Isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali

Sommario

Coltura cellulare primaria è una tecnica utile per analizzare specifiche popolazioni di cellule, particolarmente da embrioni di topo transgenico a stadi specifici dello sviluppo. Qui, ventricoli embrionali vengono sezionati e dissociato, e perle di anticorpi coniugati riconoscere e separare le cellule endoteliali per ulteriori analisi.

Abstract

Coltura cellulare ha notevolmente migliorato la nostra capacità di valutare le singole popolazioni di cellule in condizioni di coltura miriade. Mentre le linee cellulari immortalizzate offrono vantaggi significativi per la loro facilità di utilizzo, queste linee cellulari non sono disponibili per tutti i potenziali tipi di cellule. Isolando cellule primarie di una regione di interesse, in particolare da un topo transgenico, studi più sfumate possono essere eseguite. La tecnica di base consiste dissezione dell'organo o organo parziale di interesse (ad esempio il cuore o una regione specifica del cuore) e dissociare l'organo di singole cellule. Queste cellule vengono poi incubate con perline magnetiche coniugate ad un anticorpo che riconosce il tipo cellulare di interesse. Le cellule di interesse possono quindi essere isolati con l'uso di un magnete, con una breve incubazione tripsina dissociare le cellule dalle perline. Queste cellule isolate possono essere coltivate e analizzati come desiderato. Questa tecnica è stata originariamente progettata per adulto organo del mouses ma può essere facilmente ridotta per uso con organi embrionali, come dimostrato qui. Poiché il nostro interesse è nel sistema vascolare coronarico di sviluppo, abbiamo voluto studiare questa popolazione di cellule durante le fasi embrionali specifici. Così, il protocollo originale ha dovuto essere modificata per essere compatibile con le piccole dimensioni dei ventricoli embrionali e la bassa resa potenziale delle cellule endoteliali in queste fasi di sviluppo. Utilizzando questo approccio in scala ridotta, abbiamo valutato coronarica plesso rimodellamento ventricolare in cellule endoteliali embrionali transgeniche.

Introduzione

L'avvento di linee cellulari immortalizzate ha rivoluzionato la biologia cellulare di base ^1. Le linee cellulari attualmente disponibili sono derivati ​​da una vasta gamma di organi e comprendono tutti i principali tipi di cellule. Tuttavia, le linee cellulari stabilizzate hanno alcune limitazioni. Il processo di immortalizzazione ovviamente cambia il comportamento delle cellule, in particolare rispetto alla durata di vita e la proliferazione, ma può anche influenzare l'espressione di proteine ​​imprevisti, come le proteine ​​citoscheletriche ^2. Inoltre, anche se molte linee cellulari differenti sono disponibili, vi è diversità significa....

Protocollo

1. Preparare Beads anticorpi coniugati

1. Un giorno prima della dissezione, unire l'anticorpo di scelta con le Dynabeads appropriate (ad esempio ratto IgG Dynabeads per un anticorpo cresciuto in ratto, 4 x 10 ⁸ perline / ml) per le istruzioni del produttore. Per il BD ratto anti-CD31 anticorpo (0,5 mg / mL, per isolare le cellule endoteliali), è aggiunto 3 anticorpo microlitri per ogni 25 microlitri perline, per una concentrazione finale di 1,5 mg anticorpo anti-CD31 e 1 x 10 ⁷ perline / 25 microlitri di buffer.
2. Incubare perline e anticorpi notte a 4 ° C.

2. Preparazione del pannell....

Risultati

Utilizzando un anticorpo specifico per endoteliale che riconosce CD31, le cellule endoteliali sono state isolate dai ventricoli del embrionali (E) 13.5 (Figura 1A) e 18,5 (Figure 1B-1D) embrioni. Quando cresciuto su un piatto di coltura trattata, queste cellule rimangono arrotondate e formerebbero un pattern di ciottoli se vicino confluenti (Figura 1A). Diluire il collagene è stato utilizzato anche per rivestire i pozzetti, e mentre le cellule endoteliali aderirà ad ess.......

Discussione

Lavorare con le cellule embrionali primarie consente nuovi esperimenti per affrontare in fasi critiche dello sviluppo in vitro. Tuttavia, la procedura di isolamento non è banale. Passaggi critici per isolare qualsiasi tipo di cellule comprendono assicurare che le cellule sono ben separati su digestione collagenasi e poi che siano ben sospesi durante le fasi di lavaggio. Dissezione meccanica pipettando aiuta notevolmente separare le cellule durante la fase di collagenasi, e la fase di filtraggio rimuove.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
REAGENTS
Timed-pregnant topi			Da sezionare allo stadio embrionale di interesse
Anti-topo CD31	BD Bioscience	553370
Rat IgG Dynabeads	Invitrogen	110-35
Collagen	BD Bioscience	354236
PBS (1x)
Collagenasi, tipo I	Worthington Biochemical	LS004196
DMEM	Cellgro
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
Terreno di crescita delle cellule endoteliali	(prodotto in laboratorio come descritto nelle note)		DMEM contenente il 20% di FBS, 5 μ M β-mercapt– thanol, 50 μ g/ml ECG e 1x penicillina/streptomicina
β-mercapt– thanol	Sigma-Aldrich	M6250
ECGS	Tecnologie biomediche, Inc.	BT-203
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140
Tripsina-EDTA	Gibco	25300
Piastra di coltura a 384 pozzetti	Greiner	T-3037-6	La piastra è stata preparata con un sottile gel di collagene, come descritto in 6; superficie di lavoro 10 mm2
Collagene di tipo I	BD	354236	Utilizzare in un finale concentrazione di 1,5 mg/ml
M199, 10x	Invitrogen	11825-015
Syto-16	Invitrogen	S7578	Utilizzato come indicato in 13
EQUIPMENT
Microscopio stereoscopico	Nikon	SMZ645
Incubatore per colture cellulari	Thermo	3110
DynaMag	Invitrogen	123-21D
Centrifuga da tavolo	Thermo	75002430