A due fasi procedura di perfusione con collagenasi modificata per l'isolamento di epatociti umani è descritta. Questo metodo può essere applicato anche ad altri fegati mammiferi. Gli epatociti isolati sono disponibili in alta resa e redditività, che li rende un modello adatto per la ricerca scientifica in settori quali la rigenerazione epatica, farmacocinetica e tossicologia.
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Articolo metodologico
L'isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Il fegato, un organo con una capacità di rigenerazione eccezionale, svolge un'ampia gamma di funzioni, quali la disintossicazione, il metabolismo e l'omeostasi. Come tale, gli epatociti sono un modello importante per una grande varietà di domande di ricerca. In particolare, l'uso di epatociti umani è particolarmente importante nel campo della farmacocinetica, tossicologia, rigenerazione epatica e ricerca traslazionale. Così, questo metodo presenta una versione modificata di una procedura in due fasi perfusione con collagenasi per isolare epatociti come descritto da Seglen 1.
In precedenza, gli epatociti sono stati isolati con metodi meccanici. Tuttavia, i metodi enzimatici hanno dimostrato di essere superiore come epatociti mantengono la loro integrità e la funzione strutturale dopo l'isolamento. Questo metodo qui presentato si adatta il metodo precedentemente progettata per fegati di ratto a pezzi di fegato umano ed i risultati in un grande rendimento di epatociti con agibilità di 77 ± 10%. Il principaledifferenza di questa procedura è il processo di cannulization dei vasi sanguigni. Inoltre, il metodo qui descritto può essere applicato anche ad fegati da altre specie con malattie epatiche o vaso sanguigno dimensioni comparabili.
Introduzione
Una sospensione di cellule di fegato può essere preparato dal fegato con metodi meccanici o enzimatici. Metodi meccanici utilizzati per preparare le cellule del fegato includono intere costringendo il fegato attraverso una garza 2, agitando un pezzo di fegato con perle di vetro in uno shaker Kahn 3, utilizzando omogeneizzatori vetro con pestelli sciolti 4,5 ecc Nel corso degli anni, metodi meccanici sono caduti fuori favorire causa dei danni alle membrane cellulari e la perdita della funzione degli epatociti isolati 6,7. Di conseguenza, l'uso di un metodo enzimatico è attualmente il metodo principale per l'....
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Protocollo
1. Preparazione di perfusione e di isolamento Solutions
- Preparare le soluzioni richieste per la perfusione del fegato pezzo e l'isolamento di epatociti secondo la Tabella 1. Le soluzioni possono essere conservati a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Filtro sterile tutte le soluzioni utilizzando un filtro di 0,22 micron.
- Tutte le soluzioni che vengono a contatto con il fegato devono essere sterili.
2. Preparazione di perfusione apparecchiature e soluzioni
- L'apparecchiatura per la perfusione del fegato pezzo deve essere montata come mostrato nella Figura 1. ....
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Risultati
Setup perfusione
Il materiale necessario per la perfusione epatica deve essere impostato secondo la figura 1.
La vitalità e rendimento di isolati epatociti umani
La redditività media di isolati epatociti umani è stata del 77 ± 10% e il rendimento medio degli epatociti era di 13 ± 11 milioni di epatociti / g di fegato, con i valori espressi come media ± deviazione standard. Il numero di isolamenti epatociti svolto per ottene.......
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Discussione
Questo protocollo comporta l'isolamento di epatociti umani con alta vitalità e purezza. Per conseguire questi risultati, è importante iniziare con un pezzo adatto di fegato. Il pezzo di fegato dovrebbe avere capsula integra di Glisson su tutte le superfici tranne per 1 superficie di taglio. Un altro fattore importante è la particolare lotto di collagenasi utilizzato, come gruppi differenti possono provocare notevoli differenze Viabilità di epatociti dopo digestione 11. Pertanto, diversi lotti di collagena.......
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Dichiarazioni
Ottimizzazione di questo protocollo è stato parzialmente finanziato da una sovvenzione Hepacult GmbH. Dr. Wolfgang Thasler è uno dei fondatori di Hepacult GmbH e rimane uno dei membri del consiglio di amministrazione di questa società. L'impiego di Maresa Demmel è parzialmente da Hepacult. Maria Hauner è impiegato da Hepacult GmbH. Hepacult è uno spin-off ditta biotecnologica presso l'Università, che offre epatociti umani con il consenso e aprire l'accesso a fini di ricerca.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato reso possibile dal tessuto e Cell Research Foundation umano, che rende i tessuti umani disponibili per la ricerca. Il sostegno finanziario per questo lavoro è stato ricevuto dal Ministero Federale dell'Educazione e della Ricerca (nome di sovvenzione: Virtual Network Fegato, numero di concessione: 0.315.759) e Hepacult GmbH. I nostri ringraziamenti vanno anche agli assistenti tecnici della Banca dei tessuti Grosshadern Hospital per la raccolta dei campioni di fegato e gli assistenti tecnici del isolamento delle cellule Nucleo Fondo per l'esecuzione della perfusione epatica e l'isolamento degli epatociti. In particolare, vorremmo ringr....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Trappola a bolle | Gaß ner Glastechnik | ||
| Condensatore con rivestimento in vetro | Gaß ner Glastechnik | ||
| 41 gradi C Bagnomaria | Julabo | 35723-H24/EG | |
| 37 gradi C Bagnomaria | GFL | 1083 | |
| Bombola di gas compresso (95 % O2/5 % CO2) | Linde | ||
| tubo permeabile ai gas | Neolab | 2-4440 | |
| Pompa peristaltica | Ismatec | IP65 | |
| Piuma di bisturi | 320010 | ||
| Pinze | Omnilab | 5171014 | |
| Fiaschi conici 1 L | Schott Duran | 2121654 | |
| Fiasche coniche 5 L | Schott Duran | 2121673 | |
| Bicchieri | Schott Duran | 2110654 | |
| Provette da centrifuga da 200 ml | Becton Dickinson | 352075 | |
| Piatto di cristallizzazione | Omnilab | 5144063 | |
| Cannule di irrigazione curve con punte sferiche | Ernst Kratz GmbH | 1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL | |
| Morsetti microvascolari | Ernst Kratz GmbH | ||
| Bü Imbuto chner | Carl Roth | HT38.1 | |
| Maglia di nylon 210 μ m | Neolab | 4-1413 | |
| Maglia di nylon 70 μ m | Neolab | 4-1419 | |
| 0,22 μ m filtri sterili | Peske | 99505 | |
| Bottiglie da 500 ml | Schott Duran | 2180144 | |
| Bottiglie da 1 L | Schott Duran | 2180154 | |
| Emocitometro | Peske | 06-0001 | |
| Tubi da 1,5 ml | Eppendorf | 0030 120,086 | |
| Tubi conici da 50 ml | BD Biosciences | 352070 | |
| Secchiello per il ghiaccio | Neolab | 1508454 | |
| Pipette sterili Pasteur | Marca | 747715 | |
| Riempitrice per pipette motorizzata (Pipette boy acu) | Integra | 155017 | |
| Centrifuga refrigerata | Eppendorf | 5810R | |
| Cassaforte a flusso laminare | Kendro | Hera-KS9 | |
| Aspiratore (Aspiratore chirurgico a bassa portata) | Atmos | C361 | |
| Bruciatore a Gas da Laboratorio | Integra | Fire Boy eco | |
| Camice da laboratorio monouso | Paperlynen GmbH | MD0202414 | |
| Mascherina chirurgica con visiera | Kimberly-Clark | 48247 | |
| cappuccio chirurgico | Barrier | 42072 | |
| Guanti in lattice | Semper Care | CE0321 | |
| Collagenasi (Numero di lotto NB 4G) | Serva | 17465 | |
| Cloruro di calcio diidrato | Merck | 2382 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Cloruro di sodio | Roth | 9265.2 | |
| Hepes | Roth | 9105.3 | |
| Cloruro di potassio | Serva | 26868 | |
| Albumina | Biomol | 01400-2 | |
| Glucosio | Serva | 22700 | |
| Carbonato acido di sodio | Serva | 30180 | |
| 0,4% soluzione di blu di tripano | Lonza | 17-942E | |
| Soluzione di conservazione a freddo | Hepacult GmbH |
Riferimenti
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem.
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 7/01/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
The changes listed below have been made to Table 1.
1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:
| EGTA | 0.1mM |
to:
| EGTA | 1mM |
2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:
| Calcium chloride dihydrate | 0.5µM |
to:
| Calcium chloride dihydrate | 5mM |
