Imaging diretta di calcio ER con Targeted-esterasi Induced Loading Dye (TED)

Sommario

Mirata-esterasi indotta colorante di caricamento (TED) supporta l'analisi delle dinamiche di calcio intracellulare negozio di imaging di fluorescenza. Il metodo basa sul targeting di un carbossilesterasi ricombinante al reticolo endoplasmatico (ER), dove migliora la smascheramento locale di sintetico a bassa affinità Ca ^{2 +} Indicatore di coloranti in ER lumen.

Abstract

Visualizzazione delle dinamiche di calcio è importante per capire il ruolo del calcio nella fisiologia cellulare. Per esaminare le dinamiche del calcio, fluorescenti Ca ^{2 +} indictors sintetici sono diventati popolari. Qui mostriamo TED (= colorante carico mirato-esterasi indotto), un metodo per migliorare il rilascio di Ca ^{2 +} pigmenti indicatori nel lume ER di tipi cellulari. Ad oggi, TED è stato utilizzato in linee cellulari, cellule gliali e neuroni in vitro. Basi TED su efficiente, ricombinante di mira di un'attività ad alto carbossilesterasi al lume ER utilizzando vettori costrutti che esprimono carbossilesterasi (CES). Le ultime vettori TED contengono un elemento centrale della CES2 fuso ad una proteina fluorescente rossa, consentendo in tal modo l'imaging simultaneo a due colori. La dinamica del calcio libero in ER vengono esposte in un unico colore, mentre la corrispondente struttura di ER appare in rosso. All'inizio del procedimento, le cellule vengono trasdotte con un lentivirus. Successivamente, le cellule infette ari seminati su vetrini per consentire finalmente l'imaging cellulare dal vivo. Poi, le cellule viventi sono incubate con l'estere acetossimetil (AM-estere) sotto forma di bassa affinità Ca ^{2 +} indicatori, per esempio Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, o Mag-Fura2-AM. L'attività esterasi nei unirà ER off catene laterali idrofobiche dal modulo AM del ⁺ indicatore Ca ² e una idrofila colorante fluorescente / Ca ^{2 +} complesso è formato e intrappolato in ER lumen. Dopo il colorante di caricamento, le cellule vengono analizzate con un microscopio confocale a scansione laser invertito. Le cellule sono continuamente perfusi con soluzioni di Ringer-like e le dinamiche del calcio ER sono direttamente visualizzati da time-lapse imaging. Rilascio del calcio dal RE è identificato da una diminuzione della intensità di fluorescenza in regioni di interesse, mentre il riempimento del negozio calcio ER produce un aumento di intensità di fluorescenza. Infine, la variazione di intensità fluorescente nel tempo è determinata mediante calcolo di Af / F _0.

Introduzione

Al fine di risolvere le risposte fisiologiche di calcio del ER, abbiamo sviluppato una nuova strategia per migliorare la cattura di calcio sintetici coloranti sensibili al pronto soccorso. Il metodo consente la diretta, senza interruzioni monitoraggio in tempo reale di libero ER calcio in presenza di calcio extracellulare.

Funzione e segnalazione di calcio ER

Segnali di calcio si trovano in diversi tipi di cellule, ad esempio-cellule muscolari, neuroni e cellule gliali e la loro gamma di funzioni di mediazione contrazione muscolare ad un coinvolgimento nella trasmissione sinaptica nell'apprendimento e nella memoria di ^1,2. Cambiamenti nella concentrazione di calcio libero sono di grande interesse scientifico perché il calcio è coinvolto nella regolazione della trascrizione genica, la proliferazione cellulare, eccitabilità neuronale, la morte cellulare e altri eventi di segnalazione cellulare ^1-7. Tutti questi segnali di calcio cellulari sono funzionalmente collegati e contribuiscono a intracellulare di calcionegozio dinamiche ^8-10.

Una caratteristica comune a tutti i segnali di calcio è il flusso di calcio tra lo spazio extracellulare, citoplasma e organelli, soprattutto il ER e mitocondri. Questo provoca cambiamenti dinamici nella concentrazione di calcio all'interno di questi organelli, che vengono rilevate dai diversi componenti di segnalamento. In generale, la concentrazione di calcio nelle gamme ER tra 100 a 800 pM, nel citosol della concentrazione di calcio è quasi 100 nM, e nello spazio extracellulare la concentrazione è di circa 1-2 mm. Pertanto, vi è una forza motrice elevato chimica per flusso di calcio verso il citosol ^2,9,10.

I segnali di calcio ER-derivati ​​più comunemente studiate dipendono dalla stimolazione dei recettori accoppiati alla proteina G (GPCR), che poi attivano la fosfolipasi C (PLC). PLC a sua volta produce inositolo 1,4,5-trifosfato (IP ₃₎ ^1. In seguito al legame di IP ₃ alla sua receptor (IP _3-Rec, Figura 1) in ER-membrana, gli ioni calcio vengono rilasciati dal lume ER. Storicamente, IP rilascio di calcio _3-mediata dal pronto soccorso è stato il primo - anche se indirettamente - misurata in cellule pancreatiche acinose di Streb et al nel 1983 ^11.. Questa pubblicazione suggerito per la prima volta una cascata di segnalazione che coinvolge acetilcolina, fosfolipasi C, e IP _3. Questo modo di rilascio del calcio è generalmente definito IP rilascio del calcio _3-indotta (IiCR) (Figura 1). L'attivazione della chinasi-dipendente della fosfolipasi Cγ da recettore tirosin chinasi link l'azione di fattori di crescita e fattori neurotrofici di ER di calcio di segnalazione IP dopo ₃ elevazione ^12. Oltre a IiCR, elevazione di calcio può essere mediata da recettori ionotropici ingresso di calcio, per esempio attraverso i canali del calcio voltaggio-dipendenti (CA _V), e il successivo rilascio di calcio di calcio indotta (CICR) di ryanodine rirecettori (RyR). IiCR e CICR sono fisiologicamente legati al negozio-Entry operato di calcio (SOCE). SOCE comprende l'azione di STIM (stroma interagenti molecola), che è un sensore per il rilascio di calcio ER. STIM ha mostrato di stimolare l'ingresso di calcio extracellulare attraverso canali potenziali transitori recettore (Trp) ^13, Orai canali del calcio ¹⁴ e anche canali del calcio voltaggio-dipendenti ¹⁵ (Figura 1). Perdita di ER calcio viene salvato dinamicamente dall'azione del Sarco-reticolo endoplasmatico calcio ATPasi (SERCA), che attivamente pompe indietro calcio nel ER. Bloccare il SERCA con farmaci come thapsigargin svela una continua perdita di calcio ER al compartimento citosolico. Questo calcio ER "fuga" è causato da ER intramembrane complessi del poro come il complesso proteico Sec61 ^16,17 (figura 1).

Nel 1998, Berridge pubblicato un modello, il "neurone all'interno di un modello di neurone", which suggerisce un ruolo fisiologico principio della ER nell'integrazione di calcio neuronale ^5. Questo modello considera l'esistenza di un sistema a membrana ER continuo formando una "immagine" intracellulare della membrana plasmatica neuronale ^5. Questo sistema a membrana eucariotica binario è stato affermato di essere un prerequisito fondamentale per l'integrazione temporale e spaziale dei segnali veloci e lenti di calcio nei neuroni. Segnali di calcio che si verificano sia in concomitanza o successivamente in diverse spine o dendriti del neurone stesso sono conferiti a soma o nucleo attraverso il pronto soccorso, dove vengono riassunte ^5,18 della cellula. Quindi, la loro somma può avere effetto sul l'eccitabilità del neurone, regolazione della trascrizione genica o l'integrazione di cascate di segnalazione. Così, l'ER sostiene l'integrazione dei segnali di calcio. Una condizione per questo concetto è la continuità della ER in una singola cella, che è stato rivendicato da diversi studi e che è stato dimostrato almeno per somato-daree endritic e breve distanza proiezioni assonali ^19-21. Che ci sia continuità ER entro lunghe proiezioni assonale è una questione di dibattito.

Strategie per misurare il flusso di calcio gratis su membrana ER

Segnali di calcio sono più frequentemente monitorati nel citosol ^22,23. Pertanto, non può essere distinto facilmente se Ca ^{2 +} fluisce nel citosol da extracellulare o da riserve intracellulari ^6,24. Per superare questa limitazione, sono state sviluppate strategie metodologiche per l'imaging diretto di calcio ER. In sintesi, le seguenti strategie da utilizzare sono: (1) ER-mirati geneticamente proteine ​​indicatori ^25-27 a base di proteine ​​a bassa affinità Ca ^{2 +} indicatori utilizzano la proteina bioluminescente aequorina o GFP in combinazione con una proteina di rilevamento. Calcio. Queste Ca ^{2 +} indicatori geneticamente (GeCIS) puòessere mirati al pronto soccorso con l'aiuto di un peptide segnale e sono tenute attivamente al pronto soccorso con una ritenzione e motivo recupero. Comune ER Ca ^{2 +} indicatori di base sul principio Cameleon e sono il Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon spaccatura YC7.3ER ^29, e Cameleon D1 ^30. (2) colorante diretto carico esterasi a base di AM-estere a bassa affinità Ca ^{2 +} indicatori ^31,32. Dell'indicatore di coloranti (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM o Fluo5N-AM)-derivati ​​AM passare il membrane biologiche in una lipofila, Stato di calcio-insensitive. Poi, nel citosol, nonché in ER, esterasi endogene fendere del gruppo AM-estere e rilasciano l'indicatore di Ca ^{2 +,} lasciando una certa quantità di colorante attivo nel citosol e nel ER. Pertanto, questo approccio è utile in condizioni di una concentrazione elevata di calcio in ER finché la concentrazione di calcio citosolico rimane ben al di sotto delimite di protezione degli indicatori a bassa affinità, in particolare durante segnali di calcio caratteristici (per esempio nM a basse pM). (3) loading AM-estere in associazione con permeabilizzazione della membrana plasmatica ^32. Qualsiasi residuo ⁺ citosolico indicatore Ca ² viene rimosso mediante permeabilizzazione della membrana plasmatica con piccole quantità di un detergente "neutro" (ad es saponina) in un tampone intracellulare artificiale. Così, le membrane intracellulari possono essere stimolate, ad esempio con IP ₃ nel buffer intracellulare, direttamente attraverso "pori" nella membrana plasmatica. (4) Dialisi del citosol in configurazione whole-cell e misure simultanee di Ca ^{2 +} nel lume ER e il citosol ^32,33. Una cella viene prima caricato con una bassa affinità Ca ^{2 +} indicatore (ad esempio Mag-Fura2- AM, raziometrico, luce UV). In seguito, con l'aiuto di una pipetta di patch, qualsiasi residuo cytosolic Ca ⁺ indicatore a bassa affinità ² viene dializzato dal citosol con un tampone contenente un Ca ^{2 +} indicatore ad alta affinità (es. Fluo-3, luce visibile). Questa strategia consente la registrazione simultanea di segnali derivati ​​citosolici e ER. (5) Targeted-esterasi indotta colorante carico ^8,34. Un carbossilesterasi (CES) è mirato a lume del ER e fornisce una elevata attività di esterasi intrappolamento efficiente del modulo AM-estere di bassa affinità Ca ^{2 +} indicatori.

Mirata-esterasi indotta colorante di caricamento (TED)

Per migliorare il targeting di bassa affinità Ca ^{2 +} indicatori per l'ER lumen, TED è stato sviluppato. TED richiede la sovraespressione di un ER carbossilesterasi topo mirata (CES2) (Figura 2), che si ottiene tramite costrutti di espressione. Cellule esprimenti un CES-costrutto ricombinante vengono incubate con il modulo AM-estere di un calcio nelgnalazione colorante (Fluo5N-AM, la Figura 2). Poi, in ER, il colorante viene convertito al Ca ^{2 +} sensibile, membrana impermeabile Ca ^{2 +} indicatore complesso (Fluo5N/Ca ^{2 +)} dall'attività elevata esterasi, quindi intrappolando il colorante in una concentrazione elevata nel lume ER ^{8 , 34.} Il metodo è particolarmente utile per indagare ER calcio-release tramite i IiCR-percorsi per esempio tramite metabotropici purinergici-o glutammato recettori, ^8,34 e visualizzare ER deplezione di calcio attraverso "canali di perdite" direttamente, per esempio, dopo il blocco del SERCA ^{17 , 34.} Per la nostra esperienza la bassa affinità Ca ^{2 +} indicatore Fluo5N-AM è attualmente il miglior indicatore disponibile per l'utilizzo con la strategia di caricamento TED colorante. Fluo5N-AM ha una bassa affinità per il Ca ^{2 +} (costante di dissociazione K _D ~ 90 pM, Figura 2), è quasi non fluorescente nella sua AM-forma, ma fornisce alta emissione di fluorescenza upon calcium ^8,34 vincolante. Il Fluo5N/Ca ^{2 +} complesso può essere eccitato con una sorgente luminosa standard di ~ 490 nm, che corrisponde a coloranti standard come FITC, Alexa 488, o eGFP. Segnali di calcio citosolico raggiungono appena un concentrazione nell'intervallo pM bassa e sono quindi appena rilevati dal Fluo5N nel citosol ^35.

Per migliorare la prestazione TED, sono stati sviluppati diversi costrutti vettore ricombinante (Figura 3). In origine, vettori TED base alla sequenza codificante di CES2 (Refseq numero adesione NM_145603, CES2c) e migliori prestazioni TED si osserva con espressione stabile del CES costrutti. Nuovi TED vettori esprimono un elemento centrale della CES2 fusa alla proteina fluorescente rossa TagRFP-T2 ^36. Questi vettori hanno il vantaggio che possono essere utilizzati per identificare cellule trasdotte e di utilizzare la fluorescenza rossa come controllo interno per la normalizzazione dei cambiamenti in Fluo5N/Ca ^{2 +} fluorescenza. La fluorescenza rossa offre anche la possibilità di visualizzare la distribuzione strutturale del ER e cambiamenti nelle dinamiche ER in condizioni di stimolazione.

Protocollo

Questo protocollo introduce TED applicata alle linee di cellule, neuroni ippocampali e cellule gliali corticali. TED performance è migliore quando vettori TED sono stabilmente espresse, ad esempio vettori lentivirali. Una panoramica schematica del metodo TED è mostrato in Figura 4.

1. Preparazione delle soluzioni

Le seguenti soluzioni devono essere preparate prima di iniziare e possono essere conservati come indicato. Usiamo generalmente di vetro sterilizzati e materiale plastico e acqua autoclavato.

1. Preparare HEPES-Ringer (in mm): 125 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 2 CaCl _2, 1.25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O.. Priva di calcio HEPES-Ringer è costituito da (in mM): 127 NaCl, KCl 3, 25 HEPES, 2 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 1.25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O e 0,1 EGTA.. Senza glucosio queste soluzioni di imaging può be conservati a 4 ° C. La quantità richiesta di D-glucosio è appena aggiunto prima dell'uso.
2. Per l'analisi TED in neuroni dell'ippocampo, si consiglia di liquido cerebrospinale artificiale (ACSF). ACSF è composto di (in mM): 127 NaCl, 23 NaHCO _3, 3 KCl, 2,5 NaHPO ₄ H ₂ O, 25 D-glucose.H ₂ O, 2 CaCl _2, 2 _MgCl2 .7 H ₂ 0 in DDH. ₂ 0.
3. Preparare Fluo5N-AM per una concentrazione di 5 mM. Per aiutare la solubilizzazione aggiungere 8,9 ml di 20% Pluronic F-127 (in DMSO, conservato a temperatura ambiente, al riparo dalla luce e dall'umidità) a 50 mcg di liofilizzato Fluo5N-AM. Poi solubilizzare Fluo5N-AM per mezzo di un sonicatore bagnomaria per almeno 2 min. Conservare aliquote à 0,5 microlitri a -20 ° C, al riparo dalla luce e dall'umidità.
4. Preparare antagonista e le scorte agonisti come necessario. Per esempio: a) 10 mM ATP o ADP (in H ₂ O, l'attivazione dei recettori metabotropici purinergici), b) 10 mM carbachol in H ₂ O (agonistadei recettori muscarinici dell'acetilcolina), c), 30 mM acido ciclopiazonico (CPA) in DMSO (bloccante del SERCA), d) DHPG 50 mM in PBS (metabotropici agonista del recettore del glutammato per mGluR _I e mGluR _5), e), 10 mM glutammato in H ₂ O, f) 1 mM in DMSO ionomicina (ionoforo), g), 5 mM in DMSO thapsigargin (ad alta affinità bloccante del SERCA). Conservare aliquote a -20 ° C.
5. Vettori lentivirali: Questo protocollo prevede l'utilizzo di particelle lentivirali TED vettore di espressione. La loro produzione e stoccaggio, non sono parte di questo protocollo. Usiamo vettori lentivirali della seconda generazione per il trasferimento di carbossilesterasi a linee cellulari ricombinanti, cellule gliali e neuroni. Le nostre basi di sistema lentivirali sul vettore di espressione FUGW ^37, ed i plasmidi di imballaggio pCMVΔR8.91 o psPAX2 e il pseudotipizzazione plasmide pMD2.G ^38,39. ATTENZIONE: Si consideri che il lavoro con i ricombinanti di auto-inattivanti vettori lentivirali richiede l'attentaconsiderazione delle linee guida di biosicurezza. In molti paesi, questi vettori sono classificati come gruppo a rischio di rischio biologico 2. Per ulteriori informazioni fare riferimento al http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. Preparazione e Infezione virale del topo neuroni dell'ippocampo

1. Lavare vetrini in una piastra di Petri di vetro del diametro di 20 cm (100 vetrini per ogni piatto) 1x in etanolo al 70% per circa 30 min. Infine, aggiungere 100% di etanolo (pa) per 2 min. Rimuovere l'etanolo residuo e asciugare i vetrini sotto una cappa sterile.
2. Preparare due diversi tipi di mezzi di comunicazione per le culture dei neuroni dell'ippocampo: (a) di media Neurobasal con B27 01:50, (b) piena media: media Neurobasal con B27 01:50, Glutamax 1:100, 1:100 e supplemento N2. Sterile filtrato i media e le conserva in incubatrice cella fino al momento dell'uso.
3. Un giorno prima della dissezione, i coprioggetti sono preparati mettendo prima uno sterile 10 millimetri coprioggetto in ognipozzetto di una piastra da coltura cellulare 4-well. Successivamente, accuratamente rivesta ogni coprioggetto con 80-100 microlitri 0,1% poli-L-lisina e memorizzare i piatti in un incubatore per tutta la notte.
4. Al giorno di dissezione e coltura cellulare, iniziare con i coprioggetti lavaggio per tre volte con 100 microlitri HBSS e trasferire 100 ul medio neurobasal ad ogni coprioggetto. Porre le capsule in un incubatore di equilibrio (per esempio durante la dissezione dei topi).

Dissection

Eseguiamo i nostri esperimenti con i topi in conformità con le linee guida dell'Unione Europea, come approvato dalla nostra cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso.

5. Rimuovere il cervello totale e sezionare la ippocampi bilateralmente.
6. Rimuovere accuratamente eventuali meningi e tessuto diverso l'ippocampo e mettere un ippocampo ciascuno in una provetta ml 1,5 contenente 450 microlitri HBSS. Memorizzare il tessuto in ghiaccio fino è stato isolato un numero sufficiente di ippocampi.

Coltura cellulare

7. Aggiungere 50 microlitri 1% tripsina (Worthington) a ciascuna provetta e incubare a 37 ° C bagnomaria per 15 min. Agitare le provette di tanto in tanto. Per arrestare la reazione di digestione, aggiungere 50 microlitri tripsina inibitore 1% a ciascuna provetta e capovolgere la provetta diverse volte.
8. Trasferire tutti i tessuti di un massimo di 5 ippocampi a uno da 15 ml tubo falcon evitando il trasferimento di liquido. Aggiungere B27-medium (a) ad un volume finale di 5 ml.
9. Triturare il tessuto utilizzando un incendio lucidato pipetta Pasteur di vetro con attenzione pipettare su e giù. ATTENZIONE: Evitare bolle d'aria!
10. Gira con 400 xg per 3 minuti, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di B27-media (a).
11. Triturare il tessuto una volta con la pipetta di vetro, e quindi due volte con l'aiuto di un microlitri punta di plastica filtro 1000. Eseguire questa come descritto nei punti 2.9 e 2.10.
12. Dopo l'ultima centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in 2 ml pieno medium (b) e triturare celle con un filtro di plastica microlitri punta 200. Per separare rimanenti grumi di cellule dalla cella singola sospensione, far grumi di cellule stabilirsi per 1-2 min.
13. Contare le cellule e calcolare il numero totale di cellule necessarie per infezione virale. Per l'imaging TED utilizzare 25.000 cellule per 10 millimetri coprioggetto.
14. Placcatura ulteriore 25.000 cellule non trasdotte esempio un comando è raccomandato a questo punto.

Infezione virale

15. Trasferire la sospensione cellulare per infezione virale in un fresco 15 ml tubo falcon e centrifugare per 3 min a 400 x g.
16. Aspirare il surnatante e sospendere nuovamente le cellule in 300 microlitri medio (b)
17. Aggiungere una quantità appropriata di lentivirali TED particelle di vettore di espressione infettive e lasciare che il tubo falcon riposare a temperatura ambiente per 10 min.
18. Riempire il tubo con il mezzo pieno (b) per il volume finale necessario per la placcatura (100 l per ogni 10 millimetri vetrino), aspirare il terreno dal COVerslip, e collocare immediatamente 100 ml sospensione cellulare su ogni vetrino.
19. Porre le capsule in incubatrice fino a quando tutte le celle si sono stabiliti (circa 2 ore) e con attenzione riempire i piatti fino a quando essi contengono 2 ml di mezzo (b).
20. Lasciate che i neuroni si sviluppano per almeno una settimana. Sostituire il 50% del mezzo ogni settimana.

3. Cultura e Viral-infezione di topo cellule gliali corticali

Preparazione

1. Iniziare con la creazione basale media glia (miscela 1:1 di DMEM/F12 FCS al 10%, 5% HS, 1% di penicillina / streptomicina, 0,45% glucosio) e rivestimento di un pallone di coltura cellulare T75 con 4 ml di 0,5 ng / ml Poly -DL-ornitina bromidrato (porno) (diluito in soluzione di acido borico 150 mM, pH 8.35). Dopo incubazione a 37 ° C per 2 ore o durante la notte, lavare il matraccio di coltura cellulare per tre volte con HBSS e aggiungere 18 ml basale media glia contenente B27 1:50 e 10 ng / ml EGF. Equilibrare il pallone di coltura cellulare in incubatrice (fino a 3 ore).

Dissection

1. Eseguiamo i nostri esperimenti con i topi in conformità con le linee guida dell'Unione Europea, come approvato dalla nostra cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso.
2. Sezionare il cervello di un topo P5-P7 e rimuovere l'ippocampo e meningi da due emisferi come descritto in 2.5.
3. Sezionare la corteccia frontale, tagliarla in tanti piccoli pezzi e raccoglierli in una provetta ml 1,5 contenente HBSS. Conservare la provetta in ghiaccio e procedere alla cultura parte delle cellule.

Coltura cellulare

4. Trasferire tutti i tessuti dal tubo di un tubo di 15 ml falco usando un fuoco pipetta di vetro lucido.
5. Aggiungere terreno base ad un volume finale di 5 ml e triturare il tessuto pipettando più volte su e giù con una pipetta di vetro lucido fuoco. Dopo centrifugazione a 300 xg per 3 minuti, aspirare il terreno, e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno di base.
6. Ripetere il punto 3.5 due volte.
7. Dopo il third centrifugazione, risospendere il pellet di cellule in 2 ml basale medio glia contenenti B27 (1:50) e 10 ng / ml di EGF.
8. Titruate nuovamente e trasferire la sospensione cellulare al pallone di coltura cellulare preparata T75 e lasciate cellule crescono per 3-4 giorni.

Lavaggio delle cellule gliali (dopo 3-4 giorni di coltura):

9. Lavare le cellule una volta con 10 ml di PBS e vigorosamente toccare o delicatamente colpire il pallone un paio di volte con la mano, tenendolo stretto nell'altra mano. Da questo passaggio e detriti cellulari raggruppamenti cellulari vengono rimossi dalla coltura.
10. Aspirare il PBS e aggiungere mezzo fresco glia basale contenente B27 (1:50) e 10 ng / ml di EGF. Ulteriori coltivare la cultura per 5-7 giorni fino a quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza.

Scissione, trasduzione e semina finale di cellule gliali:

11. Cappotto 10 millimetri coprioggetto con 100 l poli-D-lisina (Soluzione: 0,1%, diluito 1/50 ad 20 mg / ml in PBS o HBSS) e incubareloro in un incubatore per tutta la notte. Lavare coprioggetto tre volte con HBSS e aggiungere 100 microlitri di medie glia basale. Equilibrare coprioggetto in incubatrice (3 ore).
12. Lavare le cellule gliali due volte con 10 ml di PBS, aspirare il PBS e aggiungere 3 ml di tripsina (TrypLE, non diluito). Trypsinize cellule per un massimo di 1 min. ATTENZIONE: Evitare di tripsinizzazione. Normalmente più del 80% di tutte le cellule si staccano dopo 1 min e questo è sufficiente avere diversi milioni di cellule sane.
13. Arrestare la reazione aggiungendo 10 ml basale medio glia, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml Falcon, centrifugare a 300 xg per 3 min. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzo glia basale.
14. Ancora una volta, girare e aspirare, come descritto al punto 3.15, quindi risospendere le cellule in 5 ml basale medio Glia.
15. Trasferire il numero necessario di cellule in una provetta da 1,5 ml. 10 ^{4-2x10 4} cellule gliali sono sufficienti per un 10 millimetri coprioggetto. Solitamente, la sospensione volUME trasdurre cellule per un 4-ben piatto è inferiore a 200 ml. Aggiungere una quantità appropriata di particelle lentivirali TED vettore di espressione per le cellule e incubare a RT per 10 min. Poi riempire la sospensione con basale medio glia al volume seeding (100 microlitri per coprioggetto).
16. Seed 100 microlitri di cellule infette per coprioggetto e incubare per circa 2 ore, quindi aggiungere mezzo glia basale contenente B27 01:50 e 10 ng / ml di EGF ad un volume finale di 2 ml.
17. Per le condizioni di coltura ideali utilizzare le cellule per gli esperimenti sul 3-7 giorni dopo la placcatura.

4. Generazione e Cultura Reporter Cell Line

TED linee cellulari del reporter sono stati stabiliti sulla base delle HeLa, BHK21, HEK293 e SH-SY5Y. Qui forniamo il protocollo per le cellule HeLa, ma il protocollo può essere trasferita in qualsiasi altra linea di cellule pure.

Generazione della linea cellulare HeLa stabile

1. Dividere un tipo di linea cellulare HeLa selvaggia e trasferimento 100.000 cells in un volume di 200 microlitri di una provetta da 1,5 ml.
2. Aggiungere una quantità appropriata di particelle lentivirali TED vettore di espressione al tubo ed incubare la sospensione cellulare-virus per 10 minuti a RT. Poi seme le cellule in un volume totale di 2 ml di medium (DMEM, 10% FCS, 1% di penicillina / streptomicina) in un piatto di 30 mm ed incubare per 3 giorni.
3. Dopo aver lavato una volta con PBS, aspirare a medio e aggiungere 500 microlitri tripsina (TrypLE, 2:3 in PBS). Incubare per ca. 3 min e poi fermare la reazione con l'aggiunta di 3 ml di mezzo. Trasferire la sospensione in una provetta da 15 falco e centrifugare a 400 xg per 3 min.
4. Risospendere il pellet di cellule in 200 microlitri di medie e ancora infettare le cellule con particelle lentivirali come descritto in 4.2. Poi, le cellule di semi in un pallone di coltura T25 cellulare in 10 ml di mezzo.
5. Crescere le cellule fino a quando una confluenza del 60-80% è raggiunto. Poi dividere la cultura.

TED linee cellulari giornalista

6. TED linee cellulari del reporter possono mantenereed in qualsiasi mezzo standard, ad esempio DMEM contenente il 5% o 10% FCS e 1% di penicillina / streptomicina viene utilizzato.
7. Targa un numero appropriato di cellule in un piatto 4 pozzetti sterili contenenti 10 millimetri coprioggetto (vedi sopra), ad esempio 10.000 a 20.000 cellule per vetrino coprioggetto.
8. Crescere le cellule per almeno due giorni prima di usarli per TED imaging.

5. Preparazione per la Procedura vivo Imaging a un microscopio invertito

1. 1. Preriscaldare HEPES-Ringer a temperatura ambiente e aggiungere D-glucosio.
   2. Preriscaldare il ACSF (senza Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +)} a temperatura ambiente e aggiungere D-glucosio. Aerare il ACSF con CARBOGEN per 5 minuti. Quindi aggiungere 1 M soluzioni stock di _CaCl2 e _MgCl2 a concentrazioni finali di 2 mm ciascuno.
2. Avviare i microscopi di imaging dal vivo e tutti i programmi per computer.
3. Iniziare perfusione su una camera di imaging "fittizio" ed equilibrare il sistema di tubi.
4. Preriscaldare il riscaldatore soluzione in linea e la camera di imaging in fase microscopio. Fissare la camera di imaging in un inserto di riscaldamento.
5. Equilibrare il sistema a 32-37 ° C prima di iniziare la procedura di caricamento del colorante. ATTENZIONE: Per evitare il flusso accidentale di liquido di perfusione nel sistema di microscopio che usiamo legami dei capelli attorno agli obiettivi e fogli di silicone elastomero (1mm) per proteggere il palco microscopio.

6. Dye Caricamento di entrambi i tipi delle cellule

1. Risospendere 1 aliquota di Fluo5N-AM (vedi 1.3) in 100 ml soluzione di imaging preriscaldata (HEPES-Ringer o ACSF).
2. Solubilizzare Fluo5N-AM nella soluzione di imaging (HEPES-Ringer o ACSF) in un sonicatore bagnomaria per 90 sec.
3. Utilizzare un fresco 4 - o 24-ben 400 microlitri soluzione di imaging preriscaldata piatto e trasferimento in un pozzetto. Aggiungere la soluzione colorante allo stesso bene a venire a 500 pl di una soluzione 5 mM.
4. Collocare il vetrino con le cellule (ad esempio10-18 mm di diametro) nel pozzo, le cellule verso l'alto.
5. Incubare per un adeguato periodo di tempo in un incubatore per colture cella a 37 ° C (nel frattempo preparare impostazioni di imaging in fase microscopio). Tipici tempi di colorante di caricamento sono per i neuroni e cellule gliali 7-15 min e per linee cellulari 10-20 min.

CRUCIALE: Tempo Dye-caricamento e concentrazione di colorante dipendono dal tipo di cellula, densità cellulare, e le esigenze specifiche esperimento! Lunghi tempi di incubazione in presenza del colorante possono danneggiare le cellule, i neuroni soprattutto primarie e cellule gliali primarie e questo è fondamentale per la capacità di risposta a stimoli fisiologici. Volte a lunga incubazione (per esempio 30 min) sarà utile solo per ER esperimenti di localizzazione di calcio per studiare la distribuzione di calcio ER in piccole strutture cellulari, come ad esempio neuriti multa o spine. In alcuni esperimenti, una miscela di 1/3 di terreno di coltura con soluzione di imaging possono proteggere cellule durante Fluo5N-AMcarico.

6. Immediatamente, trasferire il vetrino all'altro coltura cellulare e contenente soluzione di imaging (HEPES-Ringer o ACSF) e iniziare il montaggio delle cellule nella camera di imaging.

7. ER-calcio imaging cellulare dal vivo con un laser invertito microscopio confocale a scansione

1. Utilizzare un pennello per applicare alto grasso per vuoto ad una camera di imaging. Il grasso è necessario per fissare il coprioggetto sul fondo della camera di perfusione. Usiamo camere di imaging self-made per 10-12 mm coprioggetto con un piccolo volume, permettendo così alte velocità di perfusione fino a cambio di buffer di 15 volte al minuto. Una camera di perfusione disponibile in commercio per 18 millimetri coprioggetto, può essere acquistato da Warner strumenti (RC-49FS). Tale camera permette inoltre stimolazione del campo di neuroni.
2. Sollevare il vetrino con le cellule Fluo5N-caricati e aggiungere una piccola goccia di soluzione di imaging (50-100 ml) sulle cellule per mantenere le cellule ricoperte di soluzione di imaging.Girare il coprioggetto e montare le cellule nella camera di imaging. Per premere il vetrino nel silicio-colla, utilizzare un batuffolo di cotone (es. Q-tips).
3. Asciugare tampone residuo dal fondo del vetrino di vetro con bastoncini di cotone. ATTENZIONE: Pulire delicatamente l'umidità residua quando si utilizza un obiettivo-olio con elevata apertura numerica per l'imaging ad alta risoluzione. Sale residuo viene rimossa meglio l'acqua. Striscio accidentale di grasso può essere rimosso con acetone o etanolo puro.
4. Cambio della camera di imaging "fittizio" con la camera di imaging sperimentale. Lavare le cellule per 5-10 minuti con perfusione continua.
5. Lavare le cellule per 5 - 10 minuti di perfusione continua.
6. Per la selezione delle cellule utilizzare una quantità minima di illuminazione laser, alti tassi di scansione (2-4 Hz), immagini di piccole dimensioni, e un alto guadagno.
7. ATTENZIONE: Per la selezione di celle Fluo5N-etichettati non utilizzare l'eccesso di illuminazione a luce diretta o con epifluorescent luce. Bright illuminazione di Fluo5N/Ca ^{2 +} complessi provoca la perdita completa della fluorescenza ER-specifico entro 2-4 secondi (Figura 5).
8. Impostare il microscopio secondo l'esperimento pianificato. Per l'orientamento, le impostazioni rappresentative per la rappresentazione con vettori diversi TED sono riportati in Tabella 1. Per la microscopia confocale a scansione laser invertito, usiamo un microscopio Olympus IX81 combinato con un sistema confocale FluoView 1000 che è dotato di laser a diodi (473 nm, 15 mW, 559 nm, 20 mW) e un sistema rivelatore spettrale.
9. All'inizio del documento esperimento le cellule di interesse per alta risoluzione x, yz stack di immagini.
10. Eseguire x, yt imaging per monitorare dinamiche di calcio ER nelle condizioni sperimentali specifiche. Impostazioni tipiche per il nostro sistema sono elencati nella Tabella 2.
11. Monitorare i cambiamenti in calcio ER sotto perfusione continua con soluzione di imaging. Tassi di cambio di buffer tipici sono exemplarily: (a) il lavaggio cellulare e store-deplezione da SERCA blocco: 1,5 ml / min; (b) ATP / DHPG stimolazione: 3 ml / min.
12. Acquisire le immagini digitali preferenzialmente con 12 bit (4096 livelli di grigio). Per l'imaging parallelo di Fluo5N/Ca ^{2 +} e RFP, immagini a 8 bit (256 livelli di grigio) può salvare il sistema di troppo pieno di dati.
13. Memorizzare le immagini in diretta delle cellule di serie temporali (x, yt) o pile di immagini 3D (x, yz) (per la distribuzione cellulare di Fluo5N/Ca ^{2 +} complessi) in un formato compatibile con ImageJ (ad esempio TIFF).

8. Image Processing e Analisi dei Dati

1. Aprire la serie di immagini nel programma ImageJ. In caso di multicolore di imaging, dividere i canali RGB quando gli viene chiesto di ImageJ.
2. Identificare la propria regione (s) di interesse (ROI) da un attento esame delle pile di immagini (ad esempio, con l'aiuto di una intensità vs plot tempo)
3. Utilizzare il plugin Time-Series Analizzatore di leggere l'intensità media dei pixel in un ROI (F _crudo). Depending di proposito, disegnare ROI attorno o al pronto soccorso completa o piccole regioni del ER ER esempio dei dendriti delle cellule regioni periferiche. Includere anche 1-3 ROI in zone prive di cellule per la sottrazione del fondo.
4. Calcolare la fluorescenza di fondo medio (F _b) calcolando il valore di fluorescenza media del fondo ROI e sottrarre il valore di fondo F _b dai valori _grezzi F per ottenere il valore F _roi.
5. Calcolare F _0, che è la fluorescenza basale delle cellule, calcolando il valore medio di dieci a 30 valori di fluorescenza per ogni ROI in uno stato di riposo.
6. Calcolare i background-corretti cambiamenti relativi a fluorescenza da Af / F ₀ dalla formula:

7. Variazioni relative presenti in fluorescenzance come traccia con Af / F ₀ per l'asse Y e il tempo per l'asse X.

Risultati

Questo protocollo fornisce un approccio non distruttivo per l'imaging diretto di libera ER calcio. Bassa affinità sintetica Ca ^{2 +} indicatori vengono rilasciati e intrappolati nel lume ER con l'aiuto di un ER mirati, attività enzimatica esterasi ricombinante. Migliorata caricamento delle Ca ^{2 +} indicatore coloranti al pronto soccorso lume consente una rappresentazione diretta e veloce di ER calcio negozio dinamiche.

Tipi di cellule per TED

La f...

Discussione

I vantaggi e gli svantaggi del metodo di TED sono state ampiamente discusse in recenti pubblicazioni ^34,35. Rispetto ad altri metodi sopra descritti, TED elude il problema di interrompere e perfusione delle cellule. Inoltre, due aspetti hanno bisogno di essere sottolineato. Il principio di TED per ER calcium imaging richiede (1.) L'espressione mirata di un carbossilesterasi attiva nel lume ER con l'aiuto del TED costrutti vettoriali e (2.) Il rilascio efficiente e preferenziale di bassa affinità sinte...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
(S)-3,5-DHPG (Diidrossifenilglicina)	Tocris	0805
5';-ATP-Na2, ATP sale disodico idrato	Sigma	A26209-1G
B-27 integratore,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamilcolina cloruro (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Acido ciclopiazonico (CPA)	Ascent scientific	Asc-300
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM con Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
PBS di Dulbecco senza Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Siero fetale di vitello	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μ g	Invitrogen	F14204
Glutammato	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Miscela di nutrienti F12 di prosciutto	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank's BSS(1x) senza Ca, senza Mg, con fenolo rosso, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Siero di cavallo	SHD3250YK	Linearis
Ionomicina Ca2+ sale	Ascent scientific	Asc-116
murino EGF	PreproTech	315-09
N2 integratore 100x	Invitrogen	17502-048
Mezzo neurobasale	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, bassa assorbanza UV, 2g	Invitrogen	P6867
Po-DL-ornitina bromidrato PORN	Sigma	P8638
Poli-D-lisina bromidrato	Sigma	P7280
Poli-L-lisina	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Tripsina	Worthington	LS-003707
Inibitore della tripsina da Glycine MAX (soia)	Sigma	T6522
Materials
Sistema confocale: microscopio a scansione laser invertito: FV1000 con	configurazione specifica per l'utente	Olympus
Sistema confocale: combinatore laser FV10 e laser a diodi (405, 473, 559, 635)	Olympus		configurazione specifica per l'utente
Sistema confocale: testa di scansione FV10-SPD con rivelatore spettrale	Configurazione specifica per l'utente	Olympus
Controller del riscaldatore TC-344B	Warner Instruments	64-0101	per il controllo del riscaldatore della soluzione in linea
Software	NIH ImageJWS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Obiettivo: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Obiettivo: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Obiettivo: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Camera di perfusione, camera di perfusione inversa	su misura
, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Tubo di perfusione: PT-49	Warner Instruments	64-1730	per perfusione
Pompa peristaltica MiniPlus 3 (4 canali)	Gilson	n.a.pompa	perfusione
Riscaldatore per soluzione in linea singola SH-27B	Warner Instruments	64-0102	controllato da controller di riscaldamento
Tubi di aspirazione: ST3R	Warner Instruments	64-1407	per perfusione
Inserto riscaldante: Tempocontrol 37-2 digitale a 2 canali	Pecon	n.a.