Valutare fenotipi neurodegenerative Drosophila Neuroni dopaminergici mediante saggi arrampicata e Whole Brain Immunostaining

La specificità dei saggi descritti qui si basa sull'utilizzo di una linea di volo GAL4 che sfrutta le sequenze regolatorie del gene della tirosina idrossilasi raggiungere espressione specifica in neuroni dopaminergici ^3. Tirosina idrossilasi catalizza la prima e fattore limitante nella sintesi della dopamina. Immunoreattività TH Nell'adulto mosca sovrappone cervello con quello della dopamina, rendendo TH un buon candidato per identificare neuroni DA in vivo (vedi per esempio ^6). Inoltre, il modello di espressione di THGal4 è più specifico di quella di altri GAL4 linee come DdcGal4, che contiene sequenze regolatrici dal gene della dopa decarbossilasi e pilota l'espressione transgenica non solo nei neuroni DA, ma anche nei neuroni serotoninergici e sottoinsiemi di cellule gliali ³ .

Feany e Bender (2000) in primo luogo osservato che l'espressione di pan-neuronale del gene PD-linked α-sinucleina umana accelera la perdita progressiva di startle indotta comportamento geotassi negativo in Drosophila. abbiamo osservato risultati simili utilizzando la specifica linea di DA-neurone THGal4 per guidare il expressionof un α-sinucleina transgene ¹⁰ e utilizzato questa funzionalità read-out per studiare il ruolo neuroprotettivo del percorso Nrf2 in questo Drosophila modello di PD ^14. Il dosaggio specifico qui descritto è adattato da ² e ^3.

Il cervello Drosophila contiene più di 100 neuroni DA, disposte in almeno cinque diversi cluster (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) che può essere visualizzato in supporti interi cerebrali mediante microscopia confocale (vedi per esempio ¹¹ e ^7). E 'ancora controverso se il numero di neuroni DA nel Drosophila cervello diminuisce con l'età ^{9, 11,} tuttavia, neurodegenerazione età-dipendente si osserva in linea in cui sono stati mutati geni PD-linked / overexpressed per modellare malattie umane5. L'espressione di α-sinucleina umana in DA neuroni ha un tale effetto e, quindi, è stata usata come modello per PD. Qui si descrive un saggio di neuroni DA contano in tutto il cervello monta utilizzando TH come marker delle cellule. Questo test è stato adattato da ¹³ e ^10.

1. Trasalimento indotta Negativo geotassi Assay

1. Selezionare mosche del genotipo desiderato, separarli per sesso, in modo casuale raggrupparli in coorti di 20-30 animali e li lanciano in nuovi flaconi cibo ogni 2-3 giorni; test di ogni set di mosche (cioè coorti di pari età, una coorte / genotipo) almeno una volta alla settimana.
2. Trenta minuti prima della prova geotassi negativo, anestetizzare le mosche con la CO ₂ e metterli in tubi di plastica trasparente pre-etichettati fatti con due fiale di cibo vuote (vedi Materiali Tavolo) unite alle loro aperture con nastro adesivo trasparente (Dimensioni camera: 19 cm x 2,85 cm). Nei nostri test Usiamo tipicamente 25 mosche / tubo.
   Nota. Il tempo di recupero dall'anestesia può variare da pochi minuti a diverse ore (ad esempio O / N) e dovrebbe essere ottimizzato per i genotipi specifici testati.
3. Segna diverse altezze (1-20 cm) su un pezzo di carta assorbente e nastro di carta su un surfac verticalee, perpendicolare al banco.
4. Posizionare i tubi davanti alla carta: i tubi devono essere tutti allineati e il più vicino possibile alla carta per consentire la misurazione dell'altezza precisa.
5. Posizionare la fotocamera digitale (vedi il "Veicoli speciali" Table) di fronte ai tubi, ad una distanza di 20-30 cm dalla carta, su un supporto (ad esempio una scatola di punta della pipetta), selezionare l'opzione "film" e iniziare a registrazione, in questo momento si dovrebbe anche avviare un timer per tenere traccia del tempo tra prove consecutive.
6. Lasciare le mosche per raccogliere sul fondo della provetta toccando il tubo per alcuni secondi (es. 10 sec). Questo passaggio deve essere eseguito in modo coerente (cioè stessa durata, stessa forza, lo stesso operatore) durante l'intero esperimento.
7. Movimenti record mosche con la fotocamera digitale per 10 sec.
8. Ripetere i passaggi 1,5-1,7 quattordici volte a intervalli di un minuto.
9. Analizzare i dati:
   1. Contare il numero di mosche che si trovano al di sopra della2 cm segno dopo 10 secondi con l'ispezione visiva dei filmati registrati.
      Nota: Nelle nostre condizioni di saggio comportamento geotassi negativo delle mosche non durò oltre il primo 10 secondi dopo il sorprendente (cioè mosche hanno cominciato a muoversi in tutte le direzioni 10 sec dopo il sorprendente di loro). La distanza minima è salito da mosche di controllo (cioè 1 settimana fa mosche che esprimono il conducente THGal4, vedi legenda della Figura 1) in questa finestra di tempo era 2 cm. Così, abbiamo usato il segno di due centimetri come riferimento per analizzare le attività di arrampicata di mosche di diverse età e genotipi 10 secondi dopo l'inizio del comportamento. Questi parametri possono richiedere la regolazione per tenere conto di differenze di comportamento delle mosche testati (dovuto ad esempio a diversi background genetici o condizioni di laboratorio). Si noti che nelle nostre condizioni di analisi, tutti i genotipi testati eseguita peggio o in modo simile alle mosche del genotipo di controllo.
   2. Prendere la media dei risultati del quindiciprove.
   3. Media espressa come percentuale del numero totale di mosche nel tubo (=% dell'attività climbing), il numero di ripetizioni (N) è data dal numero di coorti indipendenti testate per ciascun genotipo
   4. Valutare la significatività statistica tra i diversi genotipi nel tempo. Questo può essere realizzato con il test t di Student (confrontando le due genotipi) o un 2 vie ANOVA seguita dal test di Bonferroni post-hoc (quando si eseguono confronti multipli) usando software commerciali quali GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, USA).

Nota

Eseguiamo tutti i nostri saggi allo stesso tempo del giorno, a RT e alle stesse condizioni di luce. Mantenere le mosche in una luce / buio dell'ambiente ciclo di 12 ore si consiglia di controllare l'effetto dei ritmi circadiani sul comportamento motorio delle mosche.

2. Tirosina idrossilasi immunofluorescenzaSaggio dei Monti intero cervello

Soluzioni e tamponi

Soluzione fissativa: 4% paraformaldeide (PFA) in tampone fosfato (PBS)

Lavaggio buffer: 0.1% Triton X-100 in PBS

Tampone bloccante: 0.1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 e 0,5% di BSA

Supporti di montaggio: Mowiol-DABCO (vedi protocollo descritto in Harlow E, Lane D., Anticorpi-Un manuale di laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988))

Procedura

1. Mettere mosche in un piatto dissezione riempito con 70% EtOH per circa 1 minuto per eliminare la cera cuticola.
2. Trasferimento vola a un altro piatto dissezione pieno di ghiaccio-freddo PBS.
3. Sezionare il cervello:
   1. Posizionare la mosca con l'up lato ventrale (opzionale: ali Rimuovere e gambe).
   2. Tirare la testa dal corpo: utilizzare un set di pinze permantenere il corpo ed un altro per trattenere la cuticola sotto l'occhio per evitare di danneggiare il cervello
   3. Rimuovere la proboscide.
   4. Trattenere la cuticola testa su lati opposti della fessura lasciata aperta dopo aver rimosso la proboscide e tirare in direzioni opposte fino a quando il cervello viene rimosso dalla capsula testa.
   5. Rimuovere tutta la cuticola dal cervello.
   6. Rimuovere tutto il tessuto tracheale piena d'aria, per evitare che il cervello da variabile durante le seguenti fasi di incubazione.
4. Tagliare alcuni millimetri largo della punta di una punta di pipetta P-200 ed equilibrare con una soluzione 0,1% Triton X-100/PBS
5. Usando la punta P-200 pipetta preparati, trasferire il cervello per una provetta Eppendorf da 0,5 ml riempita con 0,5 ml di 4% PFA / PBS e mantenere in ghiaccio fino alla dissezione è completa.
6. Fissare il cervello a temperatura ambiente per 20 min: applicare una rotazione dolce mettendo le provette Eppendorf su una griglia e l'immissione del rack su un nutator.
7. Togliere il fissativoutilizzando un P-1000 micro pipette, aggiungere 0,5 ml di 0,1% X-100/PBS Triton, mescolare per inversione e lasciare incubare per 1 min; ripetere questa fase di lavaggio una volta.
8. Rimuovere il tampone dal secondo lavaggio, aggiungere 0,5 ml di 0,1% X-100/PBS Triton e lasciare incubare a temperatura ambiente per 20 min; ripetere questo passaggio due volte.
9. Rimuovere il tampone di lavaggio e lasciare che i cervelli incubate in tampone di bloccaggio (0.1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 e 0,5% BSA) per 1 ora a RT.
10. Incubare il cervello con una diluizione 1:100 di anticorpi anti-TH (vedi la "Tabella di reagenti specifici") in soluzione di bloccaggio, per due giorni, a 4 ° C, con rotazione delicata (vedi punto 2.6.).
11. Ripetere le fasi di lavaggio 2.7. e 2.8 ..
12. Equilibrare il cervello con una diluizione 1:200 di soluzione di blocco antibodyin secondario, per due giorni, a 4 ° C, con lieve rotazione.
13. Ripetere le fasi di lavaggio 2.7. e 2.8 ..
14. Preparare i vetrini di montaggio come illustrato nella Figura 2A:
    1. Agg 2 x 25 gocce microlitri di supporti di montaggio per un vetro di copertura (24 x 60 mm, n. 1.5).
    2. Posto due bicchieri di copertura (dimensioni 18 x 18 mm, n. 2) sul supporto di montaggio lasciando un vuoto al centro della diapositiva e lasciare asciugare.
    Nota. Controllare il supporto del campione sul palco del microscopio confocale. È possibile effettuare il vetro di copertura delle stesse dimensioni di un x 75 mm diapositiva 25 ed accompagnato da una x 22 mm 1.5 vetro di copertura da 22 a una delle estremità (usare smalto e nastro).
15. Rimuovere il tampone di lavaggio, aggiungere 50 ml di mezzi di montaggio e consentono il cervello per equilibrare con esso pipettando su e giù.
16. Utilizzando un taglio P-200 punta di pipetta (vedi passo 2.4) trasferire i cervelli alla slitta nello spazio tra i due coprioggetto e coprire con coprioggetto no. 1.5 (vedere la Figura 2A; orientare i cervelli sul vetrino vedi ^7).
    Nota: i campioni sono montate tra due vetri di copertura per permettere la visualizzazione sia del anteriore e posterior lato del cervello.
17. Riempire l'intero spazio tra i vetri di copertura con mezzi di montaggio; pipetta da un angolo per rimuovere tutta l'aria, lasciare asciugare e sigillare con smalto.
18. Per valutare il numero di neuroni dopaminergici in uno specifico cluster acquisire una serie di sezioni ottiche lungo l'asse z con un 1,0 micron step-size utilizzando un microscopio confocale (per l'identificazione di cluster anatomica dopaminergici nel cervello adulto Drosophila vedi ^7).

Abbiamo utilizzato i saggi descritti qui per studiare il ruolo della sollecitazione protettiva Nrf2 percorso in un modello di Drosophila PD 14. Questo modello si basa sull'espressione del gene α-sinucleina umana in neuroni DA utilizzando un TH GAL4 pilotaggio 2, 10.

La figura 1 mostra un risultato rappresentativo di un geotassi negativi trasalimento indotte (climbing) del saggio in mosche maschio che esprimono diversi transgeni sotto il controllo del guidatore TH Gal4. Tutti i genotipi testati mostrano una diminuzione dell'attività locomotoria nel corso del tempo, tuttavia, vola esprimendo il PD-linked, umano α-sinucleina transgene mostrano un declino accelerato rispetto alle mosche di controllo di pari età (TH Gal4 solo conducente) o vola co-esprimono il Nrf2 DNA partner di legame Maf-S. Risultati simili sono stati osservati in mosche di sesso femminile.

La figura 2 illustra un risultato rappresentativo per un TH immunofluorescenza basata DAneurone conta. L'effetto di differenti background genetici sul numero di PPL1 neuroni nel cervello da 4 settimane di età mosche maschio è quantificato come descritto nella legenda della figura. Si noti la piccola ma significativa perdita di neuroni nel cervello PPL1 dalle mosche che esprimono α-sinucleina.

Figura 1. Mosche trasalimento indotta saggio geotassi negativo. Coorti di età corrispondenza dei genotipi indicati, sono stati testati per l'attività locomotoria a intervalli di una settimana. Attività arrampicata stata calcolata contando il numero di mosche sopra il 2 cm tacca 10 sec dopo aver premuto il flaconcino ed esprimendo tale valore come percentuale del numero totale di mosche contenuti nel flaconcino. I dati mostrano significa ± SEM di cinque coorti indipendenti di 20-30 mosche. La significatività è stata valutata con una ANOVA a due vie con Bonferroni post-hoc test di (P <0,05). La differenzatra TH, α-Synflies e mosche degli altri tre genotipi testati è stato significativo a 4 e 5 settimane.

Figura 2. Rilevamento e conteggio dei neuroni DA da TH immunofluorescenza. A. Diagramma di flusso che illustra il protocollo per la preparazione di vetrini cerebrali. Per una descrizione più dettagliata di ogni passo vedi testo. B. Rappresentante micrografia di un monte intero cervello (hemibrain destra, vista posteriore) immunostained per TH. Una serie di immagini Serie Z confocale è stata acquisita con una Leica SP2 microscopio confocale, obiettivo olio 40X (N / A 1,25), telaio media 2, step-size 1 micron, in un formato di 1.024 x 1.024 e compilato come proiezione massima ( mostrato). La posizione del DA neurone grappolo PPL1 è evidenziato. C. Rappresentante resuLTS per DA neurone conteggi ottenuti utilizzando TH immunoistochimica. Il numero di neuroni nel cluster PPL1 stata valutata esaminando le singole immagini di ogni confocale z-serie. N rappresenta il numero di campioni indipendenti analizzati per ogni genotipo. I dati sono medie ± SEM significatività è stata valutata con il test t di Student (* P <0,05). Clicca qui per ingrandire la figura .

Genotipi: 'Con', THGal4 / +; THGal4 / +; 'UAS-Syn', THGal4, UAS
-ΑSynuclein / +; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'UAS-Maf-S', THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +; 'UAS-α Syn / UAS-Maf-S', THGal4, UAS-αSynuclein / UASMaf-S; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'KEAP1 EY5', THGal4 / +; THGal4/keap1 EY5; 'UAS-α Syn/keap1 EY5', THGal4, UAS-αSynuclein / +; THGal4, UAS -αSynuclein/keap1 EY5.

[Tratto da Barone et al. 2011), in accordo con l '"open access" politica dei "modelli di malattia e meccanismi".]

Sottolineamo che non abbiamo interessi finanziari concorrenti.