Arginina-vasopressina (AVP) controlla la messa a punto del corpo omeostasi acqua facilitando il riassorbimento di acqua da parte delle cellule principali renali. Qui vi presentiamo un protocollo per la coltivazione di ratto primario midollare interna raccogliere cellule del dotto adatti per la delucidazione dei meccanismi molecolari alla base di riassorbimento di acqua AVP-mediata.
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Articolo metodologico
Coltura primaria Rat midollare interna Raccolta cellule del dotto
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Arginina-vasopressina (AVP) facilita il riassorbimento di acqua da parte renale raccogliendo cellule principali del dotto e quindi una messa a punto del corpo omeostasi acqua. AVP si lega ai recettori V2 della vasopressina (V2R) sulla superficie delle cellule e induce quindi la sintesi di cAMP. Questo stimola processi di segnalazione cellulari che portano ai cambiamenti nella fosforilazione del canale dell'acqua aquaporina-2 (AQP2). Proteina chinasi A phoshorylates AQP2 e innesca così la traslocazione di AQP2 da vescicole intracellulari nella membrana plasmatica facilitando riassorbimento di acqua da urina primaria. Aberrazioni di AVP liberazione dalla segnalazione ipofisi o AVP-attivato nelle cellule principali possono causare il diabete insipido centrale o nefrogenica, rispettivamente, un plasma sanguigno livello AVP elevata è associata a malattie cardiovascolari come l'insufficienza cardiaca cronica e la sindrome da inappropriata secrezione di ormone antidiuretico.
Qui vi presentiamo un protocollo per cultivatiil ratto di primaria midollare interna dotto collettore (IMCD) cellule, che esprimono V2R e AQP2 endogena. Le cellule sono adatti per chiarire i meccanismi molecolari alla base del controllo di AQP2 e quindi di scoprire nuovi bersagli farmacologici per il trattamento di malattie associate alla disregolazione del riassorbimento dell'acqua AVP-mediata. Cellule IMCD sono ottenuti da topo renale midollare interna e sono utilizzati per esperimenti da sei a otto giorni dopo la semina. Cellule IMCD possono essere coltivate in piatti normali di coltura cellulare, boccette e piastre micro-titolo di formati diversi, la procedura richiede solo poche ore, ed è adatto per laboratori standard di coltura cellulare.
Introduzione
Nella raccolta di cellule principali del dotto renali, arginina-vasopressina (AVP) controlla il riassorbimento dell'acqua stimolando l'inserimento del canale dell'acqua aquaporina-2 (AQP2) nella membrana plasmatica. AVP si lega alla proteina-accoppiato vasopressina di tipo-2 recettore G (V2R) stimolare ciclasi e quindi formazione di cAMP. Apertura di questa cascata di segnalazione porta all'attivazione della proteina chinasi A (PKA). PKA fosforila AQP2 a serina 256 (S256), che è la chiave di innesco per la sua ridistribuzione da vescicole intracellulari nella membrana plasmatica. L'inserimento della membrana facilita il riassorbimento dell'acq....
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Protocollo
1. Preparazione
- Preparare i piatti della cultura
- Disgelo collagene tipo IV O / N a 4 ° C e sciogliere in 0,1% di acido acetico sterile. Il volume da utilizzare dipende dal tipo e dal numero di piatti in cui le cellule devono essere seminato. Usare 2 ug / cm 2.
- Incubare piatti almeno per 1 ora a RT e lavare due volte con acqua distillata (A. tridest).
- Lasciare i piatti ad asciugare correttamente.
- La supplementazione di medie
- Aumentare il livello di glucosio fino a 4,5 g / L aggiungendo 1,75 g di glucosio a 500 ml di terreno. Per regolare il mezzo a 600 mosmol, aggiungere 100 mM NaCl 100 mM....
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Risultati
La coltivazione di successo di cellule IMCD primari di ratto si tradurrà in un monostrato confluente 6-8 giorni dopo la semina (Figura 2). A 60 millimetri piatto di coltura sono circa 6 x 10 6 cellule. Le cellule strettamente aderire alle piastre di coltura, in quanto questi sono stati rivestiti con collagene di tipo IV, un componente membrana basale 18. Pertanto, le cellule IMCD non staccarsi nemmeno durante le diverse procedure di lavaggio accurato. Fino al 80% delle cellule in c.......
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Discussione
Vi presentiamo un protocollo dettagliato per la preparazione e la coltura di cellule IMCD primari di ratto. L'approccio produce fino a 21 cm 2 di cellule da un ratto 20. L'esperimento richiede apparecchiatura standard coltura cellulare e può essere effettuata da una sola persona entro circa 6 ore. Pertanto, questo approccio è adatto come metodo di laboratorio standard.
Cellule IMCD primari di ratto possono essere seminate in piastre di coltura di diverse dimensi.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; KL KL 1415/3-2 e 1415/4-2).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Collagene di tipo IV Mouse | BD Biosciences | 356233 | |
| Ialuronidasi | SIGMA | H6254 | |
| Collagenasi tipo CLS-II | Biochrom AG | C2-22 | |
| DMEM + GlutMAX | Invitrogen GIBCO | 21885108 | |
| Nistatina | SIGMA | N4014 | |
| Ultroser G | Cytogen | 15950-017 | |
| Aminoacidi non essenziali (NEA) | Biochrom AG | K0293 | |
| Gentamicina | Invitrogen GIBCO | 15710 | |
| DBcAMP | BIOLOG | D009 |
Riferimenti
- Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line. Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).
- Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. Chara....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells
Posted by JoVE Editors on 8/28/2013. Citeable Link.
A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Enno Klussmann
instead of:
Enno Klussman
Tag
Cellule primarie IMCD di rattoIsolamento della midollare internaDigestione enzimatica dei tessutiProtocollo di coltura cellulareSegnalazione dell arginina vasopressinaTraslocazione dell acquaporina 2Espressione del recettore V2Rivestimento di collageneAnalisi Western BlotMicroscopia a immunofluorescenza
