Tutta Monte immunofluorescenza del mouse Retina neonatale per Indagare Angiogenesi<em&gt; In vivo</em

Sommario

La retina murina neonatale fornisce un modello fisiologico ben caratterizzato dell'angiogenesi, che permette indagini sui ruoli dei geni o farmaci diversi che modulano l'angiogenesi in un In vivo Contesto. Immunofluorescenza per visualizzare con precisione il plesso vascolare è fondamentale per il successo di questo tipo di studi.

Abstract

L'angiogenesi è il complesso processo di formazione di nuovi vasi definito dalla germinazione di nuovi vasi sanguigni da una rete di vasi pre-esistente. Angiogenesi gioca un ruolo chiave non solo nel normale sviluppo di organi e tessuti, ma anche in molte malattie in cui la formazione del vaso sanguigno è disregolato, come il cancro, cecità e malattie ischemiche. Nella vita adulta, i vasi sanguigni sono generalmente quiescente così angiogenesi è un obiettivo importante per il romanzo lo sviluppo di farmaci per cercare di regolare la formazione di nuovi vasi specificamente nella malattia. Per capire meglio l'angiogenesi e di sviluppare strategie appropriate per regolarlo, i modelli sono richieste che rispecchiano fedelmente le varie fasi biologiche che sono coinvolti. Il mouse retina neonatale fornisce un eccellente modello di angiogenesi perché arterie, vene e capillari sviluppano a formare un plesso vascolare durante la prima settimana dopo la nascita. Questo modello ha anche il vantaggio di avere un due dibidimensionale (2D) Struttura rendendo semplice analisi rispetto alla complessa anatomia 3D di altre reti vascolari. Analizzando la retina plesso vascolare in tempi diversi dopo la nascita, è possibile osservare le varie fasi della angiogenesi al microscopio. Questo articolo illustra una procedura semplice per analizzare il sistema vascolare di una retina di topo mediante colorazione fluorescente con anticorpi specifici isolectin e vascolari.

Introduzione

L'angiogenesi è un processo complesso dello sviluppo definito dalla formazione di nuovi vasi sanguigni da una rete di vasi preesistenti ed è regolata da diverse vie di segnalazione. Il più importante di questi è il pathway VEGF. VEGF è rilasciato dalle cellule ischemiche e porta alla apertura di angiogenico spuntano nei vasi sanguigni circostanti. La cellula endoteliale leader da un nuovo germoglio vascolare è una 'punta' cellula, che produce filopodi che raggiunge fuori verso la sorgente di VEGF, ed è seguita da proliferazione delle cellule endoteliali 'gambo'. In questo modo, le cellule endoteliali attivate migrano e proliferano verso una regione avascolare dove formano nuovi tubi vascolari. Al fine di stabilizzare questi tubi per sostenere il flusso di sangue, cellule endoteliali interagiscono con periciti e cellule muscolari lisce, che circondano i nuovi vasi sanguigni ^1. Angiogenesi è essenziale per vascolarizzazione dell'embrione e tessuti in crescita. Tuttavia, essa contribuisce anche a molti patologicodisturbi cal come il cancro; che difetti di angiogenesi sono associati a malattie ischemiche. Lo sviluppo di trattamenti farmacologici efficaci per regolare l'angiogenesi come mezzo di trattamento malattia è quindi di grande interesse. Per esempio, efficaci fattori anti-angiogenici ridurranno la crescita del cancro, mentre strategie pro-angiogenici possono essere usati per trattare la malattia ischemica. Così, i modelli di angiogenesi sono essenziali per comprendere meglio la regolazione della formazione di nuovi vasi e per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per migliorare o ridurre la crescita vascolare.

Un elemento fondamentale della ricerca angiogenesi è la scelta di un modello appropriato vascolare. Molti modelli in vitro sono stati progettati per riprodurre i passi base dell'angiogenesi come la migrazione delle cellule endoteliali, la proliferazione e la sopravvivenza ^2,3. Un frequentemente utilizzati saggio in vitro è la formazione di una rete ramificata di cellule endoteliali su una matrice in Matrigel, sebbene til suo non è specifico per le cellule endoteliali, né di solito incorporano il supporto di periciti o cellule muscolari lisce. Valutazione della ex vivo germinazione angiogenesi usando organo cultura mouse, ad esempio, il saggio corpo embrioide, il saggio anello aortico e il saggio metatarso fetale permette l'analisi di angiogenesi delle cellule endoteliali nel contesto delle cellule di supporto aggiuntivi. Tuttavia, le limitazioni principali di questi saggi comprendono la mancanza di flusso di sangue e la regressione dei vasi nel tempo, dando una limitata finestra di analisi. Pertanto, per comprendere la regolazione dell'angiogenesi, più precisamente, in modelli in vivo sono necessari come quelli sviluppati nel topo usando spugne impiantati sottocute o spine matrigel, così come il modello di ischemia dell'arto posteriore. Tuttavia, questi modelli sono difficili da analizzare a causa della complessa architettura 3D del neovasi. In contrasto, l'embrione zebrafish è dimostrato un modello eccellente per visualizzare angiogenesi in tuttamicrorganismo ^4. Tuttavia, il topo è evolutivamente molto più strettamente correlato umano rispetto zebrafish, rendendo così il mouse un modello preferito in molti casi. Conseguentemente angiogenesi della retina topo postnatale rappresenta un metodo ben caratterizzato di scelta per la ricerca angiogenesi. Esso non solo fornisce un ambiente fisiologico, ma anche un 2D plesso vascolare che può essere facilmente visualizzato per mezzo di macchie fluorescenti appropriati. L'architettura della rete nave, proliferazione endoteliale, crescita, reclutamento di cellule perivascolari e vaso rimodellamento possono tutti essere studiata utilizzando questa tecnica.

Nella retina neonatale topo, lo sviluppo dei vasi retinici avviene nella prima settimana di vita postnatale. I topi, a differenza degli umani, nascono ciechi e le retine diventano solo vascolarizzato dopo la nascita. Vasi retinici nascono dal centro della retina vicino al nervo ottico al giorno postnatale 0 (P0), e si sviluppano da angiogenesi per formare un altamente organizzared plesso vascolare che raggiunge la periferia retinica di circa ⁵ P8. I vasi sanguigni si sviluppano in modo caratteristico con il plesso capillare gradualmente crescente verso l'esterno del disco ottico verso la periferia per generare un normale modello di alternanza delle arterie e delle vene, con una rete capillare di intervenire. La vascolarizzazione della retina fornisce un modello ideale per studiare l'angiogenesi come i vasi possono essere facilmente identificati come crescono in quello che è essenzialmente un piano 2D, rendendo così relativamente facile per esaminare la vascolarizzazione retinica nei preparati TV a montaggio ^5. Un metodo per isolare il mouse retina neonatale per analisi delle risposte delle cellule endoteliali punta su diverse ore ex vivo è stato riportato ^6. In alternativa, un esame più dettagliato di tutto il sistema vascolare della retina e marcatori vascolari associate richiede immunoistochimica di campioni di retina fisse a diversi stadi di sviluppo.

Qui forniamouna descrizione dettagliata di un metodo affidabile e tecnicamente semplice che utilizziamo per tutta la colorazione monte della retina murina plesso vascolare, dalla enucleazione iniziale dell'occhio postnatale (vedere anche ⁷⁾ attraverso i protocolli di colorazione per l'imaging finale al microscopio.

Protocollo

Tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente, se non diversamente indicato.

1. Enucleazione e la fissazione di postnatali Occhi

1. Posizionare il mouse eutanasia cucciolo su un lato, togliere la pelle che copre gli occhi con le forbici.
2. Utilizzare forbici e pinze per enucleare l'occhio.
3. Luogo forbici sotto l'occhio enucleato, tagliare il nervo ottico e dei tessuti circostanti e sollevare l'occhio. Trasferire in una piastra a 24 pozzetti contenente 4% paraformaldeide (PFA) composto 2x in PBS a temperatura ambiente.
4. Consentire ad ogni occhio di fissare per il 10 - 15 min, poi trasferimento al freddo 2x PBS in ghiaccio per 5 - 10 min. È meglio sfalsare enucleazioni e fissazione successiva per garantire il grado di fissazione è uguale per ogni occhio.

2. Dissezione di postnatali retine murini

1. Trasferire gli occhi in una capsula di Petri contenente 2x PBS utilizzando una pipetta Pasteur di plastica che è stato tagliato per allargare il foro e posto sotto una diffuamen microscopio.
2. Rimuovere eventuale grasso intorno all'occhio con pinze e forbici.
3. Pierce il bordo della cornea con forbici affilate e tagliare intorno alla cornea e iride e scartare.
4. Inserire pinza tra retina e la sclera e rimuovere la sclera facendo attenzione a non strappare la retina. Lo strato coroide può anche essere rimosso, ma se vi è il rischio di danni alla retina occorrono durante tale fase, lo strato coroide può essere lasciato in quanto non dovrebbe influenzare significativamente la qualità della immunocolorazione.
5. Rimuovere la lente e l'umor vitreo con pinze.
6. Rimuovere i vasi hyaloids raccogliendo insieme nel centro dell'occhio con una pinza sottile poi rapidamente allontanarsi dal centro della retina (in alternativa snip alla base dei vasi hyaloid con le forbici sottili).
7. Sciacquare la retina a forma di coppa con PBS in un piatto pulito Petri.
8. Fare 4 a 5 incisioni radiali raggiungono circa 2/3 del raggio della retina mediante molla scissors creare una forma 'petalo'.
9. Erogare PBS utilizzando una pipetta Pasteur per appiattire la retina, e quindi rimuovere l'eccesso di PBS con un piccolo pezzo di carta assorbente.
10. Lentamente pipetta freddo (-20 ° C) il metanolo goccia a goccia sulla superficie della retina fino totalmente coperto e poi alluvione con ulteriore metanolo. Ciò contribuirà a risolvere le retine e faciliterà permeabilizzazione. Le retine diventeranno bianche.
11. Trasferire in una provetta 2 ml utilizzando una pipetta Pasteur di plastica che è stato tagliato per allargare il foro.
12. Lascia retina in metanolo freddo per almeno 20 minuti prima di procedere con immunoistochimica. Degli anticorpi usati qui, solo VE-Caderina non può essere utilizzato con successo su metanolo retine fissi. In questo caso le retine devono proseguire dritto dell'immunocolorazione dopo il punto 9.
13. Se necessario, le retine può essere conservato in metanolo a -20 ° C fino a diversi mesi prima della colorazione.

3. Immuno / colorazione isolectin della retina Vascuslatore

1. Rimuovere con attenzione / versare via metanolo e delicatamente risciacquare retine brevemente in PBS (in questa fase la retina è ancora nella stessa 2 ml di tubo dal punto 11 di cui sopra).
2. Rimuovere PBS e copertura retine con 100 ml di soluzione di Perm / blocchi (PBS + 0,3% Triton + 0,2% BSA) + 5% di siero appropriato (cfr. tabella 1) e agitare delicatamente per 1 ora.
3. Rimuovere Perm / Blocca e incubare retine agitando delicatamente la notte a 4 ° C con 100 ml di anticorpi primari selezionati (vedi Tabella 1) e / o IsolectinB4, tutti preparati diluendo a Perm / blocchi.
4. Rimuovere anticorpo / isolectin e lavare retine 4 x 10 min in PBS + 0,3% Triton (PBSTx).
5. In alcuni casi, per esempio seguente colorazione con IsolectinB4-Alexa488 o un anticorpo primario direttamente coniugato, non è richiesto un anticorpo secondario e retine può essere montato direttamente (fase 7). Quando un anticorpo primario non coniugato è stato utilizzato nel passaggio 3, poi 100 microlitri della appropriata FluorÈ aggiunto anticorpo secondario escent (diluito 1/200 in PBSTx) e lasciata incubare una notte a 4 ° C o per 4 ore a temperatura ambiente.
6. Rimuovere anticorpo secondario e lavare retine 4 x 15 min in 2 ml PBSTx.
7. Trasferire retine su vetrini utilizzando un ampio foro di plastica pipetta Pasteur e rimuovere l'eccesso PBSTx con tessuto assorbente. Mount retine con l'aggiunta di 50 ml di prolungare mezzo di montaggio su un vetrino e delicatamente posizione sopra la retina.
8. Trasferimento scivola al frigorifero per una notte a 4 ° C, assicurando che siano piatte e al riparo dalla luce, per consentire al Prolungare montante per impostare.
9. Retina immagine utilizzando un microscopio confocale o un microscopio a epifluorescenza.

Risultati

Dopo la dissezione della retina dovrebbe apparire come un fiore piatto (Figura 1). Utilizzando il protocollo, di cui sopra, le cellule endoteliali possono essere visti utilizzando isolectin colorazione B4-Alexa488 e sostenendo cellule muscolari vascolari sono visualizzati tramite actina muscolo liscio anti-alfa (Figura 2). La vista a bassa potenza usando un obiettivo 5X in figura 2 consente una visione d'insieme dell'organizzazione vascolare della retina. Inoltr...

Discussione

Il metodo qui presentato offre un modo semplice ed efficace per ottenere immagini colorate preparativi monte intero di retine neonatali del mouse, il che rende un modello facilmente quantificabile e fisiologicamente rilevanti di angiogenesi. Inizialmente, l'occhio del mouse può essere molto difficile da sezionare grazie alle sue piccole dimensioni e la forma globo, quindi sono necessarie una certa pratica e di buoni strumenti di dissezione per risultati affidabili. Dissezione di occhi preparati in 2x concentrazione ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
MaterialPipette
in plastica Forniture	laboratorio scientifico	PIP4210	Rimuovere la punta con le forbici per creare un foro largo
Piastre BD Falcon a 24 pozzetti	Forniture per laboratorio scientifico	353226
Piastre Petri selezionate TV Forniture per laboratorio scientifico da 90 mm		SLS2002
vetrini Histobond	VWR	631-0624
Vetrini coprioggetti 22 x 22 mm	VWR	631-1336
Dumont Pinzette #5	World precision instruments	14095
Forbici a molla lunghe 10,5 cm, con lame diritte da 8 mm	precision	instruments 501235	Utilizzate per l'enucleazione
Forbici Vannas lunghe 8,5 cm, con lame diritte da 7 mm e punte superfini da 0,025 x 0,015 mm	Strumenti di precisione mondiali	500086	Utilizzato per la dissezione della retina
Forbici vannas superfini lunghe 8 cm con lame diritte da 3 mm e punte superfini da 0,015 x 0,015 mm Strumenti di	precisione mondiali	501778	Utilizzato per la dissezione
provette cristalline per retina 2 ml	Starlab	E1420-2000
Reagents
Sodium phosphate dibasico	Sigma	S0876	Reagente PBS
Fosfato di potassio monobasico	Sigma	P5655	Reagente PBS
Cloruro di sodio	Sigma	S9625	Reagente PBS
Paraformaldeide	Sigma	P6148	Truccare in 2x PBS e conservare a -20 ° C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
Siero d'asino	Sigma	D9663
Siero di capra	Vector	S-1000
Reagente anti-sbiadimento Prolong Gold	Invitrogen	P36930	Reagente di montaggio
Isolectin GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	Utilizzare a Diluizione 1:200
Isolectina GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	Utilizzare a diluizione 1:200
Anticorpi primariAnti-NG2 (policlonale di coniglio)Millipore AB5320 Rileva i periciti Anti-GFAP (clone GA5, monoclonale di topo)Millipore MAB360 Rileva gli astrociti Anti-Desmin (clone Y66,
coniglio monoclonale)	Millipore	04-585	Rileva i periciti
Anti-Collagene IV (coniglio policlonale)	Chemicon	AB756P	Rileva la membrana basale vascolare
Anti-alfa muscolo liscio actin-Cy3 (clone 1A4, topo monoclonale)	Sigma	C6198	Rileva le cellule muscolari lisce vascolari.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, ratto monoclonale)	BD Pharmingen	550546	Rileva le cellule endoteliali
Anti-CD31 (clone MEC13.3, ratto monoclonale)	BD Pharmingen	553370	Rileva le cellule endoteliali
Anti-VE-Caderrina (clone 11D4.1, ratto monoclonale)	BD Pharmingen	550548	Rileva le giunzioni delle cellule endoteliali
Anti-Alk1 (capra policlonale)	R& D Systems	AF770	Rileva le cellule
Anticorpi secondari
Goat anti-rabbit-Alexa594	Invitrogen	A11012	Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 °C.
Capra anti-ratto-Alexa488	Invitrogen	A11006	Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 °C.
Capra anti-ratto-Alexa594	Invitrogen	A11007	Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 °C.
Capra anti-topo-Alexa488	Invitrogen	A11029	Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 °C.
Asino anti-capra-Alexa594	Invitrogen	A11058	Tutti gli anticorpi secondari vengono aliquotati immediatamente all'arrivo e conservati a -20 °C.
Microscopi
Microscopio da dissezione	Zeiss	Stemi SV6
Fotocamera	Zeiss	Axiocam HRc	Fotocamera per microscopio da dissezione
Microscopio epifluorescente	Zeiss	Axioimager con fotocamera Apotome
	Fotocamera Zeiss	Axiocam HRm	Axioimager
	Nikon	A1R

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