Articolo metodologico

Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED)

DOI:

10.3791/50317

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7 maggio 2013

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1Institute for Clinical Neurobiology, University of Wuerzburg, 2Department of Synapses - Circuits - Plasticity, Max Planck Institute of Neurobiology, Martinsried, 3Walter Brendel Centre of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University of Munich

In questo articolo

Sommario

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Mirata-esterasi indotta colorante di caricamento (TED) supporta l'analisi delle dinamiche di calcio intracellulare negozio di imaging di fluorescenza. Il metodo basa sul targeting di un carbossilesterasi ricombinante al reticolo endoplasmatico (ER), dove migliora la smascheramento locale di sintetico a bassa affinità Ca 2 + Indicatore di coloranti in ER lumen.

Abstract

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Visualizzazione delle dinamiche di calcio è importante per capire il ruolo del calcio nella fisiologia cellulare. Per esaminare le dinamiche del calcio, fluorescenti Ca 2 + indictors sintetici sono diventati popolari. Qui mostriamo TED (= colorante carico mirato-esterasi indotto), un metodo per migliorare il rilascio di Ca 2 + pigmenti indicatori nel lume ER di tipi cellulari. Ad oggi, TED è stato utilizzato in linee cellulari, cellule gliali e neuroni in vitro. Basi TED su efficiente, ricombinante di mira di un'attività ad alto carbossilesterasi al lume ER utilizzando vettori costrutti che esprimono carbossilesterasi (CES). Le ultime vettori TED contengono un elemento centrale della CES2 fuso ad una proteina fluorescente rossa, consentendo in tal modo l'imaging simultaneo a due colori. La dinamica del calcio libero in ER vengono esposte in un unico colore, mentre la corrispondente struttura di ER appare in rosso. All'inizio del procedimento, le cellule vengono trasdotte con un lentivirus. Successivamente, le cellule infette ari seminati su vetrini per consentire finalmente l'imaging cellulare dal vivo. Poi, le cellule viventi sono incubate con l'estere acetossimetil (AM-estere) sotto forma di bassa affinità Ca 2 + indicatori, per esempio Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, o Mag-Fura2-AM. L'attività esterasi nei unirà ER off catene laterali idrofobiche dal modulo AM del + indicatore Ca 2 e una idrofila colorante fluorescente / Ca 2 + complesso è formato e intrappolato in ER lumen. Dopo il colorante di caricamento, le cellule vengono analizzate con un microscopio confocale a scansione laser invertito. Le cellule sono continuamente perfusi con soluzioni di Ringer-like e le dinamiche del calcio ER sono direttamente visualizzati da time-lapse imaging. Rilascio del calcio dal RE è identificato da una diminuzione della intensità di fluorescenza in regioni di interesse, mentre il riempimento del negozio calcio ER produce un aumento di intensità di fluorescenza. Infine, la variazione di intensità fluorescente nel tempo è determinata mediante calcolo di Af / F 0.

Introduzione

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Al fine di risolvere le risposte fisiologiche di calcio del ER, abbiamo sviluppato una nuova strategia per migliorare la cattura di calcio sintetici coloranti sensibili al pronto soccorso. Il metodo consente la diretta, senza interruzioni monitoraggio in tempo reale di libero ER calcio in presenza di calcio extracellulare.

Funzione e segnalazione di calcio ER

Segnali di calcio si trovano in diversi tipi di cellule, ad esempio-cellule muscolari, neuroni e cellule gliali e la loro gamma di funzioni di mediazione contrazione muscolare ad un coinvolgimento nella trasmissione sinaptica nell'apprendimento ....

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Protocollo

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Questo protocollo introduce TED applicata alle linee di cellule, neuroni ippocampali e cellule gliali corticali. TED performance è migliore quando vettori TED sono stabilmente espresse, ad esempio vettori lentivirali. Una panoramica schematica del metodo TED è mostrato in Figura 4.

1. Preparazione delle soluzioni

Le seguenti soluzioni devono essere preparate prima di iniziare e possono essere conservati come indicato. Usiamo generalmente di vetro sterilizzati e materiale plastico e acqua autoclavato.

  1. Preparare HEPES-Ringer (in mm): 125 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO 4 .7 H....

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Risultati

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Questo protocollo fornisce un approccio non distruttivo per l'imaging diretto di libera ER calcio. Bassa affinità sintetica Ca 2 + indicatori vengono rilasciati e intrappolati nel lume ER con l'aiuto di un ER mirati, attività enzimatica esterasi ricombinante. Migliorata caricamento delle Ca 2 + indicatore coloranti al pronto soccorso lume consente una rappresentazione diretta e veloce di ER calcio negozio dinamiche.

Tipi di cellule per TED

La f.......

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Discussione

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I vantaggi e gli svantaggi del metodo di TED sono state ampiamente discusse in recenti pubblicazioni 34,35. Rispetto ad altri metodi sopra descritti, TED elude il problema di interrompere e perfusione delle cellule. Inoltre, due aspetti hanno bisogno di essere sottolineato. Il principio di TED per ER calcium imaging richiede (1.) L'espressione mirata di un carbossilesterasi attiva nel lume ER con l'aiuto del TED costrutti vettoriali e (2.) Il rilascio efficiente e preferenziale di bassa affinità sinte.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BL567/3-1 e la Friedrich-Baur-Stiftung. Vorremmo ringraziare Roger Y. Tsien, Howard Hughes Medical Institute laboratori presso l'Università della California, San Diego per averci fornito Tag-RFP-T2. Noi per fortuna riconosciamo David Baltimore, California Institute of Technology, Pasadena, e Didier Trono, Università di Ginevra, Ginevra, per averci fornito il lentiviral plasmidi FUGW e psPAX2/pMD2.G.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(S)-3,5-DHPG (Diidrossifenilglicina)Tocris0805
5';-ATP-Na2, ATP sale disodico idratoSigmaA26209-1G
B-27 integratore,50xInvitrogen17504-044
Carbamilcolina cloruro (Charbachol)SigmaC4382-1g
Acido ciclopiazonico (CPA)Ascent scientificAsc-300
Dimetilsolfossido (DMSO)SigmaD2650
DMEM con GlutamaxInvitrogen-Gibco31966-047
PBS di Dulbecco senza Ca/Mg 1xPAAH15-002
Siero fetale di vitelloInvitrogen-Gibco10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μ gInvitrogenF14204
GlutammatoAscent scientificAsc-049
GlutamaxInvitrogen35050-038
Miscela di nutrienti F12 di prosciuttoInvitrogen-Gibco21765-029
Hank's BSS(1x) senza Ca, senza Mg, con fenolo rosso, HBSSPAA LaboratoriesH15-010
Siero di cavalloSHD3250YKLinearis
Ionomicina Ca2+ saleAscent scientificAsc-116
murino EGF PreproTech315-09
N2 integratore 100xInvitrogen17502-048
Mezzo neurobasaleInvitrogen-Gibco21103-049
Pluronic F127, bassa assorbanza UV, 2gInvitrogenP6867
Po-DL-ornitina bromidrato PORNSigmaP8638
Poli-D-lisina bromidratoSigmaP7280
Poli-L-lisinaSigmaP2636
ThapsigarginCalbiochem586005-1mg
TryLE ExpressInvitrogen12605-028
TripsinaWorthingtonLS-003707
Inibitore della tripsina da Glycine MAX (soia)SigmaT6522
Materials
Sistema confocale: microscopio a scansione laser invertito: FV1000 conconfigurazione specifica per l'utenteOlympus
Sistema confocale: combinatore laser FV10 e laser a diodi (405, 473, 559, 635)Olympusconfigurazione specifica per l'utente
Sistema confocale: testa di scansione FV10-SPD con rivelatore spettraleConfigurazione specifica per l'utenteOlympus
Controller del riscaldatore TC-344BWarner Instruments64-0101per il controllo del riscaldatore della soluzione in linea
SoftwareNIH ImageJWS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Obiettivo: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35OlympusN2709100
Obiettivo: UPLFLN40XOOlympusN1478700
Obiettivo: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15OlympusN1480700
Camera di perfusione, camera di perfusione inversasu misura
, RC-49FSWarner InstrumentsW4 64-1709
Tubo di perfusione: PT-49Warner Instruments64-1730per perfusione
Pompa peristaltica MiniPlus 3 (4 canali)Gilsonn.a.pompaperfusione
Riscaldatore per soluzione in linea singola SH-27BWarner Instruments64-0102controllato da controller di riscaldamento
Tubi di aspirazione: ST3RWarner Instruments64-1407per perfusione
Inserto riscaldante: Tempocontrol 37-2 digitale a 2 canaliPeconn.a.
IX81 di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 4, 517-529 (2003).
  2. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calci....

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