Biosensori per il rilevamento di antibiotici batteri di stafilococco resistenti

Summary

Biosensori fagi litici e perline anticorpi sono in grado di discriminare tra resistente alla meticillina (MRSA) e batteri di stafilococco sensibili. I fagi sono stati immobilizzati con un metodo Langmuir-Blodgett su una superficie di un sensore microbilancia cristallo di quarzo e lavorato come larghe sonde stafilococco gamma. Perle di anticorpi riconoscono MRSA.

Abstract

Un batteriofago litico strutturalmente trasformato avere una vasta gamma di ospiti di ceppi di Staphylococcus aureus e di una proteina legante la penicillina (PBP 2a) anticorpi coniugati perle di lattice sono stati utilizzati per creare un biosensore progettato per la discriminazione di meticillino-resistente (MRSA) e sensibile (MSSA) S . specie aureus ^1,2. I fagi litici sono state convertite in sferoidi fagiche dal contatto con all'interfaccia acqua-cloroformio. Fago monostrati sferoidali sono stati spostati su una superficie biosensore da Langmuir-Blodgett (LB) tecnica ^3. I biosensori creati sono stati esaminati da una microbilancia cristallo di quarzo con il monitoraggio di dissipazione (QCM-D) per valutare le interazioni batteri-fagi. Interazioni batterio-sferoidali portato alla frequenza di risonanza ridotta e un aumento della dissipazione energetica per entrambi i ceppi MRSA e MSSA. Dopo il legame batterico, questi sensori sono stati ulteriormente esposta alla penicillina-binding protein anticorpo lattice tallones. Sensori analizzati con MRSA hanno risposto a PBP 2a perline anticorpi, anche se i sensori controllati con MSSA hanno dato alcuna risposta. Questa distinzione sperimentale determina una discriminazione univoca tra resistente alla meticillina e S. sensibile aureus. Altrettanto legati e non legati batteriofagi sopprimere la crescita batterica sulle superfici e nelle sospensioni idriche. Una volta che i fagi litici vengono trasformati in sferoidi, conservano la loro forte attività litica e mostrano un'elevata capacità di cattura batterica. Il fago e fago sferoidi possono essere utilizzati per il test e la sterilizzazione di microrganismi resistenti agli antibiotici. Altre applicazioni possono includere l'uso in terapia batteriofago e superfici antimicrobiche.

Introduction

Ceppi meticillino-resistenti di Staphylococcus aureus sono stati suggeriti come fattore di infezioni essenziali e le epidemie nosocomiali ^4-8. Modi comuni di riconoscimento di resistenza alla meticillina, come la diffusione oxacillina prova schermo agar disco, o brodo microdiluizione, affidano a condizioni di coltura su misura per migliorare l'espressione di resistenza. Alterazioni comprendono l'utilizzo di oxacillina, incubazione a 30 o 35 ° C invece di 37 ° C, e l'inclusione di NaCl al mezzo di crescita. Inoltre, per una corretta rilevazione da questi tipi di tecniche, un lungo periodo di incubazione di 24 ore anziché 16 a 18 ore è n....

Protocol

1. Ponendo le basi

1. Ottenere tipo ceppo S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 e di Bacillus subtilis ATCC 6051. Ceppi meticillino-resistenti di S. aureus - MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Il fago litico 12600.
2. Ottenere PBP 2a anticorpi coniugati perle di lattice.
3. Preparare NZY media come descritto ^21.
4. Ottenere Soluzione tampone fosfato (PBS).
5. Preparare acqua deionizzata come ....

Results

Il fago dimostrato attività litica contro tutti i ceppi testati di S. aureus, compresi i ceppi di MRSA, come indicato dallo spot test fago. Dimensioni della placca in genere variavano da 5 a 15 mm. Nessuna attività è stata trovata contro altri test-culture (Tabella 1).

Una crescita normale di S. aureus ATCC 12600 in terreno NZY on-agitatore incubatore a 37 ° C è mostrata nella Figura 1A (una curva etichettato da cerchi vuoti). Il numero di .......

Discussion

E 'noto che i fagi possono essere usati come sonde biosensore per patogeni batterici ^28. Si dimostra in questo lavoro che fago insieme con anticorpi PBP 2a può essere utilizzata per risolvere il vecchio problema: ceppi resistenti e sensibili agli antibiotici discriminazione rapidi.

Si è riscontrato però quelle normali fagi stafilococciche non modificate non sono adatti al rilevamento batteri con i dispositivi QCM, anche se si legano batteri. La coda fago è così lunga che le on.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	P4417
	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	154733	(99.8% A.C.S.)
Esano-Anidro	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	29609-0	(95%)
Alcool etilico	Pharmco products Inc. Brookfield, CT	64-17-5	190 Proof
Equipment
PBP 2a anticorpo coniugato perline di lattice	Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Giappone	Il test
MRSA-ScreenS. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 e Bacillus subtilis ATCC 6051 dalla	American Type Culture Collection (Manassas, VA);
MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; Il fago litico 12600	La collezione di colture dell'Università di Auburn, Auburn, AL
Centrifuga	Beckman Coulter	Optima L-90K Ultra Centrifuga
KSV 2200 LB bilancia del film	KSV Chemicals, Finlandia
Sistema ottico per microscopio ottico	CitoViva Technology Inc., Auburn, AL
QCM-D	Q-Sense AB, Vä stra Frö lunda, Svezia	E4
Microscopio elettronico a scansione (SEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL-7000F SEM
Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)	JEOL USA Inc., Peabody, MA	JEOL, JEM 2010
Stericup, Presterilized	Millipore Corporation, Billerica, MA	SCGPU05RE	0.22 μ m, Piastra
bio-test	NUNC A/S, Danimarca	240835	Dimensioni (mm), 245 x 245 x 25
Pipette	Gilson, Pipetman, Francia	P100, P200, P1000
C24 Agitatore per incubatore	New Brunswick Scientific, CT	Classic C24
Pezzi di quarzo rivestiti in oro	Auburn University, AL		Piastre
	di Petri fatte in casaFisher Brand, USA	0875713	100 mmX15 mm
SterilGard III Advance	The Baker Company, ME	SG403
Fiasche per la coltivazione	Corning Incorporated, NY	4995	PYREX 250 ml Palloni di Erlenmeyer
Spettrometro ottico	Genesys 20. Thermo Spectronic, Stati Uniti.	4001
Pulitore al plasma	Harrick Plasma, USA	PDC-32G
Sistema di purificazione dell'acqua Millipore		Direct-Q
Imaging Ellipsometer	Accurion, USA	nanofilm_ep3se
Software	Q-Sense AB, Svezia	QSoft, QTools