Misurare le proprietà meccaniche del Living cellule utilizzando microscopia a forza atomica

Sommario

Questo documento illustra un protocollo per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi mediante micropenetrazione utilizzando un microscopio a forza atomica (AFM).

Abstract

Proprietà meccaniche delle cellule e la matrice extracellulare (ECM) svolgono un ruolo importante in molti processi biologici tra cui la differenziazione di cellule staminali, la formazione del tumore, e la guarigione delle ferite. Cambiamenti nella rigidità delle cellule e ECM sono spesso segni di cambiamenti nella fisiologia o malattie nei tessuti delle cellule. Quindi, rigidità cellula è un indice per valutare lo stato di colture cellulari. Tra la moltitudine di metodi applicati per misurare la rigidità di cellule e tessuti, micro-indentazione usando un microscopio a forza atomica (AFM) fornisce un modo per misurare in modo affidabile la rigidità delle cellule viventi. Questo metodo è stato ampiamente applicato per caratterizzare la rigidezza micro-scala per una varietà di materiali, tra cui superfici metalliche a tessuti biologici molli e cellule. Il principio di base di questo metodo è di rientrare una cella con una punta AFM di geometria selezionata e misurare la forza applicata dalla flessione del cantilever AFM. Montaggio della curva forza-indentazione per la modalità di Hertzl per la corrispondente geometria della punta può dare misure quantitative di rigidezza materiale. Questo documento illustra la procedura per caratterizzare la rigidezza delle cellule viventi mediante AFM. Passaggi chiave, tra cui il processo di AFM calibrazione, acquisizione forza-curva, e l'analisi dei dati utilizzando una routine di MATLAB sono dimostrati. Vengono anche discussi limiti di questo metodo.

Introduzione

Proprietà meccaniche, in particolare rigidità, di singole cellule e loro matrici extracellulari circostanti (ECM) sono fondamentali per molti processi biologici che comprendono la crescita cellulare, la motilità, divisione, differenziazione e omeostasi tissutale. ¹ È stato dimostrato che cellule rigidità meccanica è determinata principalmente dalla il citoscheletro, specialmente le reti di actina e filamenti intermedi e altre proteine ​​ad essi associati. ² risultati di prove meccaniche su reti in vitro di actina e filamenti intermedi suggeriscono che la meccanica delle cellule dipende in gran parte la struttura del citoscheletro e la pre-stress in il citoscheletro. ^3-5 Rigidità di cellule vive è quindi considerato come un indice per valutare la struttura del citoscheletro ^{6, 7} attività miosina e molti altri processi cellulari. Ancora più importante, i cambiamenti nelle proprietà meccaniche delle cellule sono spesso trovati ad essere strettamente associatiato con diverse condizioni di malattia come la formazione di tumori e metastasi ^8-10 Monitoraggio della rigidità meccanica delle cellule viventi può quindi fornire un nuovo modo di monitorare la fisiologia cellulare,. di rilevare e diagnosticare le malattie ^8;. ed a valutare l'efficacia dei trattamenti farmacologici ^{11 , 12}

Metodi multipli comprese microrheology particella-tracking, ^13-16 torsione magnetica citometria, ¹⁷ micropipetta aspirazione ^18,19 e micropenetrazione ^20-22 sono stati sviluppati per misurare l'elasticità delle cellule. Particella di monitoraggio microrheology ripercorre le vibrazioni termiche di entrambi particelle fluorescenti inferiori al micron iniettati in cellule o marcatori fiduciali all'interno del citoscheletro delle cellule. ²³ proprietà elastiche e viscose di cellule sono calcolati gli spostamenti delle particelle misurate usando il teorema di fluttuazione-dissipazione. ^14,23 Questo metodo permette di misurazioni simultanee di localeproprietà meccaniche con alta risoluzione spaziale in luoghi diversi in una cella. Tuttavia, l'iniezione di particelle fluorescenti in cellule può portare a cambiamenti nella funzione cellulare, la struttura del citoscheletro, e quindi la meccanica delle cellule. Il metodo di aspirazione micropipetta applica pressione negativa in una micropipetta di diametro compreso tra 1 e 5 um succhiare un piccolo pezzo di membrana cellulare nella pipetta. Cella rigidezza viene calcolata dalla pressione negativa applicata e deformazione della membrana cellulare. ¹⁸ Questo metodo, tuttavia, non può rilevare la distribuzione eterogenea della rigidezza attraverso la cella. Citometria torsione magnetica (MTC) applica campo magnetico per generare coppia sulla super-perline paramagnetiche attaccati alla membrana cellulare. ¹⁷ Cella rigidezza è derivato in questo metodo dal rapporto tra la coppia applicata e la deformazione torsione della membrana cellulare. È difficile controllare la posizione di perline magnetiche nel metodo MTC, ed è anche challenging per caratterizzare la deformazione torsione con alta risoluzione. Micropenetrazione applica un penetratore con geometrie ben definite a pugni nella cella. La forza di rientro e il rientro risultato cellule seguono spesso la previsione del modello Hertz. Di Young dei moduli delle celle può essere calcolata dalle curve forza indentazione dotandoli al modello Hertz. Questo metodo è stato ampiamente applicato per testare le proprietà meccaniche del tessuto e di cellule dispetto delle sue limitazioni quali l'incertezza nella determinazione contatto puntiforme, applicabilità del modello Hertz, e il potenziale di danneggiare fisicamente le cellule. Tra i molti dispositivi per microindentaion ^20, il microscopio a forza atomica (AFM) è disponibile in commercio ed è stato ampiamente applicato per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule e tessuti viventi ^21,24-27.

Questo documento dimostra la procedura di utilizzo di un asilo MFP3D-Bio AFM per la caratterizzazione meccanica delle cellule. AFM non suly fornisce topografia ad alta risoluzione di cellule, ma anche è stato ampiamente applicato per caratterizzare le proprietà meccaniche delle cellule dei tessuti. Il principio della AFM indentazione è illustrato in Figura 1. Il cantilever AFM avvicina alla cella da pochi micrometri sopra; fa contatto con la cellula; trattini la cella in modo che la flessione della leva raggiunge un punto di regolazione preselezionata; e tira via dalla cella. Durante questo processo la flessione della leva viene registrata come funzione della sua posizione come mostrato nella Figura 1. Prima di prendere contatto con la cellula, il cantilever muove nel medio senza alcuna deviazione apparente. Quando rientro in cella, le curve a sbalzo e di aumento del segnale di deflessione. I cantilever sono modellati come travi elastica in modo che la loro deflessione è proporzionale alla forza applicata alla cella. Impostando la massima flessione della leva, la grandezza massima della forza applicata al campione viene limitata per evitare dAMAGE alle cellule. La porzione della curva di forza dal punto B al punto C in figura 1, dove i trattini punta nella cellula, viene adattata al modello hertz per estrarre la rigidità cella.

Figura 1. Illustrazione di AFM micropenetrazione e l'interpretazione della curva di forza. Il pannello superiore mostra il movimento del cantilever AFM guidato dallo scanner piezoelettrico. La posizione verticale della mensola z e flessione della leva segnale d viene registrato durante il processo. Il cantilever parte da un punto, di pochi micrometri sopra la cella. Mentre si avvicina la cella, la rientranza δ campione rimane zero fino a raggiungere il punto b, in cui la punta viene a contatto con la cellula. Le coordinate del punto b nel grafico sono valori criticiper l'analisi dei dati, indicato con (z _0, d _0>). Da B a C, i trattini sbalzo nella cella finché flessione della leva raggiunge un punto di regolazione, che è impostato per essere il rapporto tra la forza massima indentazione mirata e la costante elastica cantilever. Una volta che il segnale di deflessione raggiunge il valore massimo prestabilito, il cantilever viene poi ritirato dalla cella a punto d, dove spesso viene tirata verso il basso a causa di punta-campione adesione, stacca dalla cella e ritorna alla sua posizione iniziale a e. Il pannello destro mostra la relazione tra la rientranza e la z registrata e segnale d. In sul pannello di sinistra inferiore è un diagramma di una curva rappresentativa forza, il rientro massimo di un cantilever, la cui costante elastica è misurata essere 0.07N / m, è impostato per essere 17 nm, in modo che la forza massima applicata al rientro campione è 1,2 nN. Le posizioni chiave durante il rientro sono contrassegnati.

Protocollo

1. Calibrare la Costante molla di sbalzo

1. Caricare il cantilever in AFM in base alle istruzioni del produttore. È necessario pulire il supporto a sbalzo con etanolo prima di qualsiasi esperimenti. Ciò contribuirà a limitare la contaminazione batterica di cultura durante le misurazioni AFM.
2. Calibrare InvOLS (Inverse Leva Sensibilità ottica). Questo parametro indica la quantità di risposta fotodiodo (Volt) per nanometro di sbalzo deflessione.
3. Caricare un vetrino pulito sul palco del campione, quindi installare la testa AFM e regolare il raggio laser e l'allineamento in base alle istruzioni del produttore. Inserire la punta AFM sul vetrino.
4. Con il piezo ritirata, riallineare lo specchio di una lettura fotodiodo di -2 V. Eseguire una misurazione spettroscopia forza con un trigger point (risposta massima fotodiodo) di 2 V.
5. Con il piezo ritirata, riallineare lo specchio di una lettura fotodiodo di -2 V. Effettuare un foRCE misura spettroscopia con un trigger point (risposta massima fotodiodo) di 2 V. Nota: I valori di tensione qui sono specifici per l'asilo AFM. Questo valore deve essere impostato in base alle specifiche fornite dal produttore.
   Dopo l'acquisizione dei dati è completa, lo zoom alla regione ferma-contatto della curva di forza. Eseguire un adattamento lineare a questa regione per trovare la pendenza, che sarà in V / nm. Il reciproco di questo valore descrive la sensibilità ottica dell'insieme cantilever-fotodiodo.
6. Ripristinare l'allineamento specchio per una deviazione libero di 0 V.
7. Calibrare la costante della molla a sbalzo. Un metodo termico-tune viene utilizzato per determinare la costante di molla a sbalzo ^28.
8. Dopo aver calibrato i InvOLS, sollevare lo scanner lontano dal palco campione tale che non ci sono interazioni tra la punta e il campione.
9. Iniziare l'acquisizione di dati termici. Durante questo processo, la vibrazione termica della trave a sbalzo è Recorded. Il software AFM analizza uno spettro di potenza di un tale vibrazione termica e trame in una finestra di dati.
10. Dopo alcuni secondi di acquisizione dati, eseguire un adattamento per il segmento di dati centrata alla frequenza fondamentale più bassa (risonanza fondamentale) picco per determinare la costante della molla.

2. Caricamento del campione

1. Installare il riscaldatore accessorio Piatto sul palco AFM, se non è già dotato.
2. Impostare la temperatura a 37 ° C, e attendere 20 min per il sistema di raggiungere un equilibrio termico stabile.
3. Posizionare il piatto cultura sul palcoscenico AFM e fissarlo utilizzando il morsetto con il riscaldatore piatto. È importante minimizzare il tempo tra la rimozione del piatto dall'incubatore e posizionandolo sulla scena, per evitare traumi alle cellule. Per misurazioni più lunghi di 30 min, CO _{2 medi} indipendente dovrebbe essere usato per sostituire il normale mezzo di coltura.
4. Applicare una piccola goccia di 37 ° C terreno di coltura alla punta di tegli cantilever AFM, e abbassare la testa AFM finché la punta è appena immerso in un liquido.
5. Utilizzo della fotocamera top-view CCD, riallineare il fascio laser sul cantilever (l'allineamento nel liquido sarà diversa in aria, a causa della variazione dell'indice di rifrazione del mezzo).
6. Inserire la punta AFM in una zona pulita del piatto cultura.
7. Eseguire la calibrazione dei InvOLS come descritto sopra, per la sensibilità cantilever nell'ambiente liquido.

Nota: a) Se le cellule sono coltivate su idrogel, la calibrazione di InvOLS dovrebbe essere eseguita in anticipo contro la superficie inferiore di una piastra di coltura riempito di mezzi di coltura cellulare. Quando si passa a campioni di cellule, una particolare attenzione deve essere pagato per non modificare l'allineamento del fascio laser con il cantilever. b) InvOLS deve essere ricalibrato ogni volta che c'è un cambiamento nella allineamento laser. c) Si raccomanda inoltre di prendere InvOLS come media di valore da diverse curve di calibrazione, since ogni calibrazione genera un diverso InvOLS. La variazione InvOLS è, tuttavia, piccolo rispetto al valore medio. Ad esempio, la calibrazione di un Bruker DNP-10 a sbalzo con la costante 0,06 N / m di liquido da 100 volte primavera produrre un valore medio InvOLS di 66,3 nm / V, con deviazione standard di soli 0,5 nm / V.

3. Raccolta Forza Curve di cellulare indentazione

1. Selezionare una cella per il rientro. Con l'ausilio del microscopio ottico, spostare la fase di posizionare il cantilever sopra la cella in modo che la punta si trova nella regione peri-nuclei. Regolazione precisa della posizione a sbalzo può essere realizzato mediante l'applicazione di offset per il scanner X e Y.
   Nota: Il cantilever AFM deve essere ritirato dalla superficie del campione, mentre spostando la fase di campionamento per selezionare una cella di destinazione. Questo protegge il cantilever urti tra il campione, poiché la superficie del campione non può essere piatta.
2. Passare a forzare la modalità Spettroscopia. Impostare il rientrotasso nell'intervallo di 1-10 micron / sec, sufficientemente basso da evitare effetti idrodinamici.
3. Impostare il punto di innesco di deflessione, che limita la forza massima indentazione per evitare danni alle cellule. Selezionare l'opzione triggering relativa, che correggerà eventuali derive nel segnale di deflessione. Una forza massima di 2 nn è un buon punto di partenza per la maggior parte dei campioni. Questo valore, tuttavia, dovrebbe essere regolata in base alla rigidità del campione. Per campioni morbidi un valore inferiore deve essere utilizzato per evitare un eccesso di indentazioni al campione. Per campioni rigidi un valore elevato dovrebbero essere utilizzati per generare indentazione misurabili.
4. Impostare la distanza forza sufficientemente grande da garantire che la punta sarà completamente staccato dalla cella tra le misurazioni di forza. Solitamente, la distanza di forza è fissato a 5 micron.
5. Comandare l'AFM per prendere una singola curva forza.
6. Raccogliere almeno tre curve di forza in diverse località della regione peri-nuclei di ogni cellula. Anche se è utile per prendere multiplacurve su ogni cella di dati statistici affidabili, prendendo troppe curve di forza possono portare a cambiamenti nella rigidità delle cellule a causa di stress dalla sonda AFM.
7. Quando la raccolta dei dati è completa, ritirare la punta, e ripetere i passaggi 3,1-3,6 per le celle come necessario per i buoni dati statistici sulla rigidità delle cellule in una determinata condizione di esempio. Solitamente, 30 celle sono misurati per ogni condizione.

Per caratterizzare la distribuzione di rigidezza all'interno di una singola cellula, viene applicata la modalità forza-map. Nella modalità Forza-mappa, impostare un formato di scansione per includere la regione di interesse; impostare una risoluzione appropriata, impostare i parametri di rientro di quelli selezionati per curve di spinta singoli; l'AFM sarà poi raster in tutta l'area del campione definito e prendere curve di spinta singoli ad ogni pixel nella regione campione.

4. Analisi dei dati

Le curve di forza registrati vengono analizzati utilizzando una procedura MATLAB personalizzato per calcolare la rigidezza cella. Quello che segue è una breve descrizione del procedimento MATLAB:

1. Il programma MATLAB identifica il punto di contatto e coordinate z0 d0 (vedi Figura 1) usando un algoritmo adottato da un metodo pubblicato da Lin et al ^29.:
2. Per ciascun punto di dati nella curva di forza, eseguire un adattamento lineare dei dati alla sinistra del punto di interesse, e un modello Hertz adatta a destra (utilizzando il punto selezionato come punto iniziale di contatto), fino al set massima indentazione (200-300 nm consigliati).
3. Per ogni punto, calcolare l'errore relativo RMS di entrambi convulsioni ed sommare questi valori.
4. Il punto che raggiunge l'errore totale minimo raccordo viene selezionata come punto iniziale di contatto.
   Nota: il tempo di calcolo può essere ridotto mediante l'attuazione di una ricerca d'oro-sezione piuttosto che la scansione lineare tutta la curva forza.
5. Esempio di deformazione δ e rientro forza F sono calcolate come:
   
6. Un raccordo minimi quadrati viene applicato per adattarsi alla F vs dati δ nella regione post-contatto, z ≥ z _0, al modello Hertz per estrarre il modulo di Young, E della cella:
   
   , Dove v è il modulo di Poisson.
   Nota: Quando δ è superiore al 10% dello spessore del campione (altezza cella), la rigidezza cella misurata viene influenzato dalla rigidità del substrato. Lo spessore della regione peri-nucleare è solitamente dell'ordine di pochi micrometri. Pertanto, solo i primi 200-300 nm di F-δ curva si adattano al modello di Hertz.

Risultati

La figura 2a mostra tre curve di forza rappresentativi tratti da fibroblasti 3T3 in coltura su superficie di plastica, gel di poliacrilammide di moduli di Young 3.000 Pa e 17.000 Pa, rispettivamente. Dopo aver identificato con attenzione i punti di contatto delle curve, la forza di rientro in funzione della deformazione delle cellule è tracciata in Figura 2b. Sotto una forza di grandezza inferiore a 0,3 nN, una piramide forma della punta del trattini 3 micrometri in una cellula in coltu...

Discussione

Il metodo di indentazione AFM ha vantaggi per caratterizzare le proprietà meccaniche di cellule viventi. Seppur meno sensibile della citometria a torsione magnetica e pinzette ottiche, in grado di misurare le forze a livello piconewton ^32, l'AFM in grado di rilevare la forza di resistenza da campioni che vanno da decine di pico-Newton a centinaia di nano-Newton, paragonabili a spaziare di forza che può essere applicato a cellule usando una micropipetta ^19. Questo intervallo di forza adatta alle...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
microscopio a forza atomica	per la ricerca sull'asilo	MFP3D-BIO