L'isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

Sommario

A due fasi procedura di perfusione con collagenasi modificata per l'isolamento di epatociti umani è descritta. Questo metodo può essere applicato anche ad altri fegati mammiferi. Gli epatociti isolati sono disponibili in alta resa e redditività, che li rende un modello adatto per la ricerca scientifica in settori quali la rigenerazione epatica, farmacocinetica e tossicologia.

Abstract

Il fegato, un organo con una capacità di rigenerazione eccezionale, svolge un'ampia gamma di funzioni, quali la disintossicazione, il metabolismo e l'omeostasi. Come tale, gli epatociti sono un modello importante per una grande varietà di domande di ricerca. In particolare, l'uso di epatociti umani è particolarmente importante nel campo della farmacocinetica, tossicologia, rigenerazione epatica e ricerca traslazionale. Così, questo metodo presenta una versione modificata di una procedura in due fasi perfusione con collagenasi per isolare epatociti come descritto da Seglen ^1.

In precedenza, gli epatociti sono stati isolati con metodi meccanici. Tuttavia, i metodi enzimatici hanno dimostrato di essere superiore come epatociti mantengono la loro integrità e la funzione strutturale dopo l'isolamento. Questo metodo qui presentato si adatta il metodo precedentemente progettata per fegati di ratto a pezzi di fegato umano ed i risultati in un grande rendimento di epatociti con agibilità di 77 ± 10%. Il principaledifferenza di questa procedura è il processo di cannulization dei vasi sanguigni. Inoltre, il metodo qui descritto può essere applicato anche ad fegati da altre specie con malattie epatiche o vaso sanguigno dimensioni comparabili.

Introduzione

Una sospensione di cellule di fegato può essere preparato dal fegato con metodi meccanici o enzimatici. Metodi meccanici utilizzati per preparare le cellule del fegato includono intere costringendo il fegato attraverso una garza ^2, agitando un pezzo di fegato con perle di vetro in uno shaker Kahn ^3, utilizzando omogeneizzatori vetro con pestelli sciolti ^4,5 ecc Nel corso degli anni, metodi meccanici sono caduti fuori favorire causa dei danni alle membrane cellulari e la perdita della funzione degli epatociti isolati ^6,7. Di conseguenza, l'uso di un metodo enzimatico è attualmente il metodo principale per l'isolamento di epatociti.

Isolamento di epatociti utilizzando un metodo enzimatico è stata notevolmente migliorata quando Berry e Friend ⁸ perfusi collagenasi e ialuronidasi attraverso il fegato attraverso la vena porta nei ratti. Questo processo perfusione utilizzato il sistema vascolare per consentire gli enzimi di entrare in stretto contatto con la maggior parte delle cellule, portando adun aumento di 6 volte della resa degli epatociti ^8. Inoltre, questo metodo ha prodotto cellule che mantenevano la loro integrità strutturale, praticamente senza trasformazione del reticolo endoplasmatico in vescicole isolate e nessun danno mitocondriale ^8.

Questo metodo è stato modificato da Seglen ^1, che ha aperto una procedura di perfusione in due fasi per l'isolamento delle cellule epatiche. In questa procedura, il fegato di ratto è perfuso con un Ca ^{2 +} tampone privo seguita da perfusione con collagenasi un tampone contenente Ca ^{2 + 1.} La rimozione di Ca ^{2 +} nel primo passaggio consente di interrompere desmosomi, mentre è necessaria l'aggiunta di Ca ^{2 +} nel secondo passo per un'attività ottimale collagenasi ^1,9.

Dato che il lavoro pubblicato sopra descritto è stato eseguito su ratti, questo articolo si propone di dimostrare una procedura modificata che può essere utilizzato per l'isolamento di epatociti con alta vitalità da Humun fegati. L'uso di epatociti umani rimane importante per la ricerca traslazionale e per validare gli esperimenti su modelli animali. I pezzi di fegato umano utilizzati in questo studio sono stati acquisiti con il consenso della governance attraverso il tessuto umano e Cell Research Foundation, una controllata dallo Stato fondazione non-profit ^10. Dopo un patologo rimosso a quanto necessario per la diagnosi, pezzi di fegato sono stati raccolti dal tessuto rimanente. Il tessuto sezionato fuori dal patologo era morfologicamente il tessuto sano ottenuto da margini di resezione dopo resezione epatica.

Protocollo

1. Preparazione di perfusione e di isolamento Solutions

1. Preparare le soluzioni richieste per la perfusione del fegato pezzo e l'isolamento di epatociti secondo la Tabella 1. Le soluzioni possono essere conservati a 4 ° C fino all'utilizzo.
2. Filtro sterile tutte le soluzioni utilizzando un filtro di 0,22 micron.
3. Tutte le soluzioni che vengono a contatto con il fegato devono essere sterili.

2. Preparazione di perfusione apparecchiature e soluzioni

1. L'apparecchiatura per la perfusione del fegato pezzo deve essere montata come mostrato nella Figura 1.
2. Il bagno d'acqua dovrebbe essere impostato ad una temperatura appropriata, che è differente in ogni particolare set-up sperimentale, tale che le soluzioni sono alla temperatura di 37 ° C quando raggiungono il pezzo fegato. In questo caso, il bagno di acqua è impostata a 41 ° C per riscaldare le soluzioni 1, 2 e 3 e il condensatore in vetro con camicia. Soluzione 4 deve essere riscaldato fino a37 ° C in un bagno d'acqua separato da utilizzare per ridurre la perdita di attività collagenasi.
3. Poco prima di perfusione epatica, accendere il regolatore del serbatoio di gas contenente il 95% O _2/5% di CO ₂ a gas l'apparato di ossigenazione (Figura 1E).

3. Perfusione del fegato

1. Un pezzo di fegato con tanto capsula integra di Glisson possibile e idealmente con superficie di 1 solo taglio deve essere ottenuto da un patologo per la perfusione.
2. Posizionare questo pezzo fegato sulla imbuto Büchner contenente un filtro a disco forato (Figura 1B).
3. Il sistema di perfusione deve essere innescato con Soluzione 1.
4. Con una portata bassa, curvo cannule irrigazione con punte oliva deve essere inserito nei vasi sanguigni più grandi sulla superficie di taglio del pezzo fegato. Mentre il sangue vampate dal fegato, il tessuto diventa più chiaro in zone con buona perfusione. Il numero di cannule utilizzati per vari formatidi fegati è mostrato in Figura 2A. La dimensione relativa scelta dovrebbe tradursi in una perfetta aderenza che si terrà il cannule in posizione. I vasi sanguigni più piccoli devono essere lasciati aperti per il buffer di perfusione a fuoriuscire del pezzo fegato.
5. Aumentare la portata della pompa peristaltica a tra 110-460 ml / min a seconda delle dimensioni del fegato (Figura 2B). Ciò si traduce in una portata media di 44 ± 16 ml / min per cannula (Figura 2C). La velocità scelta dipende dal pezzo fegato e dovrebbe comportare una lieve plumping up del pezzo fegato. In alcuni casi, può essere necessario bloccare chiuse alcune delle navi aperte con pinze vascolari Micro per ottenere la leggera volumizzante cui sopra. Una buona perfusione può essere osservata quando il pezzo fegato è un colore più chiaro in tutto.
6. Tenere il pezzo di fegato umido durante la perfusione coprendolo con un pezzo di garza imbevuta di soluzione fisiologica.
7. Profumato con 1 L di soluzione di 1 a stanare ogni remaining sangue nel pezzo fegato.
8. Cambiare il liquido di perfusione alla Soluzione 2 e profumato per 10 min.
9. Passare il liquido di perfusione alla Soluzione 3 e profumato con 0,5 L.
10. Sostituzione del liquido di perfusione alla Soluzione 4, che contiene 0,1-0,15% di collagenasi (Tabella 2).
11. Per questo passaggio, perfusione deve essere effettuata in maniera ricircolo per 9-12 minuti o fino a che il fegato è sufficientemente digerito; tessuto epatico dovrebbe apparire a spezzarsi leggermente sotto la capsula di Glisson grafico ammorbidito quando provata con il lato smussato di un bisturi.

4. Isolamento degli epatociti

1. Spegnere la pompa peristaltica e rimuovere cannule dal pezzo di fegato.
2. Posizionare il pezzo di fegato in un piatto di cristallizzazione contenente 100-200 ml di soluzione 5.
3. Rimuovere la capsula di Glisson con attenzione e scuotere delicatamente le cellule. Se ci sono regioni che non sono ben perfusi, un bisturi può essere usato per tagliarequeste regioni per liberare le cellule contenute all'interno. Aggiungere più Soluzione 5 come necessario durante il processo.
4. Aggiungere più Soluzione 5 fino a raggiungere un volume finale di 500 ml.
5. Filtro sospensione cellulare due volte prima attraverso una maglia di 210 micron nylon seguita da una rete di nylon 70 micron. Successivamente, versare la sospensione di cellule in 200 ml provette da centrifuga.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 72 g per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante e pellet cellulare delicatamente risospendere delicatamente in 200 ml di soluzione 5.
7. Ripetere il numero fase di lavaggio 4.6 tre volte. Nella fase centrifuga finale, risospendere le cellule in soluzione di storage a freddo (vedi elenco dei materiali). Le cellule dovrebbero essere di circa 2,5 milioni di epatociti per millilitro per la valutazione del rendimento e della redditività con un saggio di esclusione trypan blu a base di emocitometro.
8. Per eseguire un saggio trypan blue exclusion, aggiungere 0,1 ml di cellule opportunamente diluiti (≈ 2,5 milioni / ml) in una provetta da microcentrifuga contenente 0,5 ml di soluzione molto trypan blu(0.4% blu tripano sciolto in tampone fosfato salino (PBS)) e 0,4 ml di PBS. Dopo aver miscelato accuratamente la sospensione cellulare, caricare un emocitometro con la sospensione ed esaminare al microscopio ad ingrandimento 100X. Sotto microscopio, le cellule morte saranno colorate blu, mentre le cellule vive appaiono senza macchia. Contare il numero di cellule vive e totale indicato in ciascuna 1 mm ² griglie marcati sul emocitometro. Redditività (%), resa di cellule vive (milioni di epatociti per soluzione di conservazione a freddo ml (CSS) o milioni di epatociti per g di fegato) può essere calcolato utilizzando le formule seguenti.

Nota: In questo caso, il fattore di diluizione trypan blu è 10 e il fattore emocitometro è 10.000.

Risultati

Setup perfusione

Il materiale necessario per la perfusione epatica deve essere impostato secondo la figura 1.

La vitalità e rendimento di isolati epatociti umani

La redditività media di isolati epatociti umani è stata del 77 ± 10% e il rendimento medio degli epatociti era di 13 ± 11 milioni di epatociti / g di fegato, con i valori espressi come media ± deviazione standard. Il numero di isolamenti epatociti svolto per ottene...

Discussione

Questo protocollo comporta l'isolamento di epatociti umani con alta vitalità e purezza. Per conseguire questi risultati, è importante iniziare con un pezzo adatto di fegato. Il pezzo di fegato dovrebbe avere capsula integra di Glisson su tutte le superfici tranne per 1 superficie di taglio. Un altro fattore importante è la particolare lotto di collagenasi utilizzato, come gruppi differenti possono provocare notevoli differenze Viabilità di epatociti dopo digestione ^11. Pertanto, diversi lotti di collagena...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Trappola a bolle	Gaß ner Glastechnik
Condensatore con rivestimento in vetro	Gaß ner Glastechnik
41 gradi C Bagnomaria	Julabo	35723-H24/EG
37 gradi C Bagnomaria	GFL	1083
Bombola di gas compresso (95 % O2/5 % CO2)	Linde
tubo permeabile ai gas	Neolab	2-4440
Pompa peristaltica	Ismatec	IP65
Piuma di bisturi		320010
Pinze	Omnilab	5171014
Fiaschi conici 1 L	Schott Duran	2121654
Fiasche coniche 5 L	Schott Duran	2121673
Bicchieri	Schott Duran	2110654
Provette da centrifuga da 200 ml	Becton Dickinson	352075
Piatto di cristallizzazione	Omnilab	5144063
Cannule di irrigazione curve con punte sferiche	Ernst Kratz GmbH	1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL
Morsetti microvascolari	Ernst Kratz GmbH
Bü Imbuto chner	Carl Roth	HT38.1
Maglia di nylon 210 μ m	Neolab	4-1413
Maglia di nylon 70 μ m	Neolab	4-1419
0,22 μ m filtri sterili	Peske	99505
Bottiglie da 500 ml	Schott Duran	2180144
Bottiglie da 1 L	Schott Duran	2180154
Emocitometro	Peske	06-0001
Tubi da 1,5 ml	Eppendorf	0030 120,086
Tubi conici da 50 ml	BD Biosciences	352070
Secchiello per il ghiaccio	Neolab	1508454
Pipette sterili Pasteur	Marca	747715
Riempitrice per pipette motorizzata (Pipette boy acu)	Integra	155017
Centrifuga refrigerata	Eppendorf	5810R
Cassaforte a flusso laminare	Kendro	Hera-KS9
Aspiratore (Aspiratore chirurgico a bassa portata)	Atmos	C361
Bruciatore a Gas da Laboratorio	Integra	Fire Boy eco
Camice da laboratorio monouso	Paperlynen GmbH	MD0202414
Mascherina chirurgica con visiera	Kimberly-Clark	48247
cappuccio chirurgico	Barrier	42072
Guanti in lattice	Semper Care	CE0321
Collagenasi (Numero di lotto NB 4G)	Serva	17465
Cloruro di calcio diidrato	Merck	2382
EGTA	Sigma	E4378
Cloruro di sodio	Roth	9265.2
Hepes	Roth	9105.3
Cloruro di potassio	Serva	26868
Albumina	Biomol	01400-2
Glucosio	Serva	22700
Carbonato acido di sodio	Serva	30180
0,4% soluzione di blu di tripano	Lonza	17-942E
Soluzione di conservazione a freddo	Hepacult GmbH