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Articolo metodologico

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

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⸱

DOI:

10.3791/50289

⸱

24 settembre 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Institute, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Division of Cardiology, Sapienza University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui si descrive l'isolamento di cardiomyoctyes adulte di topo mediante un sistema di perfusione Langendorff. Le cellule risultanti sono Ca2 +-tolerant, elettricamente quiescente e può essere colta e trasfettate con-adeno o lentivirus per manipolare l'espressione genica. La loro funzionalità può anche essere analizzato con il sistema MMSYS e tecniche di patch clamp.

Abstract

L'uso di cardiomiociti primari (CMS) in cultura ha fornito un potente complemento modelli murini di malattie cardiache nelle avanzare la nostra comprensione di malattie cardiache. In particolare, la capacità di studiare l'omeostasi di ioni, la funzione del canale ionico, eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazione e loro alterazioni in condizioni malate e da mutazioni patogenetiche hanno portato a intuizioni significative sulle malattie cardiache. Inoltre, la mancanza di una linea cellulare adeguata immortalato per imitare adulti CM, e le limitazioni della neonatale CM (che mancano molti dei biomeccanica caratteristica strutturale e funzionale degli adulti CMS) in coltura hanno ostacolato la nostra comprensione della complessa interazione tra le vie di segnalazione, canali ionici e le proprietà contrattili del cuore adulto rafforzare l'importanza di studiare adulte isolate cardiomiociti. Qui vi presentiamo i metodi per l'isolamento, la cultura, la manipolazione dell'espressione genica da adenovirus-espresproteine ​​ssed, e la successiva analisi funzionale dei cardiomiociti dal topo adulto. L'uso di queste tecniche vi aiuterà a sviluppare la comprensione meccanicistica in vie di segnalazione che regolano l'eccitabilità cellulare, Ca 2 + dinamiche e contrattilità e di fornire una caratterizzazione molto più fisiologicamente rilevanti di malattie cardiovascolari.

Introduzione

Modelli murini di malattie cardiovascolari sono serviti come strumenti efficaci per chiarire i meccanismi fondamentali di malattia 1,2 e per identificare potenziali obiettivi terapeutici 1,3. In particolare, l'utilizzo di entrambi i modelli murini di malattia cardiaca acquisita (per esempio pressione sovraccarico) 4,5 e modelli di topi transgenici hanno avanzato la nostra comprensione di malattie cardiache 6-8. L'uso di tecniche di coltura cellulare per studiare cascate di segnalazione 3,9,10 e alterazioni in singole proteine ​​che sono alla base eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazione nel cuore 11-13 a livello di singola cellula hanno integrato i modelli di topo in vivo. Tuttavia, la mancanza di linee cellulari adeguate che riflettono la struttura e la funzione adulto CM è una limitazione significativa. Gli investigatori hanno cercato di superare questo studiando singole proteine, come i canali ionici, in sistemi di espressione eterologhi 14, e mentre questi studi ci hanno fornito informazioni utili in termini di biofisica dei canali ionici o traffico di proteine, la rappresentazione inadeguata del microambiente nativo di CMS è una limitazione significativa. In secondo luogo, poiché la maggior parte di queste cellule eterologhe non hanno un apparato contrattile maturo, ma non e stato possibile studiare la funzione contrattile e la complessa interazione tra l'eccitabilità e la contrazione cellulare. Per questo motivo, i ricercatori si sono rivolti a colture cellulari primarie cardiaco per molti dei loro studi funzionali in vitro. Infine, gli studi cardiomiociti isolati consentono la valutazione della funzione contrattile senza i fattori di confondimento di preparazione multicellulare compreso l'effetto di cicatrice o fibrosi e orientamento delle fibre.

Primarie neonatali cardiomiociti di ratto ventricolari (NRVMs) sono relativamente facili da cultura, possono essere infettati con adenovirus e lentivirus per manipolare l'espressione genica 15, unnd sono stati quindi utilizzati con successo 1, ma hanno dei limiti dei loro propri. Anche se offrono un microambiente fisiologico 1 e sono stati il cavallo di battaglia del campo di segnalazione, le differenze sostanziali tra la morfologia e l'organizzazione subcellulare di NRVMs e cardiomyoctyes adulti li rendono un modello inadeguato per lo studio dei flussi ionici e accoppiamento eccitazione-contrazione nel cuore adulto . In particolare NRVMs mancano di una t-tubolare sottosistema definitivo 4. Da Ca 2 + flusso e la dinamica sono criticamente dipendente matura t-tubulare e reticolo sarcoplasmatico (SR) Struttura 6, Ca 2 + dinamiche e gli studi funzionali della contrattilità cardiaca in NRVMs non sono una riflessione accurata di questi processi critici in cardiomiociti adulti. Inoltre, alcuni componenti di vie di segnalazione differiscono tra neonatale ed adulta topi 9, fornendo così un altro limite per lo studio dei processi di malattia e la loro iIMPATTO su eccitabilità cellulare e contrattilità in NRVMs. Infine, la distribuzione della macchina contrattile provoca l'accorciamento cella multidirezionali e non uniforme limitando la precisione delle misure contrattili.

L'uso di cardiomiociti isolati adulte fornisce quindi un più accurato sistema di modellazione in vitro. La straordinaria crescita della conoscenza resa possibile dalla manipolazione genetica di topi sottolinea l'importanza di ottenere cardiomiociti funzionali isolate da topi. Infatti, la caratterizzazione di CM adulte isolate da modelli murini ha fatto luce su molti eventi biologici e patologici. Isolato CMS da modelli di topi transgenici hanno permesso per studi del guadagno o la perdita della funzione delle proteine ​​sulle proprietà contrattili delle singole cellule 2,16, e la vitalità in modelli di malattia come ischemia / riperfusione 17,18, integrando in tal modo le informazioni acquisite in Studi in vivo sultopi sé. L'uso di isolati adulto CMS da modelli murini di malattie cardiache acquisite 3,19,20 (come il sovraccarico trasversale aortica costrizione indotta pressione, che imita l'ipertensione o stenosi valvolare aortica) o l'esercizio 5,21 (per la modellazione di ipertrofia fisiologica) consente per l'esame dell'interazione di cascate di segnalazione implicati in questi processi con l'eccitabilità cellulare e accoppiamento eccitazione-contrazione a livello di singola cellula. Inoltre, la capacità di manipolare l'espressione genica usando l'espressione dei geni, guidato in adulto CMs ci offre l'opportunità di sezionare i componenti di vie di segnalazione complessi.

Dal punto di vista elettrofisiologico, tensione whole-cell e gli esperimenti clamp attuali isolato adulto CM sono stati critici nel chiarire la natura dei flussi ionici al basale e in vari stati di malattia. A causa della complessa struttura della membrana cellulare e la prote differenzialein strutture ponteggi tra adulti CM e NRVMs o linee cellulari eterologhi, la possibilità di patchare le cellule adulte fornisce una migliore rappresentazione degli effetti di alcune proteine ​​di membrana, proteine ​​strutturali, e che interagiscono partner di canale di ioni sui componenti elettrofisiologiche del cuore adulto.

Nonostante tali vantaggi importanti nello studio degli adulti cardiomiociti murini, isolamento e coltura di cardiomiociti topi adulti è stato impegnativo, sollecitando la necessità di una descrizione sistematica e accurata della metodologia per isolare cardiomiociti vitali mouse e al loro mantenimento in coltura per consentire un ulteriore manipolazione genetica utilizzando virale vettori. Precedenti studi hanno utilizzato sia acuto isolato topo adulto CMS o coltivate ratto adulto CM. Questi ultimi sono più facili da cultura di topo adulto CM, e la maggior parte degli esperimenti di manipolazione di espressione genica in vitro hanno usato ratto adulto CM. Pochi studi hanno modificato con successo e indagato functiespressione genica onale in topo adulto CM, presentando una grande limitazione nella portata di esperimenti. Pertanto, qui vi presentiamo in dettaglio tali metodologie, modificati dalle indagini precedenti, per l'isolamento 7,8,22, cultura 3,10,15,23, infezione adenovirale 11-13,15, e analisi funzionale di cardiomyoctyes ventricolari topo adulto. Questo protocollo isolamento risultati in Ca 2 +-tolleranti, cardiomiociti eccitabili che abbiamo successo in coltura per un massimo di 72 ore e transitoriamente trasfettate con adenovirus. La funzionalità di queste cellule isolate può essere valutata utilizzando il sistema di imaging MMSYS 14,24 e patch clamp, che sarà anche discusso.

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Protocollo

1. Cardiomiociti Isolamento

Materiali (Figura 1)

Microdissecting forcipe
Pinze dei tessuti
Pinze emostatiche delicate
Pinza emostatica
Microdissecting, seghettati, pinze curve
Forbici operative, dritto
Forbici operative, curvo
15 ml provette Falcon (5)
60 millimetri capsula di Petri
Soluzione tampone fosfato (PBS)
Nylon Mesh - dimensione 400 micron pori
Piccolo imbuto
Cera rivestito, intrecciato di seta 4-0, 19 millimetri, 7-10 cm di lunghezza
Non ago-ipodermico, punta smussata, 24 G o commerciale animale-alimentazione ago (24 x 1, W/1-1/4)
Eparina sodica
Miscela di ketamina / xylazina
Pipette Pasteur
OptiVision dissezione Goggles
Sistema IonOptix MMSYS

Nota: se la coltura di cellule, vedere paragrafo 2 sulla coltura cellulare prima di iniziare questo protocollo.

Nota: Tutti i topi sono stati curati inun impianto di barriera e sacrificato secondo le norme approvate IACUC, le pratiche e le procedure.

Nota: Prima di iniziare la procedura, l'intero sistema deve essere preriscaldato per garantire che tutti gli elementi del sistema Langendorff (Figura 2A, Figura 3) vengono riscaldati a 37 ° C per consentire una corretta e completa attività collagenasi.

  1. Iniettare topi adulti (~ 12 settimane) con 150 unità USP eparina sodica nello spazio addominale.
  2. Anestetizzare con una iniezione di una miscela di ketamina / xilazina alla dose-dipendente peso (Tabella 1).
    1. 80:12 mg / kg di ketamina: ricetta xilazina: 2,6 ml ketamina (100 mg / ml) + 0,4 ml xilazina (100 mg / ml) + 37 ml di PBS. Finale: ketamina = 6,5 mg / ml; xilazina = 1 mg / ml
  3. Fissare il mouse sedato al pad operativo, asportare il cuore, e mettere in un piatto di temperatura ambiente PBS o soluzione fisiologica 0,9% (Figura 1J). Physalina STUDI permette al cuore intatto a contrarre per una migliore estrusione di sangue nella camera e facile identificazione dell'aorta prima del punto 1.6. I topi sono stati controllati per assicurare che sono profondamente anestetizzati con perdita di arto posteriore punta pizzico reflex e il rallentamento della frequenza respiratoria prima della comparsa di toracotomia.
  4. Utilizzare OptiVision occhiali dissezione (Figura 1A) per identificare e denunciare l'aorta. Rimozione del tessuto intorno l'aorta, anche se lo fa facilitare la visualizzazione della nave, non è necessario per l'ottimizzazione dell'isolamento cella se la radice aortica è chiaramente visibile.
  5. Innescare la pompa con tampone di perfusione (Tabella 2). La temperatura dovrebbe essere tenuto a 37 ° C per la durata del procedimento utilizzando una controllata, circolanti bagnomaria (Figura 2D).
  6. Montare il cuore sul Apparato Langendorff (Figura 2A). Utilizzando due pinze micro-dissezione (Figure 1D-E), prime l'aorta intorno alla non-ipodermico, ago punta smussata (24 G) con tubo in silicone sulla punta distale. In alternativa, un animale-alimentazione ago commerciale (24 x 1, W/1-1/4) può essere utilizzato. Il tubo in silicone sulla ago 24 G o l'ago di alimentazione animale consentirà a garantire la sutura sopra la scanalatura. Posizionare l'aorta sull'ago come un calzino. (Figura 2C).
    1. Nota: È importante assicurarsi che l'estremità dell'ago riposa in aorta ascendente, idealmente nel distale della radice aortica alla anonima destra, ma che non si estende attraverso la valvola aortica nel ventricolo sinistro, in modo da gravemente limitare la capacità dei buffer di perfusione efficace attraverso il cuore attraverso le arterie coronarie.
  7. Fissare cuore all'ago legando una piccola lunghezza di seta sutura (lunga 7-10 cm) (Figura 1K) intorno alla parte superiore della aorta, assicurando che il legame è a livello dell'aorta ascendente, in basso a destra anonima artery, ma è sopra l'estremità dell'ago.
  8. Abbassare cuore verso l'interno del vetro conico (Figura 2B) per aiutare a mantenere una temperatura adatta.
  9. Profumato cuore con tampone di perfusione per 5 minuti ad una velocità di 1 ml / min e bloccare il deflusso camera di vetro per consentire il perfusato per raccogliere nel bicchiere conico e busta cuore. Lo schema per digerire il cuore è mostrato in Figura 3.
    1. A questo punto si dovrebbe vedere il volume dell'aumento cuore. Inoltre, il sangue nel tessuto cardiaco sarà sostituito da perfusato, provocando pallore tessuto.
  10. Rilasciare il morsetto uscita per drenare perfusato. Arrestare la pompa per spostare il tubo dal contenitore buffer di perfusione al contenitore buffer di enzima (figura 2E). Riavviare la pompa per iniziare a perfusione del cuore con tampone enzimatico (Tabella 2) a 1 ml / min. Bloccare nuovamente il deflusso per consentire il buffer enzima per la bustacuore.
    1. Qui, come l'enzima viene perfusione del cuore e digerire il tessuto connettivo, il cuore diventerà più pallido e l'integrità strutturale diminuirà.
    2. Per determinare quando tagliare i ventricoli del cuore digerita, sollevare il cuore fuori dal vetro conico, premere delicatamente il cuore con una pinza e raccogliere qualche goccia di perfusato in una piccola scatola di Petri e verificare se le celle singole sono in calo .
    3. Per il principiante è utile per collegare la linea di perfusione con un manometro. Quando il cuore è sempre digerito la pressione diminuirà rapidamente, come il tessuto connettivo non regge la resistenza. Il manometro è utile per il novizio anche per garantire che la posizione dell'ago sia sopra la valvola aortica e non nel ventricolo. Bassa pressione indica che l'ago è nella camera ventricolare e l'alta pressione ha indicato che l'ago tocca la valvola.
  11. Tagliare i ventricoli del cuore in un piattopieno di buffer di trasferimento (A) (Tabella 2) quando la pressione ventricolare inizia a diminuire drasticamente o quando si è in grado di vedere le singole cellule nel perfusato. Questo richiede di solito ~ 7-10 min.
  12. Sempre con pinze micro-dissezione (Figura 1C), tritate i ventricoli in piccoli pezzi a dissociarsi. Una digestione successo lascerà quasi nessun pezzi solidi di tessuto dopo la macinatura, con la maggior parte del tessuto divenire amorfo su dissociazione.
    1. Per dissociare ulteriormente il tessuto, pipetta la soluzione in / out utilizzando una pipetta Pasteur plastica (Figura 4) dal quale la punta era stata tagliata con un angolo ~ 45 °. Questa modifica serve per aumentare lo spazio diametrale interna della punta della pipetta diminuendo così la quantità di sollecitazione di taglio sulle cellule come il tessuto viene triturato.
    2. Prima di sezionare il tessuto con la pinza è possibile separare le singole camere e separatamente dissociare atriale, ventricolare sinistra o right cellule ventricolari.
  13. Fissare la maglia quadrata (Figura 1M) per un piccolo imbuto (Figura 1 litro) con fascette e collocare questo apparecchio filtrante in una provetta da 15 ml Falcon (Figura 1I).
  14. Usare la pipetta Pasteur modificato per rimuovere la soluzione di cellule dal piatto e filtrare la soluzione nel tubo Falcon.
  15. Lasciare le cellule vive di depositarsi sul fondo della provetta (sedimentazione delle cellule vive dovrebbe prendere 2-4 min).
  16. Aliquota 2,5 ml di ciascuna delle quattro soluzioni di calcio (Tabella 3) in 4 tubi 15ml falco separati.
  17. Nuovamente utilizzando una pipetta Pasteur norma, rimuovere accuratamente il pellet di cellule dal fondo della provetta e trasferire le cellule alla prima delle soluzioni calcio.
  18. Permettono alle cellule di depositarsi sul fondo della provetta e ripetere il punto 1.17 nelle successive soluzioni calcio finché le cellule sono in ultima soluzione.
  19. Non lasciate che le cellule stabilirsi nel Fourth soluzione di calcio. Tappare la provetta e girarlo su un fianco.

2. Cell Culture

  1. Prima l'isolamento, piastra 1 ug / ml laminina topo naturale su vetrini coprioggetto e incubare per almeno 1 ora a 37 ° C e 2% di CO 2. Consentono anche la vostra placcatura e terreni di coltura (Tabella 4) per riscaldare in incubatrice a 37 ° C e il 2% di CO 2. Questo permette la CO 2 disciolto nei media per equilibrare.
    1. Non rimuovere la parte superiore da parte dei media. Basta svitare la parte superiore per evitare la contaminazione.
  2. Lasciare le cellule isolate a pellet sul fondo della provetta Falcon.
  3. Rimuovere il pellet usando una pipetta Pasteur plastica e risospendere serie nella quantità appropriata di placcatura media.
  4. Piastra le cellule sui vetrini laminina rivestite nel piatto di dimensioni adeguate e incubare a 37 ° C e 2% di CO 2 per almeno 30-60 minuti per consentire alle cellule di aderire alle lamelle.
  5. ** Se trasfezione con adenovirus, diluire il virus in una quantità appropriata di terreni in piastra e sostituire il supporto placcatura nel piatto con il supporto contenente il virus. Sia il virus incubare le cellule per 2 ore a 37 ° C e 2% di CO 2. **
  6. Rimuovere il supporto placcatura dal piatto e sostituirlo con la cultura dei media.
  7. Cambiare con cura il terreno di coltura di ogni giorno in modo da non disturbare le cellule sui vetrini.

Utilizzando questa procedura, le cellule sono state coltivate con successo per un massimo di 72 ore. Immagini di colture cellulari e GFP transfettate possono essere trovati in Figura 5.

3. MMSYS sistema

  1. Alimentare il sistema MMSYS garantire che la lampada ad arco viene iniziata prima.
  2. Collegare i tubi dalla pompa all'ingresso appropriato e prese della camera MMSYS (Figura 6).
  3. Prime sistema con tampone di calcio (B) (Tabella 2).
  4. Inserire un caopriately dimensioni coprioggetto di vetro nella camera e fissare (Figura 6E). La maggior parte dei MMSYS camere di utilizzare uno 22 millimetri o 25 millimetri coprioggetto quadrati. Consultare il manuale utente MMSYS per determinare il vetrino appropriato per la camera.
  5. Trasferire 500 microlitri della soluzione di cella a un piccolo tubo Eppendorf.
  6. Aggiungere 0,5 microlitri Fura2-AM (soluzione stock di 1 mg / mL) per il tubetto di cellule e permettere loro di incubare al buio a temperatura ambiente per 5-7 min. Questo permette al Fura2-AM per "caricare" in cellule attraverso rapida diffusione passiva attraverso la membrana cellulare.
    1. Lasciare che i Fura-2 celle caricate pellet al fondo della provetta, e lavare l'eccesso Fura con 500 microlitri di tampone di calcio B.
  7. Spegnere le luci della stanza.
  8. Usando una pipetta Pasteur norma, cadere 1-2 gocce (a seconda della concentrazione cellulare) della soluzione di cellule "caricato" nel centro della camera (figura 6C) e permettere alle cellule To stabilirsi sul vetrino per 5 min.
    1. La densità delle cellule nella camera deve essere tale che le cellule non sovrapposte singoli possono essere visualizzati facilmente nella piattaforma di acquisizione dati MMSYS.
  9. Cominciare con attenzione a fluire buffer di calcio (B) attraverso la camera.
  10. Aumentare la temperatura della camera a 37 ° C.
    1. IMPORTANTE: Non accendere l'apparecchio di riscaldamento fino a quando è stato avviato il flusso. Questo può danneggiare gravemente il thermocoupler risposte (Figura 6A).
  11. Assicurarsi che la camera è collegata al MyoPacer tramite i fili di collegamento (Figura 6B) e cominciare a camminare le cellule 5 Hz a 1,5 volte la soglia di stimolazione per le cellule.
  12. Scegliere una cella che si batte alla frequenza corretta e spostarlo nell'apertura inquadratura.
  13. Regolare la telecamera e riformulare Dimensioni dell'apertura in modo che l'intera cella è al centro della finestra, diretto orizzontalmente, con la sarcomeri apgenitore.
    1. Per regolare la lunghezza della cella rosso e verde (destra e sinistra) indicatori fotodiodi al bordo della cella. Regolare il contrasto per ottimizzare il contrasto nero / bianco ai bordi della cella. Consultare il manuale Ionoptix per ulteriori dettagli.
  14. Porre il recipiente in una zona della cella contenente sarcomeri ben definiti e regolare il fuoco per ottimizzare il picco dello spettro di potenza (rosso). Inoltre la regolazione della luminosità del microscopio per ottimizzare la finestra smoothing blu e informazioni contrasto nero.
  15. Regolare le barre di soglia verdi per catturare la maggior quantità di spettro di potenza rosso (di picco) e come sfondo poco possibile.
  16. Iniziare la registrazione.
  17. Dopo abbastanza dati sono stati registrati, fare clic su "Pausa" per interrompere temporaneamente la registrazione e, assicurando che né il fuoco, né le dimensioni della finestra di visualizzazione sono alterati, spostare tappa del microscopio ad una zona del vetrino in cui non cellule o materiale cellulare può essere visto. Length della registrazione varia a seconda del protocollo sperimentale del ricercatore.
    1. Nota: Facendo clic su "Stop" terminerà la registrazione e senza sfondo sarà in grado di essere registrato per quella cella.
  18. Fare clic su "Continua" per registrare una misurazione del fondo.
  19. Dopo abbastanza bassa è stata registrata fare clic su "Stop" per terminare la registrazione.
  20. Fare clic su "File >> Salva" per salvare tutte le tracce di quella cella in un unico file ZPT..
  21. Ripetere i passaggi 3,12-3,20 finché non sono stati registrati sufficiente di cellule.
  22. Consultare il manuale d'uso IonOptix-MMSYS 12 per le istruzioni per l'analisi dei dati registrati. Dati caratteristici registrati di tipo selvaggio cardiomiociti sono mostrati nella Figura 7.

4. Patch Clamp

Patch di serraggio dei diversi tipi cellulari sono stati ben descritto in precedenza in questa rivista 25-28. Abbiamo quindi concentriamo su qualche criticoparametri di AL per il successo di serraggio pezzo di cardiomiociti adulti isolate utilizzando il nostro protocollo descritto.

  1. Utilizzando un estrattore pipetta e vetro borosilicato (con filamento: OD 1,5 mm ID 0,86 millimetri - 10 cm di lunghezza), tirare una pipetta che esibisce ~ 2.0-3.0 mW quando è riempita con una soluzione di pipetta (Tabella 5).
  2. Fuoco lucidare la punta della pipetta delicatamente con un Narishige o altro incendio lucidatrice verticale. La resistenza della pipetta cerotto deve essere di 2-4 MO dopo lucidatura fuoco.
  3. Accendere il computer, amplificatore (Axopatch 200B), convertitore AD (Digidata 1440A, Axon Instruments) e Micromanipulator (MP-285). Per tutto il serraggio delle patch cella, iniziamo con parametri standard come precedentemente descritto.
  4. Per colta adulto CM, rimuoverli dal termostato e lavare delicatamente il vetrino sul quale CMS sono placcati con PBS a temperatura ambiente.
  5. Rimuovere delicatamente il vetrino e collocarlo nella camera di perfusione al microscopio invertito (Nikon TE 2000).
    1. Assicurarsi che l'ingresso per il sistema di perfusione e di uscita (per aspirazione) sono appena sopra la superficie del vetrino.
  6. Inizia perfusione con soluzione extracellulare appropriato (Tabella 5).
  7. Per l'adulto appena dissociato CM, mettere un coprioggetto di collagene rivestito nel sistema di perfusione come sopra.
    1. Poiché le cellule saranno in soluzione, sostituire lentamente la soluzione con tampone extracellulare.
  8. Utilizzando la pipetta Pasteur modificato (Figura 4), ​​delicatamente risospendere le cellule nel buffer extracellulare, prendere una aliquota e posizionarlo sul vetrino.
  9. Lasciate che le cellule attaccano per 10-15 minuti prima di iniziare la perfusione come in 4.4.
  10. Back-riempire tutta la pipetta di patch cella con tampone intra-cellulare utilizzando un Microfil (Mondo Strumenti di precisione, 28 G) ago. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nella punta della pipetta, toccare delicatamente per consentire le bolle d'aria per galleggiare al surface della soluzione.
  11. Attaccare la pipetta di patch riempito alla pipetta titolare, assicurando che vi sia contatto tra il microelettrodo e la soluzione interna.
    1. Usiamo elettrodi di cloruro d'argento, ma prendiamo cura di 'chloriding' i fili d'argento almeno una volta alla settimana immergendo notte in candeggina.
  12. Abbassare delicatamente la pipetta nel bagno, in modo che l'elettrodo bagno è immerso in ogni momento della soluzione del bagno / extra-cellulare. Compensare eventuali potenziali di giunzione liquido in questo momento. Grandi potenzialità di giunzione può essere un segno di deterioramento cloruro di argento sugli elettrodi.
  13. Adulto sano cilindrico CM sono identificati al microscopio e centrato nel campo visivo. Come precedentemente descritto, una combinazione di movimento micromanipolatore e regolazione della messa a fuoco permette prossimità della pipetta di patch e la superficie del CM.
    1. Una volta che sono nello stesso piano focale, si usa una combinazione di visualezione della cellula e impulso di prova (disponibile in Axopatch 200B).
    2. Una volta che la resistenza della pipetta diminuisce a metà (suggerendo che la pipetta è in contatto con la superficie della cellula), e la cellula continua a guardare cilindrica, si stabilisce sigillo gigaohm usando aspirazione delicata.
    3. Per CMS, preferiamo aspirazione bocca per stabilire pressione negativa. Se un gigaseal si ottiene con successo, usiamo di nuovo aspirazione delicata bocca ritmica di 'rodaggio' alla cella di stabilire modalità intera zona cell.
  14. Potenzialità di riposo tipici di sana CM sono nell'ordine di -85 a -90 mV. Una volta ottenuto un gigaseal, misurare il potenziale di membrana a riposo con pinza corrente con I = 0 pA.
    1. Se il potenziale di membrana è depolarizzata questo può indicare una cellula danneggiata o una scarsa tenuta.
  15. Poiché il CMS sono grandi cellule con un sacco di superficie, particolare attenzione deve essere prestata al risarcimento di capacità, soprattutto wgallina rapidamente attivando correnti quali il canale del sodio deve essere studiato. Se un risarcimento adeguato di capacità non può essere ottenuto utilizzando il costruito nel impostazioni di compensazione sul generatore di impulsi, prepulses alla tensione sotto-soglia e la polarità opposta potrebbe dover essere applicata e la corrente risultante sottratto dal segnale registrato. Tale protocollo è facilmente programmabile in Axopatch.
  16. Una modalità tutta cerotto cella è stata stabilita, attendere 15 min per permettere equilibrazione e per garantire la stabilità del sigillo prima tensione all'inizio o protocolli pinza amperometrica. Usiamo protocolli standard che sono stati descritti in precedenza in questa e altre riviste e non sarà trattato.

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Risultati

L'isolamento di adulti cardiomyoctyes risultati nelle cellule a forma di bastoncello, striati, e quiescenti (non spontaneamente battere) (Figura 5A). Le cellule morte guarderanno arrotondate e senza striature saranno presenti. Cellule quiescenti possono essere coltivate e trasfettate con adenovirus per manipolare l'espressione genica (figure 5B e 5C). Dopo 24 ore di coltura, la morfologia delle cellule vive non cambia, sono ancora Ca 2 +-tolerant, e p...

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Discussione

In questo rapporto, abbiamo descritto le tecniche necessarie per l'isolamento di successo e la cultura degli adulti CM dal cuore mouse. La nostra tecnica consente successivo studio della funzione CM e l'eccitabilità con i metodi sopra descritti. Il parametro critico per studiare la funzionalità di adulto CMS è la salute e la qualità della isolato CM. Come descritto sopra, le nostre tecniche consentono un elevato rendimento di cellule funzionali che sono suscettibili di manipolazione dell'espressione genica u...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cloruro di sodioSigmaS7653
Cloruro di potassioSigmaP9333
Cloruro di magnesioSigmaM8266
HEPESSigmaH3375
Fosfato di sodio monobasicoSigmaS8282
D-glucosio minimoSigmaG8270
TaurinaSigmaT0625
2,3-Butandione monoximeSigmaB0752
Collagenasi BRoche Applied Science11088807001
Collagenasi DRoche Applied Science11088858001
Proteasi XIV da Streptomyces griseusSigmaP5147
Albumina da siero bovinoSigmaA2153
Cloruro di calcioSigmaC8106
Terreno essenziale minimoSigma51411C
Soluzione di albumina da siero bovinoSigmaA8412
L-glutamminaSigmaG3126
Penicillina-StreptomicinaSigmaP4333
Terreni di selenito di sodio supplementoSigmaI1884
Cloruro di cesioSigma289329
GlutammatoSigmaG3291
Adenosina 5'-trifosfato sale di magnesioSigmaA9187
Glicole etilenico-bis(2-ammina– acido tetraaceticoSigmaE3889
Soluzione di idrossido di cesioSigma232041
Soluzione di idrossido di tetraetilammonioSigma86643
Visiera binoculare in vetro ottico OptiVisorDohegan Optical Company Inc.N/A
Pinze per tessuti, 5,5", 1x2 dentiRoboz ScientificRS-8164
Pinze Moloney - 4,5" (11,5 cm) di lunghezza, seghettate Roboz ScientificRS-8254
Dumont #3 Pinze, Dumostar, dimensioni della punta 0,17 x 0,10 mmRoboz ScientificRS-4966
Packer Mosquito Pinze 5" Dritte PiatteRoboz ScientificRS-7114
Forbici per micro dissezione 4.5" Curvo Affilato/Affilato Roboz ScientificRS-5917
Forbici per micro dissezione 3.5" Dritto Affilato/Affilato20mmRobozScientific RS-5907

Riferimenti

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