Un romanzo ad alta risoluzione<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica di imaging per studiare la risposta dinamica di strutture intracraniche alla crescita del tumore e Terapeutica

Sommario

Descriviamo un romanzo In vivo Tecnica di imaging che le coppie fluorescenti topi chimerici con finestre intracraniche e ad alta risoluzione microscopia a due fotoni. Questa piattaforma di imaging ausili studi di cambiamenti dinamici nel tessuto cerebrale e del microcircolo, a livello di singola cellula, a seguito di insulti patologici ed è adattabile per valutare la somministrazione di farmaci intracranica e la distribuzione.

Abstract

Abbiamo integrato con successo precedentemente stabilito intracranica finestra (ICW) tecnologia ^1-4 con intravital 2-fotone microscopia confocale di sviluppare un nuovo piattaforma che permette una visualizzazione diretta lungo termine della struttura del tessuto cambiamenti intracranially. Imaging ad una risoluzione di singola cellula in un modo in tempo reale fornisce informazioni dinamiche supplementari oltre i limiti previsti dalle analisi istologiche standard di end-point, che guarda unicamente a 'snapshot' sezioni di tessuto.

La creazione di questa tecnica di imaging intravitale in fluorescenti topi chimerici, siamo in grado di immagine quattro canali fluorescenti simultaneamente. Incorporando cellule fluorescente, come GFP + midollo osseo, è possibile monitorare il destino di queste cellule che studiano loro migrazione lungo termine, l'integrazione e la differenziazione all'interno del tessuto. Ulteriore integrazione di una cella giornalista secondario, come ad esempio una linea tumorale mCherry glioma, consente caratzazione di interazione fra cellule. I cambiamenti strutturali nel microambiente del tessuto possono essere evidenziati attraverso l'aggiunta di coloranti intra-vitali e gli anticorpi, per esempio anticorpi CD31 con tag e molecole destrano.

Inoltre, si descrive la combinazione del nostro modello di imaging ICW con un animale di piccole micro-irradiatore che prevede l'irradiazione stereotassica, la creazione di una piattaforma attraverso la quale i cambiamenti del tessuto dinamici che si verificano in seguito alla somministrazione di radiazioni ionizzanti possono essere valutati.

Attuali limiti del nostro modello includono penetranza del microscopio, che è limitata ad una profondità di fino a 900 micron dalla superficie sub corticale, limitando l'imaging all'asse dorsale del cervello. La presenza del cranio dell'osso rende la ICW una procedura tecnica più impegnativo, rispetto ai modelli a camera più consolidate e utilizzate attualmente utilizzati per studiare tessuto mammario e cuscinetti adiposi ^5-7. Inoltre, la ICW providi molte sfide durante l'ottimizzazione della formazione immagine.

Introduzione

Una migliore comprensione dei cambiamenti strutturali e biologiche che sorgono nel cervello in risposta a varie patologie, ed interventi terapeutici è critico per migliorare le strategie di trattamento. Tuttavia, una delle sfide attuali in studio di questi cambiamenti strutturali e biologiche, in particolare per quanto riguarda le patologie intracraniche, è l'inaccessibilità del tessuto e l'incapacità di studiare l'evoluzione temporale e progressione dinamica dei cambiamenti in un ambiente in vivo. La generazione della tecnologia "finestra" ha già avuto successo in esame i cambiamenti dei tessuti molli attraverso lo sviluppo del tumore ^5-7. Sviluppo di modelli ICW dimostra di essere più tecnicamente difficile, a causa della necessità di rimuovere l'osso cranio senza danneggiare il istigare infezione del tessuto cerebrale sottostante. Precedenti lavori hanno tentato di assottigliare il cranio per visualizzare le ^8-10 tessuto tuttavia, per la produzione di alta risoluzione chiara imè richiesta piena età rimozione dell'osso cranio ^11. Ripetere a lungo termine di imaging (30 giorni +) solo recentemente è divenuta un'opzione fattibile attraverso l'imaging ^1,11, precedentemente tempi più brevi sono stati studiati ^5.

Negli ultimi dieci anni un importante obiettivo è stato quello di chiarire l'origine di neo-vascolarizzazione seguenti stimoli patologici, in particolare in risposta alla formazione del tumore e la progressione, per fornire nuovi bersagli terapeutici per il trattamento dei tumori. Molte controversie rimane attorno alla fonte di nuova vascolarizzazione nel cervello durante lo sviluppo del tumore o radiazioni seguente. Tradizionalmente vascolarizzazione è stata considerata avvenire attraverso l'angiogenesi, un processo mediante il quale i nuovi vasi formano dalla germinazione dei vasi pre-esistenti ^12. Studi più recenti tuttavia, suggeriscono che il processo embrionale precedenti ipotesi di vasculogenesi può giocare un ruolo più rilevante nella formazione di vascolarizzazione patologica. Vasculogenesis comporta l'assunzione delle controparti angioblast adulte dal midollo osseo, che a loro volta sono poi direttamente coinvolta nella formazione di nuovi vasi endotelio ^12-14. Accumulando evidenza indica che le cellule precursori endoteliali sono mobilitate dal midollo osseo di avviare ex novo la formazione dei vasi in risposta a mediatori oncogeni ^15-17. Tuttavia, questi studi forniscono prove contraddittorie per il contributo diretto di queste cellule derivate del midollo osseo (BMDCs) a vaso endotelio con contributo percentuale variabile con il tipo di stimolo patologico e la risposta al trattamento ^18-21.

Pertanto, stabilire metodi sperimentali riproducibili che consentono ad alta risoluzione di immagini intravitale per ripetute studio a lungo termine del processo di integrazione BMDC in vasi tumorali e in risposta alla terapia è inestimabile. Tecniche istologiche standard non riescono a fornire le infor dinamicamazioni necessaria per determinare la sopravvivenza a lungo termine, differenziazione e integrazione delle cellule che danno origine a neovascolarizzazione e quindi non possono dimostrare definitivamente i meccanismi di interazione cellulare.

Abbiamo dimostrato utilizzando il nostro approccio sperimentale che c'è un grado variabile di assunzione BMDC seguendo sia radiazioni ionizzanti intracranica e la crescita tumorale, un reclutamento che è tuttavia patologia luogo specifico e non un invasione di tutto il tessuto intracranico ^11,22. Abbiamo dimostrato che l'assunzione segue un modello sensibile tempo dimostrato dalla rappresentazione ripetuta di un singolo animale ^11,22. Allo stesso modo, imaging in vivo può anche fornire informazioni preziose in mimetismo delle cellule tumorali per cui le cellule tumorali fluorescente tag possono essere esposte e monitorati con un intra-CD31 anticorpi vitali per le cellule endoteliali per evidenziare la possibilità di transdifferenziazione delle cellule tumorali di formare direttamente il proprio endotelio.

La versatilità del modello è esaltata dalla capacità di immagine 4 canali fluorescenti, fornendo un numero esauriente di combinazioni per lo studio di variare processo cellulare e biologici. Siamo in grado di intravitally immagine CFP (azzurro), GFP (verde), Cherry / RFP (rossa), e Alexa647/APC (rosso lontano), contemporaneamente in un singolo campo più volte nel corso del tempo. Ricercatori possono modificare le cellule geneticamente per esprimere fluorocromi per ciascuno dei canali e coloranti acquisto e anticorpi per evidenziare cambiamenti strutturali di particolare interesse. Ad oggi coloranti e anticorpi comunemente utilizzati negli studi includono CD31 e destrano cui entrambi evidenziare il microcircolo e le sue variazioni di tessuto ^1,11,23,24, sebbene abbiamo utilizzato il canale rosso lontano per questo scopo entrambi sono disponibili per l'uso in altri canali citati. Allo stesso modo, altri coloranti compresi Sytox Arancione, che metterà in evidenza le aree di apoptosi, e marcatori come quelli della società Visen, sono stati specifically progettato per l'uso in vivo. Ulteriormente ai quattro canali fluorescenti comunemente utilizzati citate, una generazione di seconda armonica (SHG) canale può essere aggiunto e ottimizzato per le fibre di collagene immagine endogene del modello ^7, visualizzando la membrana basale vascolare circostante.

Per dimostrare la capacità di adattamento del nostro modello, così come le interazioni cellula-cellula menzionati sopra, abbiamo potuto studiare interazioni farmaco-cellula. Abbiamo esaminato gli inibitori della droga come AMD3100, un inibitore SDF-1, e il suo ruolo nelle reti coinvolte nel reclutamento BMDC ¹¹ segnalazione. Allo stesso modo abbiamo geneticamente fuori U87 glioma cellule xenotrapianti di esprimere VEGFTrap, un inibitore VEGF ^25, in combinato disposto con un IRES ad una molecola di GFP. Utilizzando RFP + BM siamo in grado di studiare il ruolo di VEGF ha sul reclutamento di BMDCs alla vascolarizzazione. Più di recente abbiamo utilizzato il modello per studiare la cinetica dei farmaci guardando il mechanism dietro il tumore-delineando farmaco fluoresceina ^26, a livello cellulare. Attraverso l'uso di una misura costruito in casa piccoli animali irradiatore siamo stati in grado di integrare stereotassica radiazioni somministrata per valutare la risposta del tumore e sia BMDCs al trattamento.

Attraverso l'uso dei nostri nuovi intravitale ricercatori metodo di imaging sarà ottenere informazioni sui monocellulari tempo reale i cambiamenti che si verificano in varie patologie e dei sistemi, favorendo la delucidazione di molte caratteristiche funzionali e biologiche dei cambiamenti del tessuto.

Protocollo

OGNI INTERVENTO animale è stato effettuato nell'ambito di un cura degli animali e COMITATO uso approvato PROTOCOLLO E effettuata nel rispetto di tutte le linee guida, regolamenti e le agenzie di regolamentazione.

Per la tabella di riferimento sulla risoluzione dei problemi 2.

1. Midollo Osseo Ricostituzione (opzionale) Figura 1 (30 min di preparazione, 5 min per il mouse)

Tutto l'intervento chirurgico dovrebbe essere eseguito utilizzando rigorosa tecnica asettica con materiale sterile autoclavato.

Un topo donatore ricostituire tre topi ospitanti.

1. Anestetizzare destinatario topi e posizione NODscid, con il piombo per schermare la testa, all'interno del centro del GAMMACELL 40 'exactor' irradiatore.
2. Irradiare topi NODscid con 2,5 Gy di irradiazione corporea totale (TBI).

PUNTO CRITICO: Ottimizzazione della TBI può essere necessaria a causa della variazione nella dose necessaria per sufficiente ospite immunitario cedeplezione ll in differenti ceppi di topi.

Punto Pausa: topi host possono essere irradiati in anticipo, ma deve essere utilizzato entro 24 ore di irradiazione.

3. Euthanize topi donatori secondo le linee guida del comitato per la cura degli animali istituzionali. Pulire gli arti posteriori e rimuovere la tibia e il femore da entrambi, stripping tutti i tessuti in eccesso dalle ossa (figure 1AI, 1aii).

PUNTO CRITICO: ossa perone non sono vitali per l'uso a causa di lumen molto stretti.

4. Rimuovere piastre terminali da entrambe le estremità quattro ossa estratte e stanarli utilizzando un ago G 22 e 1 ml di PBS sterile fino a quando sono bianchi in apparenza (Figura 1aiii). Tabella di riferimento 2.
5. Mescolare il midollo estratto osseo (BM) sospensione e prendere 300 ml in tre aghi 27 G tubercolina. Estratto BM dovrebbe contenere circa 2 x 10 ⁷ cellule eè sufficiente per 3 ospitanti topi ricostituzioni. Tabella di riferimento 2.
6. Iniettare la sospensione nella vena caudale laterale di tre topi NODscid precedentemente irradiate dalla fase 1.1 (Figura 1b). Tabella di riferimento 2.

ATTENZIONE: Per controllare la sterilità del BM iniettato consigliamo placcando il restante BM e cultura per 24 ore per verificare la presenza di infezione. Prima causa di morte, a questo punto è l'infezione nei topi appena ricostituiti.

2. Intracranica Finestra Generation - Figura 2 (30 min per il mouse)

Tutto l'intervento chirurgico dovrebbe essere eseguito utilizzando rigorosa tecnica asettica con materiale sterile in autoclave e sotto una lampada di calore per mantenere gli animali caldo (Figura 2A).

1. Anestetizzare topi riceventi NODscid con IACUC approvato anestetico, Avertin iniezione IP a 0,5 mg / g e posizione, con il piombo per schermare la testa, all'interno del centro delGAMMACELL 40 'esattore' irradiatore. Rimuovere i capelli dal cuoio capelluto. Inoltre applicare il gel lacrima per prevenire la disidratazione della cornea.
2. Prima con Betadine soluzione e poi pulita con alcool cuoio capelluto, quindi praticare un'incisione dal punto medio delle orecchie a appena sopra gli occhi. Rimuovere cuoio capelluto 3 millimetri ai lati della prima incisione, esponendo il cranio e punti di riferimento della superficie del cranio (Figura 2BI).
3. Elevare il periostio iniettando lidocaina al 2%: soluzione epinefrina e sezionare lontano dalla superficie del cranio (Figura 2Bii).
4. Utilizzando 2,7 millimetri trapano trapano, indebolire un mm cerchio del cranio 2.7 sulla corteccia dell'emisfero destro tra lambda e bregma. Non penetrano l'osso con la fresa (Figura 2Biii). Tabella 2 Riferimento.

PUNTO CRITICO: se punta passa attraverso il cranio, la superficie del cervello sarà danneggiato risultati influenzano con ulteriore TRAUMA. Inoltre si verificherà sanguinamento eccessivo impedendo una chiara finestra venga generato.

5. Togliere il lembo osseo indebolito con pinzette dissezione e gancio dentale e forza intenzionale ma controllata (Figura 2Biii).
6. (Facoltativo) Se guardando patologia tumorale, iniettare linee cellulari tumorali scelti (con gene reporter fluorescente) al centro della finestra generato nel passo 2.5.
   1. Caricare 10 microlitri 30 G siringa Hamilton con la sospensione cellulare e ago di carico in un frame stereotassico.
      PUNTO CRITICO: numero di cellulare avrà bisogno di essere ottimizzato per le cellule tumorali in uso e la linea temporale della crescita necessaria. Per U87 culture usiamo 2 x 10 ⁵ cellule in 10 microlitri per mouse.
   2. Caricare il mouse sul telaio stereotassico digitale allineare l'ago al punto della finestra generato centro.
   3. Dell'ago inferiore fino a che raggiunge la superficie corticale e reimpostare le coordinate digitale.
   4. Bassoer l'ago a 3,2 mm nel tessuto corticale e iniettare in profondità di 3 mm.
   5. Ritrarre l'ago lentamente poi togliere il mouse dal telaio.
      PUNTO CRITICO: Iniettare la soluzione per tutta la durata di 1 minuto e lasciare l'ago in posizione dopo l'iniezione per assicurare ridotto riflusso.
      PUNTO CRITICO: se si verifica emorragia minore irrigare con soluzione salina sterile per 1-5 minuti per fermare l'emorragia superficiale. Procedere con i passi successivi.
7. Inumidire superficie del cervello con una goccia di PBS sterile per mantenere il tessuto cerebrale irrigato.
8. Galleggiante da 3 mm coprioggetto sulla superficie del cervello per sigillare completamente intorno alla finestra mm 2.7 generato. Tabella di riferimento 2.
9. Secco cranio circostante osso quindi applicare Vetbond a tutta cranio esposto al tessuto del cuoio capelluto richiudere alle ossa del cranio e il vetrino in posizione. NON applicare un eccesso come vi saranno perdite sotto il vetro e diminuire il potenziale di imaging.
10. Mix fresco dentale polvere acrilica e la soluzione, circa il 30% (w / v), e applicare sopra la parte superiore del Vetbond. Per assicurare una buona tenuta si sovrappongono l'acrilico leggermente sul bordo vetrino di vetro (Figura 2Biv). Tabella di riferimento 2.

ATTENZIONE: Dental acrilico è estremamente pericolosa per cui si consiglia l'uso di guanti e maschera durante tutta la procedura.

PUNTO CRITICO: Dental acrilico deve rimanere flessibile durante lo stampaggio per assicurare una buona tenuta e ridurre l'eccesso. Accumulo di acrilico su la finestra si offuscare le immagini.

11. Consentire topi di recuperare in una gabbia calda.

3. Stereotassica radiazioni (Opzionale) - Figura 3 (25 min per il mouse)

Variazioni esisteranno nei diversi irradiatori usato e come sarà richiesto tale ottimizzazione. Abbiamo usato un irradiatore design su misura.

1. Anestetizzare topiutilizzando Isoflurane al 4% per l'induzione seguita da 1,5-2% in tutta la procedura con 0,5-1 litri di O ₂ un minuto, e posto sul dispositivo di immobilizzazione testa personalizzata all'interno del irradiatore stereotassica (Figura 3Ai).
2. Ottenere un fascio conico 360 ° TAC con il tubo radiogeno esecuzione a 40 kVp e 0,05 mA attraverso un filtro di alluminio da 2 mm. Usare l'immagine per guidare il movimento della scena, dirigendo la radiazione isocentro all'emisfero destro assicurando che sia centrale nella direzione ventrale dorsale.
3. Inserire il collimatore emisferico da 8 mm x 11 mm di blocco.

PUNTO CRITICO: Collimatori possono essere progettati per molte configurazioni diverse, e così può essere migliorata per includere ed escludere le diverse parti del cervello. 8 millimetri x 11 mm definisce una superficie emisferica del cervello.

4. Ottenere singole immagini CT ortogonali sia dall'alto (AP) e inferiore (PA) attraverso il collimatore per migliorare ulteriormente il posizionamento del cervello, anatstrutture ossee omical possono essere utilizzati per la riproducibilità.
5. La sostituzione del filtro alluminio per un trattamento di rame 0,93 mm filtra e amministrare la metà della dose di radiazione desiderato con il tubo radiogeno esecuzione a 225 kVp e 13 mA dalla parte superiore in senso AP.
6. Cavalletto ritornare nella posizione inferiore e amministrare la seconda metà della dose di radiazione di nuovo con il tubo radiogeno funziona a 225 kVp e 13 mA forma il fondo in una direzione PA.

PUNTO CRITICO: è essenziale per irradiare sia dalla parte superiore e la parte inferiore per ridurre il gradiente RT attraverso il tessuto cerebrale, aiuta anche con l'allineamento del isocentro al centro del cervello.

4 In vivo a due fotoni del laser di Microscopia -. Figura 3 (1-3 ore per sessione)

Variazioni esisteranno nei diversi microscopi usati e come sarà richiesto tale ottimizzazione. Abbiamo usato un Carl Zeiss LSM510 META Laser Scanning Confocal microscopio.

1. Anestetizzare topi con IACUC approvato anestetico, Avertin iniezione IP a 0,5 mg / g e pulito finestra usando spruzzo di alcol.
2. 1. (Opzionale) Iniettare tagged vascolare colorante 5-10 minuti prima di imaging, nella vena della coda prima di imaging. Alexa647-destrano usato a 0,35 mcg / g o CD31-APC utilizzato a 0,2 mcg / g. Vedere la Tabella 2.
   2. (Facoltativo) Iniettare fluoresceina attraverso la vena della coda alla dose di 7,7 mg / kg, 5 min prima di imaging, per delineare tumore. Tabella di riferimento 2.
3. I canali di installazione sul microscopio confocale come determinato dal fluorocromo utilizzato nel topo chimerico generato. Tabella 1 mostra i canali descritti in questo modello.
4. Capovolgere il mouse sul palco microscopio mobile e stabilizzare la testa in posizione con la plastilina modellabile. (Figura 3Aii) Tabella di riferimento 2.

PUNTO CRITICO: La ICW deve essere perpendicolare al punto laser e come tale deve essere posizionato orizzontalmente per garantire l'imaging è ottimale.

5. Accendere il primo laser canale e utilizzare per posizionare al centro della ICW.
6. Usare lenti 5x e prendere una immagine dell'intera finestra da utilizzare come mappa per ulteriori immagini a risoluzione superiore.
7. Imaging deve essere effettuata utilizzando 10X e lenti 20X 'lungo raggio' per ottenere la migliore qualità di immagine.

PUNTO CRITICO: I canali e gli obiettivi sul 2PLM deve essere impostato utilizzando cellule ingegnerizzate in vitro prima della rappresentazione di modelli murini per assicurarsi che evidenziano la corretta fluorocromo.

Fluorocromo	CFP	GFP / fluoresceina / FITC	mCherry / RFP / DsRed	APC / Alexa647	SHG autofluorescenza
Laser di eccitazione	458 nm	488 nm	543 nm	633 nm	Chameleon laser 820 nm
Collezione Filter	480-520 nm	500-550 nm	565-615 nm	650-710 nm	390-465 nm

Tabella 1. Guide di configurazione fluorocromo. Per l'utente per vedere il laser di eccitazione e collezionista spettri di emissione utilizzati per ciascuno dei canali disponibili nel modello.

Risultati

La fase opzionale di ricostituire la BM di topi NODscid dovrebbe risultare in un assorbimento 80% del fluorescente 'donatore' BM nel 100% dei 'Host' topi il NODscid, tuttavia l'ottimizzazione della TBI sarà tenuto a migliorare la ricostituzione in altri non ceppi-immunocompromsed. Se i topi sono senza successo ricostituiti si ammalano e muoiono rapidamente seguendo la procedura, i topi indeboliti possono richiedere cibo supplementare e le fonti d'acqua.

La ICW una volta finito dovrebbe assomigliare a quello visto in Figura 2Biv. E 'ideale per avere una cresta di acrilico che circonda il vetrino di vetro come questo dà forza per il join con il cranio. Finestre perfetti sono riproducibili e permettono di immagini ripetute fino a 8 settimane dopo la loro generazione (Figura 2C). Immagini prodotte attraverso queste finestre ottimali sarà come quelli visti in Figura 3Bi. Imperfezioni nella generazione finestra produrranno immagini di poveriqualità per esempio, bolle d'aria sotto la finestra impedirà interi campi di vista sta eseguendo l'acquisizione, aree appare scuro come l'aria impedisce al laser imaging (Figura 3Bii). Con eccesso di colla e acrilico su coprioggetto ci sarà un elevato livello di sfondo fluorescenza e le zone del campo viene cancellato come si vede in Figura 3Biii, allo stesso modo in caso di imbrattamento sulla finestra piccoli punti di fluorescenza di fondo saranno visibili nel campo (Figura 3Biv).

Successo di ICW dell'imaging è predeterminato dalla integrità della tecnica chirurgica, tuttavia, anche ICWS ottimali possono incontrare problemi durante la sessione di imaging. Come tale, una portata e del grado di chiarezza esiste nelle immagini generate come visto in Figura 3. L'immagine di qualità pubblicazione ritratta in figura 3C si verifica quando tutto è ottimale. Anche se non è possibile per tutti i topi, è fattibile aspettarsi 80% dell'immagines generati a guardare come questo. Uno dei maggiori difetti nella configurazione attuale microscopia è l'uso di laser invertiti. I topi devono essere posizionati sulla schiena e questo si traduce in stress eccessivo e il disagio che può portare a respiro affannoso durante l'imaging. Questo produce un immagine 'foderato' come la respirazione interferisce con la media che si verifica durante l'imaging, per cui, ogni riga di pixel è ripreso quattro volte e la media dei quattro è visualizzato nell'immagine finale. Qualsiasi movimento durante il calcolo della media, come quella causata da respiro affannoso, creerà un manufatto che appare come una linea sull'immagine, come visto in Figura 3D. I topi che non sono sufficientemente anestetizzato durante l'imaging possono riscontrare questo problema anche. L'effetto 'foderato' può essere diminuito limitando l'immagine media su on, tuttavia questo a sua volta riduce la qualità dell'immagine, e non può eliminare il problema. In alternativa, i topi possono essere riposizionati o nuovi tentativi quando la respirazione si è normalizzata. L'uso oF AN 2PLM verticale sarebbero negare questo problema come topi potevano essere ripreso 'in posizione prona'. Un ulteriore problema con l'imaging su un 2PLM invertita include la limitata accessibilità per il posizionamento della ICW una volta che il mouse si trova sul microscopio, e questo porta a immagini 'segmentate' come quelli visti in Figura 3E. Qui il laser e coprioggetto non sono ortogonali tra loro e come tale la rappresentazione si verifica in un angolo. Ciò provoca la generazione di una immagine 'segmentata' dove i lati del campo di vista non vengono esposte. Il problema si risolve facilmente con il riposizionamento del mouse per assicurare il vetrino è completamente orizzontale, una volta sulla testa di montare come si vede nella figura 3Aii.

Il modello qui presentato è stato specificamente utilizzato per esaminare il ruolo di BMDCs nella vascolarizzazione del tessuto tumorale e dimostra la capacità di utilizzare tre diversi canali contemporaneamente (Cherry, GFP, Far-rosso - Alexa647 e APC) making della PCP e SHG ridondante per questa particolare storia. Siamo stati in grado di topi immagine longitudinalmente per un massimo di otto settimane, studiando il reclutamento e l'integrazione delle cellule midollari nel sistema vascolare a livello di singola cellula, senza effetti negativi causati dalla finestra. Questo modello dimostra la facilità di raccolta delle informazioni dinamiche sulla fonte e la formazione del sistema vascolare e l'interazione di diversi tipi di cellule di interesse, precedentemente persi con l'analisi istologica punto finale.

Passo	Problema	Ragionamento	Soluzione
1.4	Bone frantumi	Utensili consumati	Raccogliere midollo osseo formare un topo fresco con forbici affilate o lama fresca bisturi, frammenti ossei possono inibire l'iniezione TV
1.5	Bassa estrazione (bassa viscosity)	Piastre laterali osso tagliato troppo distalmente; poveri metodo di raccolta	Le ossa dovrebbero essere tagliati come prossimalmente possibile e raccolti con l'osso all'interno del tubo di raccolta per evitare alzatina Ora dovrebbe essere speso per estrarre il massimo BM e con cura Se Piscina necessario più di un topo in 1 ml
	Alta Estrazione (alta viscosità)	Tampone a bassa raccolta	Diluire la soluzione con il più 0,1% di BSA, diviso per tre topi riceventi fino a 500 microlitri per massimo del mouse
1.6	Bad iniezione endovenosa	Povero vasodilatazione e visibilità nave	Migliora la dilatazione con lampada di calore. Posto del mouse in coda vena immobilizzazione con costruito in fonte di luce per facilitare l'accesso
1	I topi malati	Infezione	Sacrifica topi secondo le regole dell'istituzione. Assicurarsi vengono pulite le code prima dell'iniezione e controllare la sterilitàdi estratto BM nella cultura
	I topi muoiono	Povero BM captazione	Verificare% di fluorescenza assorbimento BM di topo morto. Ottimizzare TBI per ceppo di topi in uso Aumentare la quantità di BM di iniezione (ad esempio uso un mouse donatore per due riceventi)
2.4	Emorragia Minori	Dura violato durante la perforazione	Pressione con cuscinetti in gel e e continuo lavaggio salina sterile
	Maggiore emorragie	Cervello danneggiato da perforazione	Sacrifica il mouse secondo le linee guida delle istituzioni
2.8	Bolle d'aria sotto il vetrino coprioggetto	Problemi di contatto con la superficie corticale impedisce il corretto posizionamento	Rimuovere vetrino e aggiungere ulteriore PBS a galleggiare il coprioggetto sulla finestra per rimuovere le bolle
2.10	Slittamento del vetrino durante l'incollaggio	Acrmassa ylic è pesante, mettendo pressione sul vetrino e sposta il vetrino di mezzo	Pinzetta dovrebbe essere utilizzato per contenere coprioggetto giù mentre vengono applicati Vetbond e acrilico
4.2	Bad iniezione endovenosa	Povero vasodilatazione e visibilità nave	Migliora la dilatazione con lampada di calore. Posto del mouse in coda vena immobilizzazione con costruito in fonte di luce per facilitare l'accesso
4.4 Figura 3C	Immagini 'foderato'	Affannoso o respirazione irregolare	Rimuovere il mouse dal telaio e permettere di recuperare Aumentare il livello di anestetici somministrati e regolare la posizione per garantire il collo non è eccessivamente flessa o estesa per impedire la respirazione
Figura 3C	Immagine 'segmentata'	Cervello non è parallelo obiettivi	Regolare la posizione del vetrino per assicurarsi che sia piatta
	Nave non visualizzato	iniezione non si vede per via intravascolare	Ripeti l'iniezione in vena della coda alternativa, coda caldo per garantire una buona vasodilatazione
	Alta sfondo	Sporca coprioggetto, Bolle d'aria, acrilico	Pulire vetrino con un panno umido di etanolo al 70%, non si impregna come può penetrare sotto acrilico e danneggiare il tessuto cerebrale

Tabella 2. Risoluzione dei problemi. Una linea guida per interventi correttivi necessari per aree problematiche delle procedure.

Schemi 1. Diagramma di flusso sperimentale. Ciò dimostra la cronologia degli eventi attraverso fasi sperimentali 1-4. Modelli murini sono settati più di una settimana, pergarantire la BM ricostituisce correttamente, e non sono trattati con farmaci fino al giorno 7 del tumore al fine di garantire gli innesti tumorali. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 1. Ricostituzione BM. (A) procedura di estrazione BM i. Dissezione delle ossa degli arti posteriori. Ii. Dissected femore e tibia dagli arti posteriori, pulito e pronto per l'estrazione. Iii. Ossa con fondello rimosso e lavato attraverso, dimostrando l'aspetto bianco delle ossa vuote. (B) Schemata dimostrando dove vene laterali per iniezione sono posizionati nella coda.

Figura 2. Generazione ICW. (A) asettica configurazione consigliata (B) i. Superficie del cranio Esposti rivela i punti di riferimento necessari per la chirurgia, ICW dovrebbe essere posizionato sulla emisfero destro equidistanti dal bregma e Lamda. Ii. Periostieum sollevata con soluzione di lidocaina, pronti per la rimozione . iii. gancio dentale richiesto per la rimozione del frammento osseo generata con il trapano. iv. Terminati ICW con acrilico dentale. (C) Tre esempio finestre dimostrare la riproducibilità del metodo.

Figura 3. 2PLM risultati attesi. Tutte le immagini mostrano verde BM, tumore rosso, blu (pseudo colore rosso lontano) vascolare. (A) i. Dimostra il telaio testa che mantiene il flusso isoflurano all'interno del piccolo irradiatore animale. La x 11 mm collimatore 8 può anche essere visto muoversi attraverso il portale. Ii. Mouse nel invertito posizionato nel telaio prevalenza richiesta per l'imaging, plastercine modellabile assicura tutte le finestre può essere accettata. (B) le foto dimostrative degli esiti di problemi con la generazione finestra da i. una finestra ottimale, ii. una finestra con le bolle d'aria intrappolate sotto, iii fuoriuscita acrilico sopra il vetrino e IV. sporco sulla finestra stessa. (C) mette in evidenza i problemi che si verificano con l'imaging a seguito di successo generazione di un ICW i. ottimale di imaging ii manufatti. respirazionecreare un'immagine 'allineato' iii. coprioggetto non perpendicolari al laser generare un'immagine 'segmentata'. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4. Usi funzionali e adattamenti del modello. (A) CFP di elaborazione delle immagini dopo il quale immagine GFP viene sottratto immagine CFP per rivelare l'immagine PCP vero che può essere sovrapposto agli altri tre canali in bianco. Verde BM, tumore Rosso, Bianco CSC, Blu (pseudo colore rosso lontano) vascolare (B) Dimostrazione delle fibre di collagene che può essere ripreso con SHG. Dextran verde, rosso BM, Ciano Collagene (C) i. cellule VEGFTrap in VitrØ dimostrare il segnale GFP prodotta con il VEGFtrap. ii. imaging in vivo dimostra le cellule VEGFtrap chiaramente e inoltre mette in evidenza la facilità di commutazione dei canali per dimostrare il sistema si sta guardando. Verde VEGFTRap + Tumore, BM Rosso, Blu (pseudo colorata rosso lontano) vascolare. (D) Illustra la raccolta di fluoresceina nello stroma del tumore e non nelle cellule direttamente, mostrata dalla mancanza di segnale sovrapposizione verde con tumore rosso. Verde fluoresceina, tumore Rosso. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussione

I tre canali descritti in tutte le immagini finora sono intercambiabili per i tre marcatori di interesse di altri modelli e foglie ricercatori con una preziosa serie di strumenti per cercare una numerosi tipi di cellule e interazioni. È necessaria la pianificazione per garantire che tutti i marcatori e tipi di cellule hanno integrato con successo una fluorescenza molecola reporter in un canale distinto.

Oltre ai normali tre canali usati qui abbiamo anche potuto integrare un canale PCP quarto (Figura 4A) e una base di collagene SHG canale ⁷ (Figura 4B). Ciò estende la possibilità di guardare interazioni cellulari in vivo e in aggiunta permette all'utente di intraprendere popolazione miscelazione di studiare specifiche interazioni cellula-cellula, mantenendo due canali per altri marcatori. Per esempio, abbiamo preso in considerazione le cellule tumorali (RFP) e le cellule staminali del cancro (PCP) in un rapporto di 1:3 con un interesse per confrontare il loro intratuminterazioni orali (Figura 4A). Abbiamo osservato che sette giorni dopo l'impianto della popolazione mista del rapporto è stata confermata ed entrambe le popolazioni cellulari potrebbe ancora essere visto.

Il canale PCP fornisce problemi tecnici dovuti alla sovrapposizione con il canale GFP in entrambi gli spettri di eccitazione e di emissione e come tale richiede elaborazione post imaging per definire la vera PCP + cellule da quelle che sono effettivamente GFP +. Post-elaborazione di immagini può essere effettuata sui microscopi 2-fotoni costruiti nel software Zeiss LSM direttamente in base al quale, l'immagine GFP viene sottratta dall'immagine PCP conseguente le vere cellule PCP essere lasciati indietro (Figura 4A). La premessa per il rapporto di sottrazione dipende da immagini altrettanto brillanti ed è dovuto al laser CFP (458 nm) fluorescente sia CFP e di cellule GFP, mentre il laser GFP (488 nm) è troppo alto a fluorescenza delle cellule della PCP. Oltre al PCP siamo stati anche in grado di utilizzare le configurazioni precedentemente pubblicati per guardare il SHGlivelli e così raffigurare le fibre di collagene che compongono la membrana basale che circonda vascolare, (Figura 4B).

Altro adattamento di questo modello ha sfruttato un piccolo irradiatore personalizzato costruito animale che ha la capacità di utilizzare radiazioni stereotassica guidata per irradiare le parti di tessuto piccolo come 2 mm di diametro. Di mira la finestra con irradiazione è possibile osservare la radiazione ha effetto sul tessuto sottostante. Abbiamo recentemente pubblicato uno studio guardando la radiazione effetto ha sul tessuto cerebrale normale rispetto al reclutamento di BMDCs alla vascolarizzazione, guardando in particolare al loro ruolo nei cambiamenti del tessuto post-radiazioni. Abbiamo scoperto che il reclutamento dei BMDCs era tempo e dose dipendente in tessuto normale ^11.

E 'fattibile per studiare i meccanismi di fornitura e integrazione di terapie che forniscono il farmaco viene etichettato con un marcatore fluorescente. Durantela nostra ricerca siamo stati in grado di monitorare la produzione di VEGFTrap, un farmaco anti-angiogenico che blocca tutte le segnalazioni VEGF nella zona di produzione ^25. Modificando geneticamente le cellule tumorali per esprimere il gene VEGFtrap accoppiato con un IRES per EGFP (Figura 4CI) e l'utilizzo di RFP 'donatore' BM siamo riusciti a immagine della EGFP: produzione VEGFtrap, interazione BMDC e vascolare contemporaneamente (Figura 4Cii). Ciò ha dimostrato la versatilità del modello e canali disponibili. E 'anche possibile esaminare la cinetica del farmaco a causa della promessa di risoluzione di una singola cellula. Fluoresceina (GFP +) viene utilizzato per delineare i tumori in chirurgia per assicurare resezione massimali si ottengono ^26. Iniettando per via endovenosa, mentre l'imaging è possibile dimostrare che la delimitazione NON avviene attraverso l'assorbimento attivo della fluoresceina nelle cellule tumorali stesse, ma invece attraverso la raccolta del farmaco nella zona stromale con time, visto dalla mancanza di co-localizzazione 10 min dopo l'iniezione della fluoresceina (Figura 4D).

Complessiva nostra strategia combina nuove tecniche e attuale per realizzare una piattaforma sperimentale unico, che è vantaggioso per lo studio di interazioni dinamiche cellulari. Questa strategia ha dimostrato di essere un metodo prezioso per l'esame di alta risoluzione evoluzione dinamica singole cellule BMDC, tumorale e normale vascolarizzazione cerebrale in risposta alla terapia, intracranially. Intravitale di imaging in grado di fornire una migliore comprensione dei regolatori molecolari di BMDC reclutamento, la migrazione e la differenziazione in intracranica vascolare del tumore al cervello, così come molti altri processi dinamici adattabili ad altri campi di ricerca. Putativi fattori inibenti che regolano BMDC in combinazione con altre strategie terapeutiche possono aiutare l'identificazione della tempistica precisa delle terapie combinatorie. Inoltre, questa strategia può essere adattato a molti futuri progetti che utilizza non solo nel vivo intravitale coloranti colorazione, ma anche piccoli inibitori molecolari e nanoparticelle che vengono etichettati con colori fluorescenti che consente ai ricercatori di tracciare la distribuzione e modelli migratori di terapie più mirate e guardare longitudinalmente alla loro cinetica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagent
NODSCID topi	Jackson Lab	001303	8 settimane
B5/EGFP Topi	Jackson Lab	003516
ACTB/DsRED topi Jackson	Lab	005441
Tear Gel	Novartis	T296/2
2% Lidocaina-Epinefrina	Bimeda MTC	25SP	Uso pulito
Vetbond	3M	1469SB
Kit acrilico autopolimerizzante	Bosworth	166260	Utilizzare ~30% (p/v)
10K MW Dextran-Alexa647	Invitrogen	D22914	Utilizzare @ 0,6 mg/kg in soluzione salina
CD31-APC	BDPharmingen	551262	Utilizzare @ 0,3 mg/kg in soluzione salina
AK-fluor (Fluoresceina) 10%	AKORN inc.	NDC 17478-253-10	Utilizzare @ 7,7 mg/kg in
soluzione salina di betadina	Prodotti Purdue	NDC 67618-150
Equipment
Pinzette fini	VWR	82027-402
Forbici per dissezione fine	VWR	25870-002
22G Ago	BD	305156
27G Siringa TB da 0,5 ml	BD	305620
Micro-trapano portatile	Strumenti per scienze fini	18000-17
Punta da trapano in trephine da 2,7 mm	Strumenti per scienze fini	18004-27
10 μ l 30G Siringa Hamilton	Sigma Aldrich	20909-U
Vetrino coprioggetti in vetro 3 mm	Warner Instruments	64-0720 CS-3R
Occhiali a fluorescenza	BLS	FHS/T01	Telaio di base
Telaio stereotassico	stoelting	51950
Mouse retrattile per iniezione endovenosa	Brain Tree	Lifescience MTI