emisfero Preparazione Espianto

  1. Dopo elettroporazione gli embrioni sono posti di nuovo in gelide HBSS. Il cervello viene rimosso con due N ° 5 pinze gioielliere per rimuovere la pelle e il cranio cartilagineo dalla testa dell'embrione. Una pinza viene quindi fatto scivolare sotto il cervello per rimuovere il cervello intatto dal cranio. L'emisfero elettroporata (sinistra) viene sezionato dal cervello e allegata mesencefalo tessuto viene rimosso. In tutta la procedura di dissezione cura è presa per non danneggiare le meningi sovrastanti l'emisfero sinistro corticale.
  2. Una volta sezionato ogni embrione viene trasferito in HBSS utilizzando una pipetta con un taglio 1 punta ml pipetta. L'emisfero viene espulsa cautamente su un inserto rivestito cultura collagene. Fino a sei espianti emisfero sono disposti lato mediale verso il basso ogni inserto mm 24. Una volta disposti, HBSS eccesso viene rimosso dalla inserto e l'inserto viene quindi posto in uno ben 35 millimetri di un piatto 6 pozzetti. Il pozzo contiene exactly 2,7 ​​ml di media: DMEM-F12 supporti contenenti Glutamax e integrato con il 2% B-27, 1% e l'1% G5 Penicillina-Strep. Alcune gocce di supporti dal pozzo può essere pipettati sopra l'espianto, ma non aggiungere supporti in eccesso rispetto all'originale 2,7 ml per pozzetto.
  3. Una volta che gli espianti sono stati collocati su filtri di collagene il piatto ben 6 contenente gli espianti è collocato in una Rothenberg Billups (BR) camera (che contiene anche un piatto umidificazione di acqua). A 95% / 5% di ossigeno / CO 2 miscela di gas viene infusa nella camera per almeno 1 minuto prima di sigillare la camera di valvola e scollegamento del 95% / 5% di ossigeno / CO 2 tubo di alimentazione del gas. La camera di BR viene quindi posto in un 37 ° C di coltura tissutale incubatore per il resto del periodo di coltura, 1-2 DIV.

3. Fissazione del tessuto Espianto di Istologia

  1. In una cappa aspirante preparare la soluzione di fissazione Pagano dal primo solubilizzante 8 g di paraformaldeide in 100 ml di preriscaldato (~ 80 & deg; C) DDH 2 O. Aggiungere 1-3 gocce di NaOH concentrati per promuovere la solubilizzazione e mescolare delicatamente. Una volta solubilizzato miscelare la soluzione di paraformaldeide 8% 1:1 con una soluzione 500 mM di saccarosio, 100 mM Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM KCl per una concentrazione finale di 4% paraformaldeide in saccarosio 250 mM Hepes 50 mM , 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4.
  2. Per fissare gli espianti riscaldare la soluzione correzione Pagano a 37 ° C. Rimuovere rapidamente la maggior parte dei mezzi di comunicazione DMEM/F12 da ogni cultura bene e aggiungere 5 ml di Fix Pagano in ciascun pozzetto di espianti. Assicurarsi di coprire ogni espianto completamente in correzione. Fix per 1 ora a temperatura ambiente. Non rimuovere espianti dal filtro prima di 1 ora di fissazione.
  3. Dopo fissazione rimuovere la soluzione di fix Pagano e sostituirlo con soluzione Pagano senza correzione (250 mM saccarosio, 50 mM Hepes 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Aggiungere poche gocce di azide di sodio al 10% e conservare a 4 ° C fino incorporamento.

4. Embedding e Sectioning per Istologia

  1. Preparare una soluzione al 10% di gelatina pelle di vitello solubilizzando 10 g di gelatina pelle di vitello in 100 ml di acqua calda (55-60 ° C). Posizionare soluzione di gelatina su una piastra calda regolata a 60 ° C e agitare periodicamente fino solubilizzato.
  2. Versare circa 10 ml di soluzione al 10% di gelatina sul fondo di una capsula Petri da 10 cm e lasciare 30 min a solidificare. Questo formerà un "pad" per l'incorporamento degli espianti. Queste pastiglie possono essere giorni preparati in anticipo e conservati a 4 ° C. Usare un righello per disegnare una griglia sul fondo della scatola di Petri e trasferire espianti individuali in ogni casella della griglia. Rimuovere residui di soluzione di Pagano e l'utilizzo di una pipetta, coprire ogni espianto con caldo soluzione al 10% di gelatina e lasciare solidificare. Riprendere lenta aggiunta di soluzione di gelatina finché ogni espianto è completamente circondato da gelatina, facendo attenzione a non fondere il pad con l'aggiunta di troppo caldo gelatina in una volta. Consentire la gelatina indurire per ~ 1 ora. Una volta indurito il indivigoli espianti possono essere tagliati in piccoli blocchi di gelatina. I blocchi vengono poi post-fissati in Pagano fissare per 24-48 ore prima del sezionamento con un vibratomo.
  3. Espianti in blocchi gelatina sono posizionati bulbo olfattivo e sezionata nel piano coronale a 100 micron di spessore. Le sezioni vengono raccolti e conservati in PBS + sodio azide 0,1% a 4 ° C fino al procedimento immunoistochimica.
  4. Rilevamento immunoistochimico viene eseguita trasferendo sezioni in una piastra a 24 pozzetti (2-3 sezioni per pozzetto). Primo blocco anticorpo non specifico legame aggiungendo 0,5 ml + B PBST (PBS + 0,5% Triton X 100 e 2% BSA) in ogni pozzetto, incubare 1 ora agitando delicatamente. L'anticorpo primario viene quindi diluito in PBST + B e 0,4 ml per pozzetto viene aggiunto incubazione per tutta la notte a RT. Il primario è lavato con PBS 3X lava per almeno 10 minuti ciascuna. L'anticorpo secondario e 2 ug / ml Hoechst 33342 nucleare macchia vengono quindi diluite in PBST + B ed i campioni vengono incubati per 2 ore a RTagitando delicatamente. Tre lavaggi con PBS (10 minuti ciascuna) vengono eseguite e quindi le sezioni sono montati su vetrini con un 90% di glicerolo 50 mM Tris, pH 7,4, mezzi di montaggio.

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Risultati

Il roditore embrionale corteccia presenta un gradiente trasversale neurogenetica per tutto il periodo di sviluppo, in modo tale che neocorteccia laterale è di circa 1 giorno in più maturo di dorsale mediale neocorteccia 28. Il grosso strato 6 neuroni sono così generata (cioè esporre loro finale fase S) sulla E12 in corticale laterale (anche chiamato Campo 40 5) e alla E13 nella corteccia dorsale mediale (anche chiamato Campo 1 5). Splitting Preplate inizia circa 1 giorno dopo La...

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Discussione

Abbiamo migliorato e valutato un modello sperimentale - espianti tutto l'emisfero - per lo studio delle prime fasi dello sviluppo corticale (E13-E15). Il modello si è dimostrato utile per l'analisi della migrazione e differenziazione del lignaggio neurone eccitatorio che costituisce lo strato 6 della corteccia cerebrale 25,37. I principali vantaggi del sistema sono 1) la crescita organotipica per 2 DIV, 2) la semplicità di preparazione, e 3) accesso sperimentale alle neuroni per elettroporazione, mani...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NINDS (NS066071) e il NIAAA. (P50AA017823) a ECO. Gli autori ringraziano il Dr. Robert Quinn e il personale del Dipartimento delle Risorse Animali di laboratorio per la cura degli animali. Ringraziamo Judson Belmont per il supporto tecnico, Nicole Belletier di assistenza, come Fellow Undergraduate Research Estate (SURF). Ringraziamo anche il dottor David Cameron per i commenti e le modifiche in una versione precedente del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti
DMEM/F12 + GlutaMAXGIBCO10565
G5 Integratore 100XInvitrogen17503-012
B27 Senza siero Suppl. 50XInvitrogen1504-044
Pen / Strep Liquid 100XInvitrogen15140-122
HBSS 500 mlGIBCO14025
Inserto di coltura rivestito di collagene Costar3492
Gelatina per pelli bovine SigmaG9382
H– chst 33342InvitrogenH1399
Albumina di siero bovinoSigma7906
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362<
strong>Equipment
BTX 830 ElettroporatoreHarvard Apparatus450052
Elettrodi pinzette 10mmHarvard Apparatus450166
IncubatriceBillups RothenbergMIC-101
Siringa Hamilton (5uL)Hamilton87930
Ago per siringa HamiltonHamilton7803-04Specificare 1" e stile 4
Dumont #5 PinzeFST11251-10
Forbici fini Taglio duro 9 cmFST14058-09

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