Articolo metodologico

5/6th nefrectomia in combinazione con dieta di sale e di ossido nitrico sintasi Inibizione di indurre la malattia renale cronica nel ratto Lewis

DOI:

10.3791/50398

⸱

3 luglio 2013

 ,  ,  , 
1Department of Nephrology & Hypertension, University Medical Center Utrecht

In questo articolo

Sommario

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Un metodo a due stadi per stabilire malattia renale cronica (CKD) nel ratto Lewis rimuovere chirurgicamente 5/6th di massa renale è descritta. Combinazione della procedura chirurgica, NOS-inibizione e di una dieta ad alto contenuto di sale porta a un modello simile CKD umano, permettendo lo studio di meccanismi e di sviluppo di nuovi interventi terapeutici causali.

Abstract

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Malattia renale cronica (CKD) è un problema globale. Rallentare la progressione della malattia renale cronica è una delle principali priorità di salute. Dal CKD è caratterizzata da alterazioni complesse di omeostasi, modelli animali integrativi sono necessari per studiare lo sviluppo e la progressione della malattia renale cronica. Per studiare lo sviluppo di interventi terapeutici CKD e romanzo in CKD, si usa il modello ablazione nefrectomia 5/6th, un modello sperimentale ben noto di malattia renale progressiva, simile a molti aspetti della CKD umana. La riduzione lorda in massa renale provoca progressiva glomerulare e lesioni tubulo-interstiziale, perdita di nefroni residue e lo sviluppo di ipertensione sistemica e glomerulare. Esso è anche associato con progressiva perdita intrarenale capillare, infiammazione e glomerulosclerosi. Fattori di rischio per CKD invariabilmente impatto sulla funzione endoteliale. Per simulare questo, uniamo la rimozione di 5/6th di massa renale con l'ossido nitrico (NO), l'esaurimento e una dieta ricca di sale. Dopo l'arrivo e acclimatazione, animali riCeive un inibitore della NO sintasi (NG-nitro-L-arginina) (L-NNA) addizionato all'acqua potabile (20 mg / L) per un periodo di 4 settimane, seguite da destra uninephrectomy lati. Una settimana più tardi, una nefrectomia totale parziale (SNX) viene eseguita sul lato sinistro. Dopo SNX, sono ammessi animali di recuperare per due giorni seguiti da LNNA in acqua potabile (20 mg / L) per un ulteriore periodo di 4 settimane. Una dieta ricca di sale (6%), integrati in terra chow (vedi linea del tempo figura 1), è proseguito per tutto l'esperimento. Progressione dell'insufficienza renale è seguita nel tempo misurando plasma urea, la pressione sanguigna sistolica e proteinuria. Con sei settimane dopo SNX, insufficienza renale si è sviluppata. La funzione renale è misurata con inulina 'gold standard' e l'acido ippurico para-amino (PAH), la tecnologia di liquidazione. Questo modello di CKD è caratterizzata da una riduzione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) e del flusso plasmatico renale (ERPF), ipertensione (pressione sistolica> 150 mmHg), proteinuria (> 50 mg/24 ore) E uremia lieve (> 10 mm). Caratteristiche istologiche comprendono danno tubulo-interstiziale riflessa da infiammazione, atrofia tubulare e fibrosi e glomerulosclerosi focale che porta alla massiccia riduzione dei glomeruli sani nella popolazione residuo (<10%). Il follow-up fino a 12 settimane dopo SNX mostra ulteriore progressione della malattia renale cronica.

Introduzione

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A causa della sua natura progressiva, conseguente fine malattia renale stadio, e associati morbilità e mortalità cardiovascolare, insufficienza renale cronica è un crescente problema di salute pubblica 1. Rallentare la progressione della malattia renale cronica è quindi una priorità di sanità. Dal CKD è caratterizzata da alterazioni complesse di omeostasi, modelli animali integrativi sono necessari per studiare lo sviluppo e la progressione della malattia renale cronica. Il rene costituito da una vasta gamma di tipi cellulari che interagiscono tra di loro. Questa complessità non può essere imitato in vitro.

Per studiare nuovi interventi terapeutici in CKD, si usa il modello 5/6th nefrectomia ablazione, un modello sperimentale noto di malattia renale progressiva, simile ad alcuni aspetti della CKD umana 2,3. La riduzione lorda in massa renale provoca progressiva glomerulare e lesioni tubulo-interstiziale, perdita di nefroni residue e lo sviluppo di ipertensione sistemica e glomerulare. Si è associato con progressive perdita capillare intrarenale 4, l'infiammazione e la glomerulosclerosi. Fattori di rischio per CKD invariabilmente impatto sulla funzione endoteliale 5. Abbiamo utilizzato un ceppo di ratto (Lewis) che è relativamente resistente a sviluppo di CKD e quindi abbiamo combinato rimozione di 5/6th di massa renale con l'ossido nitrico (NO) esaurimento 6, 7, 8 e una dieta ricca di sale 9. Dopo l'arrivo e acclimatazione, gli animali ricevono un inibitore della NO sintetasi (L-NNA) integrato per l'acqua potabile (20 mg / L) per un periodo di 4 settimane, seguito da uninephrectomy lati destro (UNX) con la continuazione di L-NNA dopo due giorni . Una settimana più tardi, totale parziale nefrectomia (SNX) ossia la rimozione di 2/3rds di massa renale è eseguita sul lato sinistro. Dopo SNX, animali viene permesso di recuperare per 2 giorni, seguiti nuovamente da 20 mg / L LNNA in acqua potabile per un periodo di 4 settimane. Una dieta ricca di sale (6%), integrati in terra chow (vedi linea del tempo figura 1), è proseguito per tutto l'esperimento. Tha motivo di eseguire la UNX sul lato destro e il SNX sul lato sinistro è che i vasi renali sono più lunghi sul lato sinistro, che rende più facile l'accesso al rene senza allungare i vasi troppo quando il rene è esposto all'esterno del corpo . In letteratura sono descritti i modelli in cui i poli del rene sinistro vengono rimossi prima, seguita dalla UNX del rene destro una settimana dopo 10,11,12. Nelle nostre mani questo modello ha mostrato uno sviluppo molto più rapido di insufficienza renale, ma anche una variazione molto più grande nella perdita della funzione renale. Progressione dell'insufficienza renale è seguita nel tempo misurando plasma urea, la pressione sanguigna sistolica e proteinuria. Con sei settimane dopo SNX, insufficienza renale si è sviluppata, caratterizzata da marcata riduzione della velocità di filtrazione glomerulare (69%) e del flusso plasmatico renale (62%) 13 l'ipertensione (pressione sistolica> 150 mmHg), proteinuria (> 50 mg/24 hr) e mite uremia (> 10 mm). Caratteristiche istologiche comprendono Tubuldanni o-interstiziale riflessa da infiammazione, atrofia tubulare e fibrosi e glomerulosclerosi focale che porta alla massiccia riduzione dei glomeruli sani nella popolazione residuo (<10%). Il follow-up fino a 12 settimane dopo SNX mostra ulteriore progressione della malattia renale cronica, fornendo una finestra di opportunità per la valutazione degli interventi terapeutici.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono eseguiti in conformità agli animali sperimentali linee guida etiche del comitato animale sperimentale Utrecht. Il protocollo è eseguita sotto la guida e l'approvazione di cura degli animali dell'istituzione dell'autore e comitato utilizzo.

CKD è indotta in ratti maschi inbred Lewis (Charles River, Sulzfeld, Germania) all'età di 8 settimane. I ratti sono alloggiati in condizioni standard in un ambiente di luce, temperatura e umidità controllata.

1. Chirurgia Preparazione

  1. Sterilizzare strumenti chirurgici:
    • 1 tessuto studente pinza 1-2 denti di 12 centimetri
    • 1 studente pinza stile internazionale
    • 2 Semken forcipe
    • 1 Mayo forbici
    • 1 studente iris forbici
    • 1 Olsen-Hegar porta-aghi con le forbici
    • Coperta
  2. Lista di controllo di inventario:
    • Tavolo operatorio con pad riscaldamento e lampada
    • O 2, isoflurano
    • Tessuti
    • Shaver
    • Bilance
    • Set operatoria sterile
    • 5x5 garza sterile e 10x10
    • 70% di alcol
    • Soluzione di NaCl allo 0,9%
    • 1 ml siringa
    • Aghi (25G)
    • Gel cuscinetti in schiuma: Spongostan
    • Vicryl 4.0 e 5.0
    • Buprenorfina 0,03 mg / kg (diluito 1:10 in sale fisiologico)
    • Gabbia pulita per i ratti dopo l'intervento chirurgico

2. Diritto Uninephrectomy Side

  1. Disinfettare il tavolo con il 70% di alcol.
  2. Luogo topo nella scatola induzione e indurre l'anestesia con il 4% isoflurano e 1 litro flusso di O 2. Nota: a seconda del ceppo di ratto usato, pre e perioperatoria analgesia sono prescritti, questo deve essere discusso con il veterinario locale.
  3. Trasferimento ratto a tavola e luogo naso a cono. Ratto e cono sono posti su una piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea del ratto. Il ratto is ventilato con una miscela di 2% isoflurano e 1 litro O 2.
  4. Shave fianco del ratto e disinfettare con alcool. Lavare e disinfettare le mani e indossare guanti chirurgici sterili. Indossare una protezione della testa e una maschera. Fai per 1 - 1,5 centimetri incisione parallela alle costole con pinze anatomiche e forbici smussate. Esporre il rene per via smussa dei muscoli della schiena.
  5. Il polo inferiore del rene è visibile, utilizzare con attenzione le piccole pinze smussate per afferrare il tessuto adiposo perirenale. Esternare il rene tirando delicatamente il grasso perirenale con una pinza. Fare attenzione a non disturbare la ghiandola surrenale durante questa procedura. La ghiandola surrenale può essere facilmente eliminati mettendo una pinza nella sede mediale nel tessuto grasso e delicatamente spostata verso l'alto fra la ghiandola surrenale e il rene come illustrato nella Figura 2.
  6. Posizionare rene delicatamente sulla garza e chiara circostante grasso e tessuto connettivo. Identificare l'arteria e la vena renale e inserire una legatura (5,0Vicryl) con un singolo nodo intorno i vasi, ma non legare il nodo.
  7. Spostare il nodo sciolto accuratamente lungo i vasi verso l'aorta di circa 0,5 centimetri, per creare spazio tra il rene e il nodo. Questo viene fatto per evitare la legatura di scivolare dopo il taglio.
  8. Legare nodo con due nodi doppi. Se perfusione viene interrotta, il colore del rene passerà immediatamente marrone. Non tagliare le estremità della legatura.
  9. Tagliare i vasi renali vicino al rene e rimuovere il rene. Tirare delicatamente le lunghe estremità della legatura per controllare il sanguinamento dei vasi renali. La legatura deve rimanere sul posto a bordo della nave. Tagliare le lunghe estremità della legatura. Nota, i vasi renali remnant si ritrae immediatamente nella cavità addominale.
  10. Asciugare rene asportato asciughi e si pesa.
  11. Chiudere l'incisione del muscolo scheletrico con l'esecuzione di suture con Vicryl 5.0. Iniettare 0,10 ml (0,03 mg / kg) buprenorfina im in dell'arto posteriore. Chiudere ilpelle con Vicryl 4.0 con suture intracutanee. Ciò impedisce che i ratti di aprire la ferita. Nota: a causa di depressione respiratoria in ratti Lewis, diamo solo l'analgesia post-operatoria poco prima di spegnere l'isoflurano.
  12. La casa del topo in una gabbia pulita solitario, con facile accesso al cibo e all'acqua. Posizionare la metà della gabbia sul riscaldamento pad O / N e controllare il topo con cura il giorno successivo. Quando la ferita è chiusa e il ratto è attiva, che è normalmente compresa tra 6 e 12 ore dopo l'intervento chirurgico, il ratto può essere riposto nel contenitore gruppo.

3. Lato sinistro nefrectomia Subtotale

  1. Sette giorni dopo, gli stessi preparati sono fatte sul lato sinistro come per il lato destro come descritto 2,1-2,5. Prima dell'intervento chirurgico, la quantità di tessuto renale che deve essere rimosso corrispondente a circa 2/3rds del peso del rene destro è calcolato. Preparare piccoli pezzi di schiuma gel (Spongostan, Johnson & Johnson, New Jersey) prima di un intervento chirurgico.
  2. Collocare forbici taglienti attorno al polo superiore del rene sinistro e resecare il polo superiore in un colpo (per l'ubicazione forbice, vedi Figura 3). Coprire immediatamente con un pezzo di schiuma gel ed esercitare una leggera pressione con una garza sterile.
  3. Ripetere con il polo inferiore del rene come in 3.3.
  4. Sollevare rene per prevenire la coagulazione sulla pelle. Mantenere una pressione delicata su entrambe le imbottiture in gel con garza sterile fino a quando l'emorragia si ferma. Quando il sanguinamento persiste, aggiungere un altro rilievo di gomma piuma.
  5. Posizionare residuo rene con aderenti imbottiture in gel all'interno dell'addome. Chiudere il muscolo e pelle e seguire 2,9-2,12.

4. Sham Chirurgia

  1. Sham controlli azionati subiscono la stessa procedura, al fine di esporre i reni. Invece di estirpare il rene o il taglio dei pali una settimana più tardi, entrambi i reni sono decapsulated ad un intervallo di una settimana, facendo attenzione a non disturbare le ghiandole surrenali. Chiusura della ferita e di assistenza post-operatoria sono identical a 2.11 e 2.12.

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Risultati

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Dopo nefrectomia subtotale, circa 1/6th della massa renale totale è a sinistra. Figura 4 mostra il peso della parte rimossa del rene destro con deviazione media e standard in due esperimenti precedenti. Si dovrebbe tenere presente che nella settimana dopo UNX, ipertrofia del rene sinistro si verifica, indicante che il peso che deve essere rimosso calcolato sulla base del peso del rene destro provoca sempre in meno di rimozione 5/6th. Tuttavia, poiché non è possibile determinare il peso del rene sinistro...

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Discussione

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La rimozione chirurgica di 5/6th di massa renale nel ratto Lewis, in combinazione con una dieta ad alto contenuto di sale e NOS temporanea inibizione porta ad un modello di CKD che assomiglia CKD umana e permette lo studio dei meccanismi causali e l'efficacia degli interventi terapeutici in CKD.

Il modello di nefrectomia 5/6th è un modello ben noto e ampiamente descritto per la CKD. Tuttavia, la semplice rimozione 5/6th di massa renale non porta a insufficienza renale immediato in tutti ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Krista den Ouden per l'eccellente assistenza tecnica. Questa tecnica è stata sostenuta finanziariamente dalla Fondazione olandese del rene, concessione C06.2174. MCV è sostenuta dalla organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) Vidi-sovvenzione 016.096.359.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
   Reagente
L-NNASigma-aldrichN5501 
Spongostan dental: cuscinetti in schiuma gel 1x1x1 cmJohnson& JohnsonMs0005 
Ethicon Vicryl FS-2S naald 4/0 V392H p/36EthiconV303H 
Ethicon Vicryl RB-1+ naald 5/0 V303H p/36EthiconV392H 
Buprenorfina (0,3 mg/ml)Tramite farmacista locale ordinato da Reckitt Benckiser pharmaceuticalsunknown 
   Equipaggiamento
Pinze per tessuti per studenti - 1x2 denti 12 cmStrumenti per le scienze fini (FST)91121-12 
Pinze standard per studentiFST91100-12 
Forbici MayoFST14010-15 
2X Pinze SemkenFST11008-13 
Forbici per iride per studentiFST91460-11 
Porta aghi Olsen-HegarFST12002-14 

Riferimenti

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