Articolo metodologico

La stimolazione meccanica indotta calcio Wave Propagation in monostrati cellulari: l'esempio di bovini cellule endoteliali corneali

DOI:

10.3791/50443

⸱

16 luglio 2013

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Medicine, Laboratory of Molecular and Cellular Signaling, KU Leuven

In questo articolo

Sommario

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Intercellulare Ca 2 +-Onde sono guidati da canali gap junction e hemichannels. Qui, descriviamo un metodo per misurare intercellulare Ca 2 +-Onde in monostrati di cellule in risposta ad uno stimolo meccanico unicellulare locale e la sua applicazione per investigare le proprietà e la regolazione dei canali gap junction e hemichannels.

Abstract

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Comunicazione intercellulare è essenziale per il coordinamento dei processi fisiologici tra le cellule in una varietà di organi e tessuti, compreso il cervello, fegato, retina, coclea e vascolare. In impostazioni sperimentali, intercellulare Ca 2 +-onde possono essere provocato applicando uno stimolo meccanico a una singola cella. Ciò conduce al rilascio delle molecole di segnalazione intracellulare IP 3 e Ca 2 + che avviare la propagazione del Ca 2 +-onda concentricamente dal cellulare stimolata meccanicamente alle cellule vicine. I principali meccanismi molecolari che controllano intercellulare Ca 2 +-propagazione dell'onda sono forniti da gap canali di giunzione attraverso il trasferimento diretto di IP 3 e dal hemichannels attraverso il rilascio di ATP. Identificazione e caratterizzazione delle proprietà e la regolazione dei diversi connessina e isoforme pannexin come canali gap junction e hemichannels sono consentiti dalla quantification della diffusione del intercellulare Ca 2 +-onda, siRNA, e l'uso di inibitori di canali gap junction e hemichannels. Qui, descriviamo un metodo per misurare intercellulare Ca 2 +-onda in monostrati di cellule endoteliali corneali primarie caricato con Fluo4-AM in risposta ad uno stimolo meccanico controllata e localizzata provocata da un acuto deformazione, di breve durata della cellula come risultato di toccare la membrana cellulare con una micropipetta di vetro micromanipolatore controllato con un diametro di punta di meno di 1 um. Abbiamo anche descrivono l'isolamento delle specie bovina cellule endoteliali corneali primarie e il suo utilizzo come sistema modello per valutare l'attività Cx43-hemichannel come la forza guidato per intercellulare Ca 2 +-onde attraverso il rilascio di ATP. Infine, si discute l'uso, i vantaggi, i limiti e le alternative di questo metodo nel contesto di apertura di canale di giunzione e di ricerca hemichannel.

Introduzione

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Comunicazione e di segnalazione intercellulare sono essenziali per il coordinamento dei processi fisiologici in risposta ad agonisti extracellulari al tessuto e il livello di 1,2 intera-organo. Il modo più diretto di comunicazione intercellulare è creato dalla presenza di giunzioni. Giunzioni gap sono placche di canali gap junction, che sono i canali proteici formati da docking testa a testa di due connessine (Cx) hemichannels delle celle adiacenti 3,4 (Figura 1). Giunzioni permettono il passaggio di piccole molecole di segnalazione con un peso molecolare di meno di 1,5 kDa, comprese Ca 2 + 3 o 5 IP, causando e modulando Ca 2 +-liberazione dalle riserve intracellulari delle cellule vicine 6 (Figura 2). Canali gap junction sono strettamente regolati dalle interazioni delle proteine ​​intra-ed intermolecolari e da processi di segnalazione cellulare, come la modifica redox efosforilazione 7. GJs facilitano la risposta coordinata delle celle collegate, agendo quindi come un prodotto chimico e sincizio elettrico. Per esempio, la diffusione di potenziale cardiaco di tutti i miociti atriali e ventricolari è mediato da canali GJ Cx basate 85. Cxs non solo hanno un ruolo come canali giunzioni gap, ma anche formano hemichannels spaiati, così funzionando come canali in membrane similmente a canali ionici regolari 8-10 (Figura 1). Hemichannels partecipano segnalazione paracrina tra cellule adiacenti controllando lo scambio di ioni e molecole di segnalazione tra l'ambiente intra ed extracellulare.

In molti tipi di cellule (come le cellule epiteliali, cellule osteoblastiche, astrociti, cellule endoteliali, ecc) e di organi (come il cervello, il fegato, la retina, coclea e il sistema vascolare), intercellulare Ca 2 +-onde sono fondamentali per il coordinamento delle risposte pluricellulari 11. Aumenti di Ca2 + intracellulare livelli in una certa cella non sono limitati a questa cella, ma propagano alle cellule vicine circostanti, stabilendo così un intercellulare Ca 2 +-wave 12,13. Questi intercellulare Ca 2 +-onde sono importanti per il normale regolazione fisiologica di strati di cellule come un sincizio e loro disregolazione è stato associato a processi fisiopatologici 11. Nel endotelio corneale e l'epitelio, diversi gruppi di 14-24, compreso il nostro 25-33, hanno studiato i meccanismi ei ruoli della comunicazione intercellulare. In cellule non eccitabili, come le cellule endoteliali corneali, due distinte modalità di comunicazione intercellulare verificano 28,29, cioè gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrino. Gap giunzionale comunicazione intercellulare comporta uno scambio diretto di molecole di segnalazione tramite gap giunzioni 7. Gap giunzionecomunicazione intercellulare zionale è fondamentale per mantenere l'omeostasi dei tessuti, il controllo della proliferazione cellulare, e stabilendo una risposta sincronizzata allo stress extracellulare 10,34,35. In un certo numero di patologie, gap accoppiamento giunzione è ridotta a causa di CXS difettosi, e con la presente colpisce gap giunzionale comunicazione intercellulare 36. Questo sottolinea l'importanza e l'influenza del gap giunzionale comunicazione intercellulare negli organismi multicellulari. In contrasto gap giunzionale comunicazione intercellulare, comunicazione intercellulare paracrina non dipende apposizione cellula-cellula, in quanto comporta il rilascio di messaggeri extracellulari diffusibili (Figura 2). Diversi tipi di molecole di segnalazione vengono rilasciati nello spazio extracellulare dalle cellule segnalazione. La molecola viene quindi trasportato alla cellula bersaglio dove viene rilevato da una proteina recettore specifico. Successivamente il complesso recettore-segnale induce una risposta cellulare, cheviene terminato dalla rimozione del segnale, inattivazione o desensibilizzazione. Usciti lipofile messaggeri di segnalazione extracellulare penetrano la membrana e agiscono sui recettori intracellulari. In contrasto, messaggeri idrofile non attraversano la membrana plasmatica della cellula rispondere, ma agiscono come un ligando che si lega a proteine ​​recettori di superficie espresse, che poi trasmettere il segnale per l'ambiente intracellulare. Tre grandi famiglie di proteine ​​recettori di superficie delle cellule partecipano a questo processo: canale ionico-linked, enzyme-linked, e G-proteine ​​legate. La molecola messaggero rilasciato può agire sui recettori della stessa cella (autocrina), su cellule bersaglio in prossimità (paracrina) o su cellule bersaglio distanti che richiedono il sistema circolatorio (endocrino).

In molti tipi cellulari, tra endotelio corneale 28,29, ATP è uno dei principali fattori paracrini idrofili, che guidano la propagazione di intercellulare Ca 2 +-onde 37-40. During deformazione meccanica, ipossia, infiammazione o stimolazione da vari agenti, ATP possono essere rilasciati dalle cellule sane 41-44 in risposta alle sollecitazioni di taglio, allungamento, o rigonfiamento osmotico 44,45. Meccanismi ATP-rilascio diverse sono state postulate, tra esocitosi vescicolare 44 e una pletora di meccanismi di trasporto, come ad esempio cassette (ABC) trasportatori ATP-binding, plasmalemmal canali anionici voltaggio-dipendenti, 46 canali del recettore P2X7 47,48, così come connessina hemichannels 49-52 e pannexin hemichannels 43,49,53. ATP extracellulare può essere rapidamente idrolizzato ad ADP, AMP, adenosina 54,55 da ectonucleotidases che sono presenti nell'ambiente extracellulare. L'ATP extracellulare rilasciato e il suo metabolita ADP 56 si diffonderanno in diffusione. La successiva interazione di questi nucleotidi con recettori purinergici nelle cellule vicine è stata implicata nella propagation di intercellulare Ca 2 +-onde 28,37,51. Due differenti classi di recettori purinergici sono presenti: adenosina è il ligando naturale principale per P1-recettori purinici, mentre sia purina (ATP, ADP) e pirimidine (UTP, UDP) nucleotidi agiscono su più recettori purinici P2-57.

Comunicazione intercellulare può essere indagato con metodi diversi, come carico raschiare, il trasferimento di colore, uncaging locale di agonisti come IP 3 e Ca 2 +, la stimolazione meccanica, ecc. Qui si descrive lo studio di Ca 2 +-propagazione dell'onda suscitata da stimolazione meccanica di una singola cellula. Il vantaggio di studiare Ca 2 +-propagazione delle onde di stimolazione meccanica è che fornisce un facile strumento per quantificare la diffusione del Ca 2 +-onda nel tempo e permette confrontando quantitativamente diversi pretrattamenti delle cellule. Nell'endotelio corneale, questi intercellulare Ca 2 +-onde consentire un corisposta coordinata dal monostrato, con la presente in qualità di un possibile meccanismo di difesa del non-rigenerativa dell'endotelio corneale aiutando l'endotelio a resistere alle sollecitazioni extracellulari durante l'intervento chirurgico intraoculare, o in caso di esposizione di mediatori infiammatori durante rigetto immunitario o uveite 58,59.

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Protocollo

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1. Isolamento di cellule endoteliali corneali

Prima di iniziare: Isolare le cellule dagli occhi freschi, ottenuti da un macello locale, il più presto possibile dopo enucleare l'occhio. Assicurarsi che l'occhio è stato enucleato da una mucca di massimi 18 mesi di età, a cinque minuti post mortem e conservate in soluzione salina bilanciata di Earle - soluzione di iodio 1% a 4 ° C per il trasporto al laboratorio.

  1. Prendete l'occhio di soluzione salina bilanciata del Earle - soluzione di iodio 1% e metterlo in una capsula di Petri (100 x 20 mm).
  2. Sterilizzare l'occhio con una soluzione contenente 70% di etanolo e sciacquare con soluzione salina bilanciata di Earle contenente 1% di iodio.
  3. Da questo punto in poi, lavorare in una cappa sterile. Sezionare con cura la cornea dall'occhio e metterla in una piastra di Petri (35 x 10 mm) contenente soluzione salina bilanciata di Earle, con lo strato di cellule epiteliali verso l'alto. Rimuovere con cautela qualsiasi residuo sti tessuto dell'iridell attaccato alla cornea, se necessario.
  4. Trasferire la cornea di soluzione salina bilanciata di Earle contenente un'altra piastra di Petri con lo strato di cellule endoteliali verso l'alto e lavare due volte con soluzione salina bilanciata di Earle.
  5. Trasferire la cornea con lo strato endoteliale rivolta verso l'alto ad una clessidra, che è un piatto a forma di coppa, e coprire con terreno di crescita. Il mezzo di crescita consiste Medio Dulbecco Modified Eagle contenente 25 glucosio mM, 10% di siero fetale bovino, 6,6% di L-glutammina, 2,5 ug / ml di amfotericina-B e 1% miscela antibiotico-antimicotico contenente 10.000 unità / ml di penicillina, 10.000 mcg / ml di streptomicina, e 25 ug / ml di amfotericina B.
  6. Rimuovere il terreno con una pipetta di aspirazione.
  7. Applicare 300 microlitri di una soluzione di tripsina (0,5 g / L) per lo strato endoteliale della cornea (tutti i passaggi che includono tripsina sono fatte utilizzando la stessa concentrazione).
  8. Posizionare la clessidra contenente la cornea in una capsula di Petri coperta e metterlo nel incubator per 30 min a 37 ° C e 5% di CO 2.
  9. Raschiare delicatamente le cellule endoteliali lontano dalla cornea con un incendio lucidato a gancio pipetta Pasteur di vetro in una cappa sterile.
  10. Succhiare la soluzione contenente le cellule endoteliali ed aggiungerlo alla fiasche di coltura (25 cm 2) contenenti 4 ml di terreno di coltura.
  11. Applicare 300 ml di terreno di crescita alla cornea e ripetere la raschiatura e aggiungere la soluzione contenente le cellule endoteliali al pallone cultura.
  12. Ripetere questo passaggio finale (1.11) ancora una volta.
  13. Posizionare la cultura flaconi contenenti le cellule endoteliali corneali nel mezzo di coltura in incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2.
  14. Dopo due giorni, aggiungere 6 ml di terreno di coltura.
  15. Aggiornare il terreno di crescita ogni due giorni.

2. Colture Cellulari

  1. Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule due volte con soluzione salina bilanciata di Earle, quando viene raggiunta la confluenza (entro about 10 giorni dopo l'isolamento).
  2. Aggiungere 1,5 ml di soluzione di tripsina per le cellule per staccarli e mettere il pallone in incubatrice (37 ° C, 5% CO 2) per 3-4 min.
  3. Aggiungere 12 ml di mezzo di crescita. Pipettare le medie tre volte dentro e fuori per disperdere le cellule e contare le cellule.
  4. Seed le cellule con una frazione variabile a seconda della densità cellulare e metterle in incubatrice. Preparare due vetrini ben a camera (con una superficie di 4,2 cm 2) con una conta cellulare di 165.000 cellule (densità cellulare 39.286 per cm 2). Preparare 80 centimetri due fiasche di coltura per un nuovo passaggio ad una densità di 6.250 per cm 2, e aggiungere mezzo di coltura fresco fino ad un volume totale di 25 ml.
  5. Aggiornare la media ogni due giorni.
  6. Confluenza dello strato di cellule viene raggiunto dopo 3 o 4 giorni. Utilizzare le cellule per gli esperimenti.
  7. Quando confluenza dello strato di cellule nelle beute viene raggiunto, ripetere i passaggi da 2.1 a 2.6. Colture cellulari fino al passaggio 2 può essere utilizzato fo esperimenti.

3. La stimolazione meccanica per indurre Saluto di calcio

  1. Caricare le cellule nella diapositiva camerata con 10 mM Fluo-4:00 in PBS per 30 min a 37 ° C, mentre scuotendo delicatamente.
  2. Rimuovere il Fluo-04:00 soluzione, lavare le cellule cinque volte con tampone fosfato salino, incubare le cellule con PBS e lasciare le celle per almeno 5 minuti a temperatura ambiente prima della misurazione.
  3. Eccitano a 488 nm con Argon laser e uso divisore di fascio 488 HFT, raccogliere l'emissione di fluorescenza a 530 nm usando un filtro di emissione longpass LP 505, fissato il foro stenopeico al minimo. Utilizzare un olio di immersione obiettivo 40X (Aria, 1.2 NA). In esperimenti con ARL-67156, utilizzare un obiettivo 10X (Aria, 0.3 NA).
  4. Ricerca di un campo in cui le cellule sono confluenti sul microscopio confocale.
  5. Posizionare la pipetta in modo che sia a 45 ° rispetto alla slitta incamerata e toccando la membrana cellulare.Provocare un corto (≈ 1 sec) stimolazione meccanica ad una singola cella. La stimolazione meccanica consiste di una deformazione acuta, di breve durata della cella toccando brevemente meno dell'1% della membrana cellulare con una micropipetta di vetro (diametro in punta <1 um) accoppiato ad un cristallo piezoelettrico nanopositioner, operato tramite un amplificatore che è montato su un micro-manipolatore. Le micropipette di vetro sono realizzati con un estrattore microelettrodo. Assicurarsi che il nanopositioner è gestito da una tensione compresa tra 0,2 e 1,5 V durante la stimolazione meccanica. Una tensione superiore a 1,5 V può provocare danni alle cellule. Per ciascun tipo di cellula e condizione la tensione ottimale per la stimolazione meccanica senza danno cellulare deve essere accuratamente determinato applicando una serie di tensioni partire dal basso (0,2 V) ad alto (1,5 V) tensione. La tensione è una misura per la forza della stimolazione poiché questa tensione determina la sollecitazione meccanica e la tensione che vengono applicati alla membrana cellulare. Glivigore della stimolazione meccanica può essere calcolata moltiplicando la sollecitazione meccanica con la zona. Poiché sia l'area (<3,14 micron 2) e le sollecitazioni meccaniche sono molto bassi, la forza della stimolazione meccanica è basso. (Si noti che quando una cellula è danneggiata, le perdite di fluorescenza fuori della cellula e la cellula diventa scuro.)
  6. Misurare le variazioni spaziali in [Ca 2 +] i in seguito a stimolazione meccanica con il microscopio confocale.
  7. Raccogliere e conservare le immagini.
  8. Disegnare una regione poligonale di interesse per definire la superficie totale di cellule responsive (area attiva, AA) usando il software del microscopio confocale.

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Risultati

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Tutti gli esperimenti sono eseguiti in conformità a tutte le direttive, i regolamenti e le agenzie di regolamentazione e il protocollo viene dimostrato viene eseguita sotto la guida e l'approvazione della cura degli animali e del Comitato utilizzo del KU Leuven.

Nelle cellule endoteliali corneali bovina (BCEC), giunzioni gap funzionali sono espresse e sia gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrine contribuiscono in modo significativo alla com...

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Discussione

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In questo manoscritto, si descrive un metodo semplice per misurare intercellulare Ca 2 +-propagazione delle onde in monostrati di cellule endoteliali corneali bovina primarie, fornendo una stimolazione meccanica localizzato e controllato utilizzando una micropipetta. Cellule stimolate meccanicamente rispondono con un aumento locale della IP intracellulare 3 e Ca 2 +, che sono entrambi essenziali molecole di segnalazione intracellulare che guidano intercellulare Ca 2 +-propagazione

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il lavoro di ricerca svolto in laboratorio è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione per la Ricerca - Fiandre (FWO; numeri di sovvenzione G.0545.08 e G.0298.11), il Interuniversitario attrazione polacchi Programma (Politica Scienza belga, numero di concessione P6/28 e P7/13) ed è incorporato in una comunità di ricerca FWO supportato. CDH è un borsista post-dottorato della Fondazione di Ricerca - Fiandre (FWO). Gli autori sono molto grati a tutti i membri attuali e precedenti del Laboratorio di Molecular and Cellular Signaling (KU Leuven), Dr. SP Srinivas (Indiana University School of Optometry, USA), il laboratorio del Dr. Leybaert (Ghent University) e di Dr. Vinken (VUB) che ha fornito utili discussioni, ottimizzato procedure o sono stati coinvolti nello sviluppo di strumenti per lo studio della hemichannels connessina.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)14155-048
IodineSigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)38060-1EA
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)11960-044
L-glutammina (Glutamax)Sonde Invitrogen-Gibco-Molecolari (Karlsruhe, Germania)35050-038
Amfotericina-BSigma-Aldrich (Deisenhofen, Germania)A2942
Miscela antibiotica-antimicoticaSonde Invitrogen-Gibco-Molecular (Karlsruhe, Germania)15240-096
TripsinaSonde Invitrogen-Gibco-Molecular (Karlsruhe, Germania)25300-054
Dulbecco's PBSInvitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germania)14190-091
Fluo-4 AMInvitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germania)F14217
ARL-67156 (6-N,N-dietil-b,g-dibromometilene-D-ATP) Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germania)A265
Apirasi VISigma-Aldrich (Deisenhofen, Germania)A6410
Apirasi VIISigma-Aldrich (Deisenhofen, Germania)A6535
Gap26 (VCYDKSFPISHVR)peptidica personalizzata
Gap27 (SRPTEKTIFII)peptidica personalizzata
Control Peptide (SRGGEKNVFIV)Sintesi
siRNA1 Cx43 (senso: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) Il siRNA ricotto è stato acquistato presso Eurogentec (Luik, Belgio)
siRNA2 Cx43 (senso: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) Il siRNA ricotto è stato acquistato presso Eurogentec (Luik, Belgio)
siRNA scramble: sequenza criptata di siCx43-1 (senso: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) Il siRNA ricotto è stato acquistato presso Eurogentec (Luik, Belgio)
TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)Thermo Electron (Ulm, Germania)
TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) Thermo Electron (Ulm, Germania)
Due vetrini a cameraLaboratory-Tek Nunc (Roskilde, Danimarca)155380
Microscopio confocale Carl Zeiss Meditec (Jena, Germania)LSM510
Piez– nanoposizionatore a cristallo elettrico (Piezo Flexure NanoPositioner)PI Polytech (Karlsruhe, Germania)P-280
HVPZT-amplifierPI Polytech (Karlsruhe, Germania)E463 HVPZT-amplifier
Tubi di vetro (sostituzione del vetro 3,5 nanolitri)World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA4878
Micr– estrattore per lectrode Zeitz Instrumente (München, Germania)WZ DMZ-Estrattore
Sintesi Sintesi peptidica personalizzata universale

Riferimenti

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