Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

Sommario

Qui si descrive l'isolamento di cardiomyoctyes adulte di topo mediante un sistema di perfusione Langendorff. Le cellule risultanti sono Ca2 +-tolerant, elettricamente quiescente e può essere colta e trasfettate con-adeno o lentivirus per manipolare l'espressione genica. La loro funzionalità può anche essere analizzato con il sistema MMSYS e tecniche di patch clamp.

Abstract

L'uso di cardiomiociti primari (CMS) in cultura ha fornito un potente complemento modelli murini di malattie cardiache nelle avanzare la nostra comprensione di malattie cardiache. In particolare, la capacità di studiare l'omeostasi di ioni, la funzione del canale ionico, eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazione e loro alterazioni in condizioni malate e da mutazioni patogenetiche hanno portato a intuizioni significative sulle malattie cardiache. Inoltre, la mancanza di una linea cellulare adeguata immortalato per imitare adulti CM, e le limitazioni della neonatale CM (che mancano molti dei biomeccanica caratteristica strutturale e funzionale degli adulti CMS) in coltura hanno ostacolato la nostra comprensione della complessa interazione tra le vie di segnalazione, canali ionici e le proprietà contrattili del cuore adulto rafforzare l'importanza di studiare adulte isolate cardiomiociti. Qui vi presentiamo i metodi per l'isolamento, la cultura, la manipolazione dell'espressione genica da adenovirus-espresproteine ​​ssed, e la successiva analisi funzionale dei cardiomiociti dal topo adulto. L'uso di queste tecniche vi aiuterà a sviluppare la comprensione meccanicistica in vie di segnalazione che regolano l'eccitabilità cellulare, Ca ^{2 +} dinamiche e contrattilità e di fornire una caratterizzazione molto più fisiologicamente rilevanti di malattie cardiovascolari.

Introduzione

Modelli murini di malattie cardiovascolari sono serviti come strumenti efficaci per chiarire i meccanismi fondamentali di malattia ^1,2 e per identificare potenziali obiettivi terapeutici ^1,3. In particolare, l'utilizzo di entrambi i modelli murini di malattia cardiaca acquisita (per esempio pressione sovraccarico) ^4,5 e modelli di topi transgenici hanno avanzato la nostra comprensione di malattie cardiache ^6-8. L'uso di tecniche di coltura cellulare per studiare cascate di segnalazione ^3,9,10 e alterazioni in singole proteine ​​che sono alla base eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazi....

Protocollo

1. Cardiomiociti Isolamento

Materiali (Figura 1)

Microdissecting forcipe
Pinze dei tessuti
Pinze emostatiche delicate
Pinza emostatica
Microdissecting, seghettati, pinze curve
Forbici operative, dritto
Forbici operative, curvo
15 ml provette Falcon (5)
60 millimetri capsula di Petri
Soluzione tampone fosfato (PBS)
Nylon Mesh - dimensione 400 micron pori
Piccolo imbuto
Cera rivestito, intrecciato di seta 4-0, 19 millimetri, 7-10 cm di lunghezza
Non ago-ipodermico, punta smussata, 24 G o commerciale animale-....

Risultati

L'isolamento di adulti cardiomyoctyes risultati nelle cellule a forma di bastoncello, striati, e quiescenti (non spontaneamente battere) (Figura 5A). Le cellule morte guarderanno arrotondate e senza striature saranno presenti. Cellule quiescenti possono essere coltivate e trasfettate con adenovirus per manipolare l'espressione genica (figure 5B e 5C). Dopo 24 ore di coltura, la morfologia delle cellule vive non cambia, sono ancora Ca ^{2 +-tolerant,} e p.......

Discussione

In questo rapporto, abbiamo descritto le tecniche necessarie per l'isolamento di successo e la cultura degli adulti CM dal cuore mouse. La nostra tecnica consente successivo studio della funzione CM e l'eccitabilità con i metodi sopra descritti. Il parametro critico per studiare la funzionalità di adulto CMS è la salute e la qualità della isolato CM. Come descritto sopra, le nostre tecniche consentono un elevato rendimento di cellule funzionali che sono suscettibili di manipolazione dell'espressione genica u.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloruro di sodio	Sigma	S7653
Cloruro di potassio	Sigma	P9333
Cloruro di magnesio	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Fosfato di sodio monobasico	Sigma	S8282
D-glucosio minimo	Sigma	G8270
Taurina	Sigma	T0625
2,3-Butandione monoxime	Sigma	B0752
Collagenasi B	Roche Applied Science	11088807001
Collagenasi D	Roche Applied Science	11088858001
Proteasi XIV da Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumina da siero bovino	Sigma	A2153
Cloruro di calcio	Sigma	C8106
Terreno essenziale minimo	Sigma	51411C
Soluzione di albumina da siero bovino	Sigma	A8412
L-glutammina	Sigma	G3126
Penicillina-Streptomicina	Sigma	P4333
Terreni di selenito di sodio supplemento	Sigma	I1884
Cloruro di cesio	Sigma	289329
Glutammato	Sigma	G3291
Adenosina 5'-trifosfato sale di magnesio	Sigma	A9187
Glicole etilenico-bis(2-ammina– acido tetraacetico	Sigma	E3889
Soluzione di idrossido di cesio	Sigma	232041
Soluzione di idrossido di tetraetilammonio	Sigma	86643
Visiera binoculare in vetro ottico OptiVisor	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Pinze per tessuti, 5,5", 1x2 denti	Roboz Scientific	RS-8164
Pinze Moloney - 4,5" (11,5 cm) di lunghezza, seghettate	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Pinze, Dumostar, dimensioni della punta 0,17 x 0,10 mm	Roboz Scientific	RS-4966
Packer Mosquito Pinze 5" Dritte Piatte	Roboz Scientific	RS-7114
Forbici per micro dissezione 4.5" Curvo Affilato/Affilato	Roboz Scientific	RS-5917
Forbici per micro dissezione 3.5" Dritto Affilato/Affilato20mm	Roboz	Scientific RS-5907