Arginina-vasopressina (AVP) controlla la messa a punto del corpo omeostasi acqua facilitando il riassorbimento di acqua da parte delle cellule principali renali. Qui vi presentiamo un protocollo per la coltivazione di ratto primario midollare interna raccogliere cellule del dotto adatti per la delucidazione dei meccanismi molecolari alla base di riassorbimento di acqua AVP-mediata.
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Articolo metodologico
Coltura primaria Rat midollare interna Raccolta cellule del dotto
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Arginina-vasopressina (AVP) facilita il riassorbimento di acqua da parte renale raccogliendo cellule principali del dotto e quindi una messa a punto del corpo omeostasi acqua. AVP si lega ai recettori V2 della vasopressina (V2R) sulla superficie delle cellule e induce quindi la sintesi di cAMP. Questo stimola processi di segnalazione cellulari che portano ai cambiamenti nella fosforilazione del canale dell'acqua aquaporina-2 (AQP2). Proteina chinasi A phoshorylates AQP2 e innesca così la traslocazione di AQP2 da vescicole intracellulari nella membrana plasmatica facilitando riassorbimento di acqua da urina primaria. Aberrazioni di AVP liberazione dalla segnalazione ipofisi o AVP-attivato nelle cellule principali possono causare il diabete insipido centrale o nefrogenica, rispettivamente, un plasma sanguigno livello AVP elevata è associata a malattie cardiovascolari come l'insufficienza cardiaca cronica e la sindrome da inappropriata secrezione di ormone antidiuretico.
Qui vi presentiamo un protocollo per cultivatiil ratto di primaria midollare interna dotto collettore (IMCD) cellule, che esprimono V2R e AQP2 endogena. Le cellule sono adatti per chiarire i meccanismi molecolari alla base del controllo di AQP2 e quindi di scoprire nuovi bersagli farmacologici per il trattamento di malattie associate alla disregolazione del riassorbimento dell'acqua AVP-mediata. Cellule IMCD sono ottenuti da topo renale midollare interna e sono utilizzati per esperimenti da sei a otto giorni dopo la semina. Cellule IMCD possono essere coltivate in piatti normali di coltura cellulare, boccette e piastre micro-titolo di formati diversi, la procedura richiede solo poche ore, ed è adatto per laboratori standard di coltura cellulare.
Introduzione
Nella raccolta di cellule principali del dotto renali, arginina-vasopressina (AVP) controlla il riassorbimento dell'acqua stimolando l'inserimento del canale dell'acqua aquaporina-2 (AQP2) nella membrana plasmatica. AVP si lega alla proteina-accoppiato vasopressina di tipo-2 recettore G (V2R) stimolare ciclasi e quindi formazione di cAMP. Apertura di questa cascata di segnalazione porta all'attivazione della proteina chinasi A (PKA). PKA fosforila AQP2 a serina 256 (S256), che è la chiave di innesco per la sua ridistribuzione da vescicole intracellulari nella membrana plasmatica. L'inserimento della membrana facilita il riassorbimento dell'acqua lungo un gradiente osmotico e di una messa a punto del corpo omeostasi acqua.
Disregolazione del riassorbimento dell'acqua AVP-mediata, a causa della secrezione di AVP aberrazioni o cause di segnalazione AVP-attivati o è associata a malattie gravi. Diminuzione del riassorbimento di acqua causata da mutazioni di V2R o AQP2 porta a diabete insipido nefrogenico, mentre un elevated livello di AVP plasma sanguigno è associato a un eccessivo riassorbimento di acqua a malattie cardiovascolari come l'insufficienza cardiaca cronica e la sindrome da inappropriata secrezione di ormone antidiuretico (SIADH).
Il significato di riassorbimento dell'acqua AVP-mediata deriva non solo dalla sua implicazione nella malattia. La traslocazione AVP-indotta di vescicole AQP2-cuscinetto a e la fusione con la membrana plasmatica rappresenta un processo di esocitosi strettamente cAMP-dipendente, che attualmente non è ben compreso. Altri esempi per una esocitosi cAMP-dipendente sono secrezione di renina nel rene e H + secrezione nello stomaco. Pertanto, delucidazione dei meccanismi molecolari che regolano la traslocazione-AQP2 in cellule renali principali non solo aiuta a comprendere i processi molecolari simili in altri tipi cellulari, ma può anche aprire la strada a nuove terapie per il trattamento di malattie associate a disturbi del riassorbimento dell'acqua AVP-mediata .
Elucidating meccanismi AQP2 controllo richiede la raccolta modelli di cellule principali del dotto. Per questo un certo numero di differenti linee cellulari di rene di mammifero sono disponibili. Tuttavia, questi modelli hanno diversi inconvenienti. In molti sistemi di celle a livello della proteina di AQP2 è basso (Tabella 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, altri ectopicamente iperesprimono umani (MCD4, WT10) 11,12 o ratto (CD8) 13 AQP2. In MCD4 e cellule COS-7 il recettore V2 non viene espresso. A nostra conoscenza non vi è alcuna linea cellulare permanente come un modello disponibile, che è derivato dal renale midollare interna dotto collettore, la parte del rene AQP2 cui espressione è più abbondante, ma dal dotto collettore corticale 1,11,13-16 . Tali modelli cellulari sono per esempio il diffuso immortalato i mTERT-CCD 14 linee cellulari di recente istituzione mpkCCD (ad esempio 17) o. Entrambe le linee cellulari esprimono endogenamente AQP2 e V2R, ma dal momento che sono derivati daldotto collettore corticale molto probabilmente contiene un proteoma diverso rispetto a midollare interna dotto collettore (IMCD) cellule. Devono per esempio esprimere diversa Na + sistemi di trasporto.
Qui vi presentiamo un protocollo per colture primarie cellule IMCD esprimono V2R e AQP2 endogeno. Questo modello, quindi, rappresenta più fedelmente la situazione fisiologica nel dotto collettore renale. Come istituisce la cultura richiede solo normali attrezzature di laboratorio altri laboratori possono facilmente adottare questo approccio.
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Protocollo
1. Preparazione
- Preparare i piatti della cultura
- Disgelo collagene tipo IV O / N a 4 ° C e sciogliere in 0,1% di acido acetico sterile. Il volume da utilizzare dipende dal tipo e dal numero di piatti in cui le cellule devono essere seminato. Usare 2 ug / cm 2.
- Incubare piatti almeno per 1 ora a RT e lavare due volte con acqua distillata (A. tridest).
- Lasciare i piatti ad asciugare correttamente.
- La supplementazione di medie
- Aumentare il livello di glucosio fino a 4,5 g / L aggiungendo 1,75 g di glucosio a 500 ml di terreno. Per regolare il mezzo a 600 mosmol, aggiungere 100 mM NaCl 100 mM e urea, per aumentare l'osmolarità da 200 mosmol e 100 mosmol, rispettivamente.
- Aggiungere 1% di acidi non essenziali aminoacidi, 1% ultroser, 500 pM dbcAMP, 20 U / ml nistatina e 0,25 mcg / ml gentamicina (diluizione 1:200 di soluzione madre con una concentrazione di 50 ug / ml) a 600 mosmol mezzo DMEM fresco il giorno della preparazione.
- Soluzione enzimatica
- Aggiungere 1 mg / ml di ialuronidasi e 2,2 mg / ml di collagenasi di DPBS-contenente 0,25 mg / ml di gentamicina e nistatina. Preparare 1 ml di questa soluzione di enzimi per la digestione di 2 rene midollare interna. La soluzione deve essere sterilizzata per filtrazione ed è memorizzato in 50 ml provette Falcon.
2. La coltivazione di primaria Rat midollare interna dotto collettore (IMCD) Cells
Tutte le procedure di movimentazione animali devono essere effettuati in conformità con la legislazione locale e federale.
- Anestetizzare topi in CO 2 (in una scatola saturo di CO 2) o isoflurano (U-400 Anestesia unità, Univentor Ltd., Malta, il flusso d'aria 350-400 ml / min con 2-2.5% isoflurano). Decapitare gli animali per i sanguinamenti che consente il rilevamento esatto del confine tra il biancastro interiore e la midollare esterna più scura. Inoltre, il sanguinamento minimizza il numero di eritrociti isolati. Rimuovere i reni elavarli in DPBS sterile addizionato con gentamicina e nistatina (vedi sopra) in ghiaccio. Gli ulteriori passi devono essere effettuate in condizioni sterili banco pulito.
- Trasferire i reni dalla soluzione DPBS su una compressa sterile per rimuovere il liquido in eccesso. Rimuovere la capsula renale grasso con pinze e forbici sterili.
- Avendo il rene ancora risolto nel comprimere, taglio leggermente vicino all'asse longitudinale del (corticale) lato esterno. Assicurarsi di non tagliare completamente, ma di lasciarla in un unico pezzo, collegato nella pelvi renale.
- Con forbici curve con attenzione sezionare la midollare interna biancastra, che sono circondati dal luccicante midollare esterna rosato. Li Raccogliere in DPBS, contenente gentamicina e nistatina in una capsula di Petri 60 millimetri sul ghiaccio.
- Una volta che tutti midollare sono isolati e raccolti su ghiaccio, ridurre il volume di DPBS ad un livello in cui essi sono solo coperti con tampone. Utilizzare una lametta sterile per tagliare la midollare a cubetti di 53 mm.
- Fondere e arrotondare la punta di una pipetta Pasteur sterile tenendolo per breve tempo in una fiamma. Assicurarsi che la pipetta viene raffreddata prima di continuare.
- Trasferire la sospensione dei tessuti per i 50 ml provette Falcon contenenti preparati al momento soluzione enzimatica sterile con ialuronidasi e collagenasi (vedi 1.3.1) utilizzando il arrotondata pipetta Pasteur. Chiudere il coperchio e incubare a 37 ° C sotto continua agitazione (220 rpm) a bagnomaria tavolo regolare per 1,5 - 2 ore.
- Per triturazione della sospensione, la miscela pipettare su e giù diverse volte al tondo pipetta Pasteur (vedere sopra) finché la sospensione diventa torbida omogenea.
- Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 300 xg e 16 ° C. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet a fondo in DPBS, contenente gentamicina e nistatina e centrifugare di nuovo. Ripetere questa fase di lavaggio una volta.
- Risospendere le cellule in terreno completamente integrato e loro seme in cpiatti ultura e / o piastre e micro-titolazione. La preparazione di 2 midollare (1 animali) produce cellule sufficiente per un 60 millimetri piatto di coltura.
- Dopo 24 ore, lavare le cellule due volte con 600 mosmol DMEM e aggiungere mezzo fresco. Durante la settimana successiva le cellule devono essere lavati 2-3 volte (Figura 1). 6-8 giorni dopo la semina, le cellule IMCD possono essere usate per esperimenti. Ricordate di incubare loro in mezzo senza dbcAMP e nistatina per 24 ore prima di iniziare l'esperimento. Altrimenti AQP2 sarà situato esclusivamente nella membrana plasmatica.
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Risultati
La coltivazione di successo di cellule IMCD primari di ratto si tradurrà in un monostrato confluente 6-8 giorni dopo la semina (Figura 2). A 60 millimetri piatto di coltura sono circa 6 x 10 6 cellule. Le cellule strettamente aderire alle piastre di coltura, in quanto questi sono stati rivestiti con collagene di tipo IV, un componente membrana basale 18. Pertanto, le cellule IMCD non staccarsi nemmeno durante le diverse procedure di lavaggio accurato. Fino al 80% delle cellule in c...
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Discussione
Vi presentiamo un protocollo dettagliato per la preparazione e la coltura di cellule IMCD primari di ratto. L'approccio produce fino a 21 cm 2 di cellule da un ratto 20. L'esperimento richiede apparecchiatura standard coltura cellulare e può essere effettuata da una sola persona entro circa 6 ore. Pertanto, questo approccio è adatto come metodo di laboratorio standard.
Cellule IMCD primari di ratto possono essere seminate in piastre di coltura di diverse dimensi...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; KL KL 1415/3-2 e 1415/4-2).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Collagene di tipo IV Mouse | BD Biosciences | 356233 | |
| Ialuronidasi | SIGMA | H6254 | |
| Collagenasi tipo CLS-II | Biochrom AG | C2-22 | |
| DMEM + GlutMAX | Invitrogen GIBCO | 21885108 | |
| Nistatina | SIGMA | N4014 | |
| Ultroser G | Cytogen | 15950-017 | |
| Aminoacidi non essenziali (NEA) | Biochrom AG | K0293 | |
| Gentamicina | Invitrogen GIBCO | 15710 | |
| DBcAMP | BIOLOG | D009 |
Riferimenti
- Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).
- Gluzman, Y. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell. 23, 175-182 (1981).
- Ala, Y., et al. Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).
- Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments. Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).
- Chen, Y., et al. Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).
- Perantoni, A., Berman, J. J. Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium. In vitro. 15, 446-454 (1979).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).
- Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK. In vitro. 12, 670-677 (1976).
- Nedvetsky, P. I., et al. Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase. J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).
- Iolascon, A., et al. Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus. Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).
- Deen, P. M., et al. Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).
- Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line. The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).
- Steele, S. L., et al. Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).
- Bens, M., et al. Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).
- Hasler, U., et al. Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells. The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).
- Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).
- Kleinman, H. K., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochemistry. 25, 312-318 (1986).
- Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).
- Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells. Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).
- Liebenhoff, U., Rosenthal, W. Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel. FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).
- Lorenz, D., et al. Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells. EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).
- Tamma, G., et al. The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho. J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).
- Maric, K., et al. Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells. Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).
- Gonzalez, A. A., et al. Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity. Hypertension. 57, 594-599 (2011).
- Chou, C. L., et al. Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin. The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).
- Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney. Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).
- Tchapyjnikov, D. Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS. Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).
- Stefan, E., et al. Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells. J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).
- Klussmann, E., et al. An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 8/28/2013. Citeable Link.
A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Enno Klussmann
instead of:
Enno Klussman
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Cellule primarie IMCD di rattoIsolamento della midollare internaDigestione enzimatica dei tessutiProtocollo di coltura cellulareSegnalazione dell arginina vasopressinaTraslocazione dell acquaporina 2Espressione del recettore V2Rivestimento di collageneAnalisi Western BlotMicroscopia a immunofluorescenza
