Abbiamo sviluppato un DNA-binding, dosaggio quantitativo basato su ELISA per misurare le interazioni tra fattori di trascrizione con il DNA. Alta specificità per la proteina RUNX2 è stato raggiunto con un consenso DNA riconoscimento oligonucleotide e anticorpo monoclonale specifico. Rilevamento colorimetrico con una reazione substrato anticorpo enzimatico accoppiato stata monitorata in tempo reale.
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Articolo metodologico
Un quantitativo test per studiare proteine: DNA interazioni, Discover trascrizionali regolatori dell'espressione genica, e identificare nuovi agenti anti-tumorali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Molti legano il DNA test come test di spostamento mobilità elettroforetica (EMSA), saggi chemiluminescenti, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) a base di saggi e saggi pozzetti-based sono utilizzati per misurare attività del fattore di trascrizione. Tuttavia, questi saggi sono nonquantitative, mancano di specificità, possono comportare l'uso di oligonucleotidi radiomarcati, e non possono essere adattabile per lo screening di inibitori di legame al DNA. D'altra parte, utilizzando un saggio quantitativo di legame al DNA immunoenzimatico (ELISA-D) Test, dimostriamo interazioni proteina nucleare con DNA utilizzando il fattore di trascrizione RUNX2 che dipendono specifica associazione con consenso DNA-binding sequenze presenti sulla biotina- oligonucleotidi etichettati. Preparazione delle cellule, estrazione di proteine nucleari, e la progettazione di oligonucleotidi a doppio filamento sono descritti. Piastre a 96 pozzetti rivestite di avidina sono fissati con tampone alcalino e incubate con proteine nucleari a nucleotide tampone di bloccaggio. Follgrazie lavaggio estensivo delle piastre, l'anticorpo primario specifico e incubazioni anticorpi secondari sono seguiti dall'aggiunta di substrato perossidasi di rafano e lo sviluppo della reazione colorimetrica. Modalità di reazione di arresto o il monitoraggio continuo cinetica sono stati utilizzati per misurare quantitativamente l'interazione delle proteine con il DNA. Discutiamo adeguati controlli specificità, compreso il trattamento con i non-IgG specifiche o senza proteine o anticorpo primario. Applicazioni del saggio sono descritte compresa la sua utilità in screening di farmaci e risultati positivi e negativi rappresentativi sono discussi.
Introduzione
DNA-binding saggi hanno utilità nel misurare la capacità dei fattori di trascrizione per interagire con il DNA. I saggi di legame al DNA includono elettroforetici saggi mobility shift (EMSA) che dipendono da oligonucleotidi radioattivi 1 o saggi chemiluminescenza 2. Saggi cromatina immuneprecipitation (chip) basate 3 e saggi che impiegano formati da 96 pozzetti 4 sono state descritte. Tuttavia, l'EMSA è un'analisi non quantitativa che richiede l'uso di oligonucleotidi radiomarcati. Quando le proteine nucleari associano con le specifiche sequenze promotrici nucleotide, complessi vincolanti sono ritardati su gel....
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Protocollo
Diverse fasi vengono eseguite in anticipo e diversi reagenti vengono preparate e conservate prima della procedura: (1) cultura e proteine cella di isolamento, (2) preparazione di oligonucleotide, (3) Preparazione di piastre a 96 pozzetti, (4) estratto nucleare notte di incubazione. Procedura prevede due giorni a causa della notte di incubazione della proteina nucleare con oligonucleotidi di DNA.
1. Preparazione del buffer
1.1 isolamento delle proteine nucleari
- Ipotonica Buffer: Per preparare 100 ml di tampone ipotonico, aggiungere 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 150 ml (1 M MgCl 2), 333 ml (3 ....
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Risultati
Il metodo D-ELISA è altamente specifico per la proteina legante il DNA designato finché viene utilizzato un oligonucleotide a doppio filamento sequenza-specifica, contenente tre copie del sito di legame consenso RUNX2 (ACACCA). L'anticorpo primario che riconosce la proteina che migliora anche la specificità. L'anticorpo secondario contiene covalentemente legata perossidasi di rafano (HRP) che converte un substrato trasparente (tetrametil benzidina) per un prodotto colorato per facilità di rilevamento (Fi.......
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Discussione
DNA-binding saggi vengono utilizzati per misurare la capacità dei fattori di trascrizione per interagire con il DNA. I saggi di legame per DNA includono spostamento elettroforetico mobilità (EMSA) 1 e immuneprecipitation cromatina (ChIP) saggi basati 3 nonché saggi occupata formati da 96 pozzetti 4 come saggi chemiluminescenti 2. L'EMSA è non-quantitativa e utilizza radioattivo (32 P) oligonucleotidi. Questi sono incubati con proteine nucleari e complessi vinc.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo nulla da rivelare.
Ringraziamenti
L'assistenza tecnica e la strumentazione della University of Maryland Greenebaum Cancer Center traslazionale Nucleo Fondo, in particolare Drs. Rena Lapidus e Mariola Sadowska, sono riconosciuti con gratitudine. Il lavoro di responsabile per lo sviluppo di questo test è stato finanziato in parte dal NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, un VA Merit Award per AP, e l'Università del Maryland sigaretta restituzione Funds (CRF) fornita al Marlene & Stewart Greenebaum Cancer Center.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 anticorpo | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific perossidasi coniugato anticorpo | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7,1 mg/ml |
| TMB Substrato (tetrametilbenzidina) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Carbonato di sodio | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | per il fissaggio delle piastre |
| VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Soluzione di arresto | |
| Piastre multipozzetto | Greiner Bio-One, Basilea, Svizzera | 655996 | Rivestimento di avidina, lati neri |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Inibitori della proteasi e della fosfatasi |
| Prodotti chimici | Produttori vari | Grado | |
| Tabella 1. Reagenti | |||
| Spettrofotometro: Biotrak II Lettore di piastre visibili | Amersham Biosciences | Per l'uso con il metodo di reazione di arresto | |
| Spettrofotometro: Bio-Tek Synergy HT Lettore di micropiastre multireazione | Bio-Tek Instruments, Inc. | Da utilizzare con il monitoraggio cinetico continuo | |
| Tabella 2. Equipaggiamento |
Riferimenti
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al.
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Ristampe e permessi
