In questo articolo il video illustra il set-up, le procedure per applicare le patch corpi cellulari e come implementare le registrazioni dinamiche clamp da cellule gangliari in tutto il montaggio del mouse retine. Questa tecnica permette l'indagine del contributo preciso di input sinaptici eccitatori e inibitori, e la loro portata, il tempo di spiking neuronale.
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Articolo metodologico
Implementazione morsetto dinamico con conduttanze sinaptiche e artificiale nel topo cellule gangliari della retina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule gangliari sono i neuroni della retina uscita e la loro attività riflette l'integrazione di più ingressi sinaptici derivanti da specifici circuiti neurali. Tecniche di patch clamp, in morsetto di tensione e di configurazioni di corrente con la pinza, sono comunemente usati per studiare le proprietà fisiologiche dei neuroni e di caratterizzare i loro ingressi sinaptici. Anche se l'applicazione di queste tecniche è altamente informativo, essi rappresentano varie limitazioni. Ad esempio, è difficile quantificare le interazioni precise di ingressi eccitatori e inibitori determinano output di risposta. Per risolvere questo problema, abbiamo utilizzato una tecnica modificata corrente morsetto, morsetto dinamica, detto anche conduttanza morsetto 1, 2, 3 e ha esaminato l'impatto di input sinaptici eccitatori e inibitori di eccitabilità neuronale. Questa tecnica richiede l'iniezione di corrente nella cella e dipende dal feedback in tempo reale del suo potenziale di membrana in quel momento. Il injectéd attuale è calcolato a partire predeterminati conduttanze sinaptiche eccitatorie ed inibitorie, le loro potenzialità di inversione e istantanea potenziale di membrana della cellula. Dettagli sulle procedure sperimentali, la patch di serraggio cellule per ottenere una cellula intera configurazione e impiego della tecnica di serraggio dinamica sono illustrati in questo articolo il video. Qui vi mostriamo le risposte di topo cellule gangliari della retina a varie forme d'onda conduttanza ottenuti da esperimenti fisiologici in condizioni di controllo o in presenza di farmaci. Inoltre, mostriamo l'utilizzo di conduttanze eccitatori e inibitori artificiali generati utilizzando le funzioni alfa per indagare le risposte delle cellule.
Introduzione
La retina è un tessuto neurale quasi trasparente che riveste la parte posteriore dell'occhio. Molti studi utilizzano la retina come modello per studiare i primi passi nel processo visivo e meccanismi di segnalazione sinaptica. Poiché la rete retinica nel preparato tutto il montaggio rimane intatto dopo la dissezione, rappresenta un sistema ideale per studiare le interazioni sinaptiche come sue risposte fisiologiche sono molto simili a condizioni in vivo. Così, utilizzando una retina isolata proprietà dei suoi neuroni possono essere studiati con tecniche di patch clamp (per recensioni su questa tecnica, vedere 6,9,13). Identificazione dell'....
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Protocollo
1. Generale Set Up e Preparazione del tessuto
- Mantenere il mouse al buio per 30 min (mirare a ridurre il suo livello di stress). Durante l'attesa, preparare 1 L di soluzione extracellulare. Prima sciogliere 1,9 g di bicarbonato di sodio in mezzo litro di acqua Milli-Q. Il suo pH è mantenuto a 7,4 facendo gorgogliare 95% O 2 e 5% di CO 2. Cinque minuti dopo, sciogliere 8,8 g di Ames medio in 100 ml di acqua Milli-Q, aggiungere alla soluzione di bicarbonato di sodio, alto fino a 1 L con acqua Milli-Q e mescolare bene. Conservare questa soluzione carboxygenated per il resto dell'esperimento.
- Prendete 250 ml di carboxyge....
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Risultati
Il contributo delle diverse fonti di input inibitorio per le risposte delle cellule gangliari è dimostrata attraverso l'applicazione di varie forme d'onda conduttanza. Queste forme d'onda sono stati ottenuti con stimoli di diversa luminanza in condizioni normali e in presenza di TTX, una tensione-gated Na + bloccante dei canali che un'azione blocchi generazione potenziale solo in un sottoinsieme di inibitori interneuroni retinici. Figura 2A mostra una risposta rappresentativo .......
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Discussione
Qui mostriamo l'uso di clamp dinamico per valutare l'influenza del rapporto e relativa tempistica di eccitazione e di inibizione sulle cellule gangliari retiniche uscita. Morsetto dinamica fa uso di simulazioni al computer per introdurre conduttanze sinaptiche fisiologicamente registrati o artificiale in neuroni viventi. Questa metodologia fornisce uno strumento interattivo con cui conduttanze possono essere modificati e iniettate in neuroni per calcolare la loro influenza sulle risposte neuronali. Conduttanza f.......
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Dichiarazioni
Tutte le procedure sono stati approvati dal Comitato Etico Cura Animale dell'Università di Sydney, e poi eseguite in conformità con le linee guida del Codice australiana di prassi per la cura e l'uso di animali a fini scientifici (National Health and Medical Research Council of Australia ).
Ringraziamenti
Questo lavoro è supportato dal Consiglio di Ricerca Australiano (ARC DP0988227) e il Biomedical Science Research Initiative di Grant dalla disciplina di Scienze Biomediche, Università di Sydney. L'apparecchiatura Patch Clamp Amplificatore EPC 8 è stato finanziato dal Fondo di avvio dal Disciplinare di Scienze Biomediche, Università di Sydney. L'attrezzatura InstruTECH LIA 8 +8 sistema di acquisizione dati è stato acquistato con i fondi da Rebecca L. Cooper Fondazione e Fondo di avvio dal Disciplinare di Scienze Biomediche, Università di Sydney. Vorremmo ringraziare i revisori anonimi per i loro suggerimenti e commenti penetranti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagent | |||
| Isoflurano Inalazione Anestetico | Pharmachem | ||
| Ames Medium con L-Glutammato (Polvere) | Sigma-Aldrich | ||
| Gluconato di Potassio, Anidro | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sale di sodio | Sigma-Aldrich | ||
| Soluzione di cloruro di magnesio ( 4,9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosina 5'-trifosfato (ATP) sale disodico idrato | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosina, 5'-trifosfato sale sodico idrato | Sigma-Aldrich | ||
| Glicole etilenico-bis(2-ammina– tiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldeide in polvere, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, frazione IgG di coniglio (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratori Inc. | ||
| Equipment | |||
| Tubo in vetro capillare con estremità lucidate a fiamma (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Lunghezza = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Vetro per stadio singolo Micr– lectrode Estrattore | Narishinge Giappone | Modello PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μ m Unità Filtro | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Ago ipodermico riutilizzabile: 30 G | Smith Nephew (Australia) | ||
| Riscaldatore a soluzione in linea singola | Warner Instruments | Modello SH-27B | |
| Doppio regolatore di temperatura automatico | Warner Instruments | TC-344B | |
| Stereomicroscopio Olympus SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: con obiettivo 40X | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2,5 A DC Alimentatore | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipolatore MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Sistema di acquisizione dati | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation | ||
Riferimenti
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E.
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Ristampe e permessi
