Questo articolo descrive le procedure per l'analisi di immagini ottiche delle nanoparticelle tumore-mirato, Herdox. In particolare, l'uso dettagliato del dispositivo di imaging multimodale per la rilevazione del tumore orientare e valutare la penetrazione del tumore è descritta qui.
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Articolo metodologico
Analisi delle Targeted proteina virale nanoparticelle distribuito HER2 + Tumori
In questo articolo
Sommario
Abstract
La nanoparticella HER2 + tumore-mirato, Herdox, espone accumulo tumore preferenziale e ablazione del tumore-crescita in un modello animale di cancro HER2 +. Herdox è formato da non covalente auto-assemblaggio di un tumore mirato proteina penetrazione cella con l'agente chemioterapico, doxorubicina, tramite una piccola linker acido nucleico. Una combinazione di elettrofilo, intercalazione, e le interazioni oligomerizzazione facilitare l'auto-assemblaggio in tutto 10-20 particelle nm. Herdox esibisce la stabilità nel sangue e nella conservazione prolungata a temperature diverse. Consegna sistemica di Herdox in topi portatori di tumore provoca la morte delle cellule tumorali, senza effetti negativi rilevabili a tessuto non tumorale, tra il cuore e il fegato (che subiscono danni segnata da doxorubicina non mirati). HER2 elevazione facilita il targeting di cellule che esprimono il recettore del fattore di crescita epidermico umano, quindi tumori che presentavano livelli elevati di HER2 mostrano maggiore accumulo di Herdox rispetto alle cellule exprescantare livelli inferiori, sia in vitro che in vivo. L'imaging di fluorescenza combinata con l'analisi confocale e spettrale situ ha permesso di verificare in vivo del tumore targeting e la penetrazione delle cellule tumorali di Herdox dopo la consegna sistemica. Qui dettaglio i nostri metodi per la valutazione targeting tumorale tramite l'imaging multimodale dopo la consegna sistemica.
Introduzione
Tumore-targeting della chemioterapia ha il potenziale per eliminare le cellule tumorali a dosi inferiori rispetto ai farmaci mirati perché più della terapia erogata può accumulare la destinazione prevista in luogo della distribuzione di tessuto non tumorale. Come quest'ultima situazione sarebbe diluire la efficacia del farmaco e quindi richiedono dosi più elevate per essere efficace, tumore-targeting ha sia vantaggi terapeutici e di sicurezza oltre il trattamento non mirati standard.
Targeting chemioterapia di incapsulamento in nanoparticelle auto-assemblati permette al farmaco di rimanere chimicamente non modificato in contrasto con i farmaci che sono covalentemente legati a molecole di targeting. Come tale collegamento ha il potenziale per alterare l'attività sia del farmaco e la molecola di guida; assemblaggio non covalente permette potenza del farmaco da conservare.
Abbiamo precedentemente dimostrato che il romanzo a tre componenti, complesso auto-assemblati, Herdox, rivolge HER2 + tumori In vivo e suscita l'ablazione del tumore-crescita, risparmiando il tessuto normale, compreso il cuore 1. Herdox è formato attraverso interazioni non covalenti tra la proteina recettoriale cellula-penetrazione, HerPBK10, e l'agente chemioterapico, doxorubicina (Dox), tramite una piccola linker acido nucleico. HerPBK10 lega il recettore del fattore di crescita epidermico umano (HER) e attiva endocitosi mediata da recettore 2-4, mentre endosomal penetrazione membrana viene realizzato attraverso incorporazione della adenovirus-derivato penton base di capside proteico 4-6. Un dominio carica positivamente sulla proteina permette acido nucleico legante 4, 5, attraverso il quale può essere trasportato Dox DNA-intercalato per la somministrazione mirata. Elettrofila, intercalazione, e possibilmente interazioni oligomerizzazione di proteine facilitano l'auto-assemblaggio in tutto 10-20 particelle nm che sono stabili nel sangue e sotto lo stoccaggio prolungato a temperature diverse 1. Preferenziale mira a LEI2 + cellule tumorali è facilitata dalla maggiore affinità ligando quando HER2 è elevata.
Nostri studi precedenti hanno dimostrato che la consegna sistematica delle rese Herdox accumulo preferenziale nei tumori oltre tessuto non tumorale e in confronto a untargeted Dox 1, e la penetrazione nelle cellule tumorali in vivo 7. Abbiamo osservato che Herdox rilasci Dox dopo l'entrata delle cellule tumorali, permettendo l'accumulo di Dox nel nucleo 1. Tumore-accumulo sembra essere correlata con il livello recettoriale, come tumori esprimenti HER2-relativamente bassi accumulano meno Herdox rispetto a quelli con livelli relativamente più elevati HER2 1. Inoltre, la concentrazione effettiva morte cellulare presenta una correlazione inversa con HER2 visualizzazione su linee cellulari tumorali esprimenti differenti livelli di HER2 superficie cellulare 1. Herdox mostra un vantaggio terapeutico e di sicurezza oltre Dox non mirati, come l'uccisione del tumore si verifica in più di dosi 10 volte inferiore rispetto a decomprimeregramme incentrato farmaco e non produce effetti avversi riscontrabili su cuore (rilevata mediante ecocardiografia e istologici macchia) o il fegato (riconosciuto mediante TUNEL macchia) dei tessuti, in contrasto untargeted Dox 1. Nonostante la sua derivazione da una proteina del capside virale, HerPBK10 presenta nessun immunogenicità rilevabile a livelli terapeutici 2. Mentre gli anticorpi preesistenti a tutto adenovirus possono riconoscere HerPBK10, non sono in grado di prevenire vincolante 2 cellule.
Volume del tumore misurata nel tempo è un metodo standard di valutazione dell'efficacia terapeutica delle terapie mirate, ed è stato impiegato per valutare l'efficacia terapeutica di Herdox. Integrando questo approccio con in vivo e ex vivo imaging di fluorescenza intensità ci ha permesso di valutare meglio gli obiettivi di efficienza 7. Abbiamo specificatamente integrato in situ confocale di tumori asportati con analisi spettrale di Dox fluorescenza per verificare che non Herdoxt accumulato solo a tumori in vivo, ma penetrato nelle cellule tumorali e Dox consegnato nel citoplasma e nel nucleo 7. Analisi spettrale inoltre ci ha permesso di distinguere Dox fluorescenza da autofluorescenza 7.
Qui mostriamo più in dettaglio il nostro approccio per la valutazione Herdox in vivo dopo la consegna sistemica, e, soprattutto, per valutare il targeting attraverso metodi di imaging multimodali e di analisi.
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Protocollo
1. Consegna sistemica in vivo
- Mescolare abbastanza Herdox con soluzione salina sterile per equiparare 0,2 ml di una dose mg / kg 0,004 di Herdox per iniezione per 6-8 settimane vecchio mouse cuscinetti sottocutanei tumori xenotrapianto fianco bilaterali nu / nu.
- Disegnare delicatamente il composto Herdox in una siringa da insulina 3/10 cc con ago 29G, evitando le bolle.
- Anestesia è indotta da una breve esposizione isoflurano in una camera di induzione dotato di un sistema di evacuazione fumi gas (portate ossigeno: 0.5-1 L / min, concentrazione isoflurano: 3-4% (o inferiore).
- Iniettare l'intero contenuto nella vena della coda di un topo anestetizzato (0,2 ml per iniezione). IV iniezione può essere eseguita in un ambiente sobrio, topo non anestetizzati.
- Ripetere iniezioni sullo stesso topo per sei giorni più sequenziali, una volta al giorno.
2. Fluorescence Imaging in vivo
L'accumulo di Herdox fluorescenza nei tumori puòessere rivelabile con l'ultimo giorno di iniezione (giorno 7) con un imager multimodale. Le procedure sotto comportano l'impiego di un macro-sistema di illuminazione e rilevazione personalizzata (Figura 1) 8.
- Accendere il Multimode In Imager ottico in vivo.
- Selezionare un filtro passa-banda di emissione (590 nm ± 30 nm) adatto per doxorubicina rivelazione a fluorescenza.
- Accendere Argon-Krypton laser e inserire un filtro passa-banda di eccitazione (488 nm ± 10 nm) nel percorso ottico laser.
- Accendere il sistema di anestesia e quindi posizionare il mouse nella camera di anestetizzante (tassi di flusso di ossigeno: 0,5-1 L / min, concentrazione isoflurano: 3-4% (o inferiore) dotati di un sistema di evacuazione dei gas.
- Passa il mouse dalla camera anestetizzante per la camera di imaging del Multimode In Imager ottica vivo quando il mouse è anestetizzato.
- Posizionare un musetto sopra il naso del mouse e aprire il flusso di somministrare anestesia continuaSia durante l'acquisizione dell'immagine (tassi di flusso di ossigeno: 0,5-1 L / min, la concentrazione di isoflurano: 2-3% (o inferiore).
- Acquisire immagini di fluorescenza utilizzando un tempo di esposizione di 5-15 sec.
- Eseguire l'analisi delle immagini e di elaborazione tra cui la correzione del fondo o di regolazione del contrasto.
3. Fluorescence Imaging ex vivo
Herdox fluorescenza può essere ripreso in tumori e organi specifici (tra cui il fegato, reni, milza, cuore e muscolo scheletrico) raccolte da topi sacrificati a 24 ore dopo il (Giorno 7) ultima iniezione di Herdox.
- Accendere il Multimode In Imager ottico in vivo.
- Selezionare un filtro passa-banda di emissione (580 nm ± 20 nm) per il rilevamento di fluorescenza doxorubicina.
- Accendere Argon-Krypton laser e inserire un filtro passa-banda di eccitazione (488 nm ± 10 nm) nel percorso ottico laser.
- Luogo tumori e organi specifici disposti su un piatto di Petri nella camera di imaging of il Multimode In Imager ottico in vivo.
- Acquisire immagini di fluorescenza dei tessuti utilizzando un tempo di esposizione di 5-15 sec. Un esempio di acquisizione iniziale immagine di fluorescenza è mostrato in Figura 2a. Ripetere la stessa utilizzando un vuoto Petri-piatto, che fungerà da sfondo (Figura 2b).
- Eseguire l'analisi delle immagini e di elaborazione tra cui la correzione del fondo o di regolazione del contrasto. Un esempio di una immagine corretta viene mostrata in Figura 2c, risultante dalla sottrazione della Figura 2b dalla Figura 2a.
4. In situ Imaging confocale dei Tumori
In situ confocale permette rilevazione e l'analisi di accumulazione tumore Herdox a livello cellulare.
- Accendere una Leica SPE microscopio confocale.
- Selezionare 488 nm luce laser per l'eccitazione della doxorubicina e di emissione lunghezze d'onda (560-620 nm) per la doxorubicinarivelazione della fluorescenza.
- Selezionare un obiettivo 40X o 63X e olio di immersione goccia sulla lente dell'obiettivo.
- Estrarre i tumori freschi da topi eutanasia che in precedenza ricevuto trattamenti Herdox e finto come descritto nella procedura 2.
- Luogo tumori su una piastra di Petri in ghiaccio per evitare il degrado del tessuto, e poi trasferire i tumori in una camera T Delta per l'imaging confocale.
- Acquisire le immagini confocale dei tumori a profondità focali sequenziali (dimensione del passo: 1 micron, spessore: 20 micron). Un esempio di immagini in sequenza-acquisite lungo l'asse z è mostrato in Figura 3, pannello sinistro.
- Eseguire intensità massima z-proiezione delle immagini. Una proiezione massima intensità di z-stack immagini è mostrato in Figura 3, pannello di destra.
- Calcola significare intensità di fluorescenza della massima intensità Z -. Immagini di proiezione media intensità di fluorescenza delle immagini sopra il campo di vista generale sono stati calcolared usando ImageJ.
5. Ratiometrica Spectral Imaging e analisi
Spectral Imaging ratiometrica e analisi consente la discriminazione tra Dox fluorescenza e autofluorescenza.
- Accendere una scansione laser a fluorescenza microscopio confocale.
- Acquisire 15 immagini dei tumori Herdox-trattati e non a una profondità specificata nel range spettrale di 510-650 nm, con un passo di 10 nm, e eccitazione a 488 nm luce utilizzando un microscopio confocale Leica SPE.
- Preparare una soluzione 100 mM di doxorubicina.
- Eseguire l'imaging spettrale della soluzione di doxorubicina 100 micron per ottenere la firma spettrale pura di Dox fluorescenza (campo spettrale: 510-650 nm, una dimensione del passo: 10 nm). Risultati tipici di acquisizione immagine da immagini spettrali e conseguente spettro di fluorescenza tracciati come un grafico sono mostrati in Figura 4.
- Acquisire la firma spettrale autofluorescenza da un'immagine cUbe (campo spettrale: 510-650 nm, una dimensione del passo: 10 nm) ottenuta da imaging spettrale di tumori non trattati. Risultati tipici di acquisizione immagine da immagini spettrali e conseguente spettro di fluorescenza tracciati come un grafico sono mostrati in Figura 5.
- Genera quattro firme spettrali di riferimento (autofluorescenza puro, 0.1.doxorubin +0,9. Autofluorescenza, 0.2. Doxorubicina +0,8. Autofluorescenza, 0.3.doxorubin +0,7. Autofluorescenza) utilizzando il programma che abbiamo sviluppato 9. Una tipica curva che mostra quattro firme spettrali di riferimento è mostrato in Figura 6.
- Eseguire la classificazione spettrale delle immagini come definito dalle firme spettrali di riferimento attraverso la misura di distanza euclidea che utilizzano il programma che precedentemente sviluppato 9.
- Eseguire unmixing spettrale lineare di quelle immagini utilizzando un programma spettrale unmixing (plug-in in ImageJ) abbiamo sviluppato 7, 10, per il confronto con la rappresentazione spettrale raziometrico e analisi. Un indirizzo example di separare fluorescenza Herdox da autofluorescenza da unmixing spettrale lineare è mostrato in Figura 7.
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Risultati
La figura 1 mostra il vivo ottico prototipo imager, che è stato costruito a scopo di acquisizione di immagini in modalità multiple, tra intensità di fluorescenza, spettrale, durata, 2-fotone, confocale intra-vitale, e di imaging bioluminescenza in. Inoltre, la telecamera sensibile elevata raffreddata e linee laser ad alta potenza incorporato in questo sistema rese superiori contrasto immagini di fluorescenza rispetto ai sistemi di imaging ottico commerciali 11, in particolar...
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Discussione
Dox fluorescenza può essere rilevabile in vivo utilizzando la termocamera multimode quando i tumori sono sottocutaneo. Tuttavia, la dose terapeuticamente efficace di Herdox (0,004 mg / kg) è al di sotto della soglia di rilevamento dopo una singola dose. Al contrario, dopo 7 iniezioni giornaliere (1x/day per 7 giorni), l'accumulo tumore e ritenzione della particella è sufficiente per consentire la visualizzazione di Dox fluorescenza.
È critico quando si lavora con Dox o qualsiasi...
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Dichiarazioni
L'autore, Daniel Farkas, è Presidente di Spectral Imaging Molecolare. Gli autori restanti avere interessi in gioco.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni a LKM-K dal National Institutes of Health / National Cancer Institute (R01CA129822 e R01CA140995). Dr. Medina-Kauwe ringrazia C. Rey, M. M-Kauwe e D. Revetto per il supporto continuo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio confocale a scansione laser a fluorescenza | Leica | SPE | |
| em>In Vivo Optical Imager | Spectral Molecular Imaging Multimode | In Vivo Optical Imager | |
| Doxorubicin-HCl Sigma-Aldrich | D4035 | ||
| Topo nudo (NU/NU), femmina, 6-8 settimane | Charles River | Codice ceppo 088 | |
| MDA-MB-435 cellule tumorali umane HER2+ | NCI-Frederick Cancer DCTD Tumor/Cell Line Repository | 0507292 | |
| Siringa da insulina da 3/10 cc U-100 con ago da 29G x 1/2" Ultra-FineIV fissato in modo permanente | BD | 309301 | |
| Delta T chamber | Bioptechs | 04200417B |
Riferimenti
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- Agadjanian, H., Weaver, J. J., et al. Specific delivery of corroles to cells via noncovalent conjugates with viral proteins. Pharm. Res. 23 (2), 367-377 (2006).
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