Noi descriviamo i metodi per l'efficiente e rapido isolamento / cultura della microglia praticabile dalla corteccia cerebrale neonatale e midollo spinale adulto. La dissezione e la placcatura di microglia corticale può essere realizzato entro 90 minuti, con la conseguente raccolta microglia in atto ~ 10 giorni dopo la dissezione iniziale.
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Articolo metodologico
Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Microglia sono i residenti i macrofagi del sistema nervoso centrale (SNC) e, come tali, hanno ruoli criticamente importanti in processi fisiologici e patologici quali CNS maturazione in sviluppo, sclerosi multipla, e lesioni del midollo spinale. Microglia può essere attivato e reclutato per azione da lesioni o la stimolazione neuronale, come il danno assonale visto in MS o di un trauma cerebrale ischemico derivanti da ictus. Questi membri immunocompetenti del SNC sono anche pensato di avere un ruolo nella plasticità sinaptica in condizioni non patologiche. Impieghiamo protocolli per coltura microglia dai tessuti neonatali e adulti che mirano a massimizzare il numero di cellule vitali minimizzando variabili confondenti, quali la presenza di altri tipi di cellule del SNC e coltura detriti cellulari. Utilizziamo grandi e facilmente individuabile componenti del sistema nervoso centrale (ad esempio corteccia, segmenti del midollo spinale), che rende l'intero processo fattibile e riproducibile. L'uso di cellula adultas è una valida alternativa all'uso di microglia cerebrale neonatale, come molte patologie indagate interessano principalmente l'postnatale midollo spinale. Questi sistemi di coltura sono anche utile per testare direttamente l'effetto di composti che possono sia inibire o promuovere attivazione della microglia. Dal attivazione della microglia può plasmare gli esiti delle malattie del sistema nervoso centrale adulto, vi è la necessità per i sistemi in vitro in cui microglia neonatale e adulta può essere coltivato e studiato.
Introduzione
Microglia sono le cellule immunitarie residenti del SNC, maggiormente somiglianti macrofagi periferici per struttura e funzione 1. E 'stato recentemente dimostrato che le cellule microgliali postnatali derivano da progenitori mieloidi primitivi e sono generati prima dell'ottavo giorno di embriogenesi, rovesciando il concetto precedente che postnatali progenitori emopoietici sono la fonte della microglia nel cervello adulto 2. Essi giocano un ruolo chiave in diverse malattie neurologiche e possono rispondere rapidamente alle infezioni o lesioni attraverso il rilascio di citochine pro-infiammatorie e anti-infiammatori 3. Così mi....
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Protocollo
1. Dissection (giorno 0)
- Indurre l'anestesia per p0-2 cuccioli di topo con ipotermia. Pulire le teste dei cuccioli con un Kimwipe imbevuto di etanolo al 70% per disinfettare il tessuto.
- Togliere le teste con un paio di forbici, con 4 cuccioli per 10 cm piastra di coltura. Mettere le teste in una capsula di Petri contenente tampone di ghiaccio-freddo Hank.
- Ancorare le testine utilizzando pinze curve attraverso le orbite e rimuovere con attenzione la pelle che ricopre il cranio con microforceps dritte.
- Togliere le ossa craniche con microforceps rette, prestando attenzione a non forare o danneggiare la corteccia. Il modo più ....
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Risultati
Un esempio di cellule microgliali riposo che attivate è mostrato in Figura 1. La microglia sono state visualizzate 24 ore dopo la placcatura (Figura 1a) e presentano ramificate (a riposo) morfologia. Esposizione al reagente adescamento, batteriche lipopolisaccaridi (LPS) provoca cambiamenti nella morfologia della microglia esempio le cellule diventano attivato (Figura 1b).
Un esempio di contare le cellule per la placcatura è mostrato i.......
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Discussione
Microglia modulare CNS normale funzionamento così come le risposte infiammatorie a diverse patologie. Funzionale rimodellamento sinaptico da microglia è stata implicata nel mantenimento dell'omeostasi normale del cervello 15. Durante la cascata neurogena partecipano alla liquidazione di cellule progenitrici neurali del giro dentato dell'ippocampo 4, 16. Pertanto, è necessario sviluppare un sistema di coltura in cui studiare microglia neonatale e adulto, che coprirà la vasta fascia di svilup.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare i membri del Tsirka laboratorio per i loro consigli e utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto da R01NS42168 a SET, 12PRE12060489 a RB, un NSF-3MT IGERT e un Turner Tesi borsa di studio a LT, e NSF-3MT IGERT a JCN.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaina, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Tripsina/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Piruvato di sodio | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Solfato | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm piatto di coltura tissutale | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lisina, 100 μ g/ml | Diluire 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
Riferimenti
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M.
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Ristampe e permessi
