In vivo metodo di imaging per distinguere infiammazione acuta e cronica

Sommario

Descriviamo un metodo di imaging non invasivo per distinguere le fasi infiammatorie. Consegna sistemica di luminol rivela le aree di infiammazione acuta che dipendono dalle attività MPO nei neutrofili. Al contrario, l'iniezione di lucigenina permette la visualizzazione di infiammazione cronica dipende attività Phox in macrofagi.

Abstract

L'infiammazione è un aspetto fondamentale di molte malattie umane. In questo rapporto il video, dimostriamo tecniche di imaging bioluminescenza non invasive che contraddistinguono l'infiammazione acuta e cronica in modelli murini. Con danni ai tessuti o invasione patogeno, neutrofili sono la prima linea di difesa, giocando un ruolo importante nel mediare la risposta infiammatoria acuta. Come la reazione infiammatoria progredisce, monociti circolanti gradualmente migrano nel sito di lesione e differenziarsi in macrofagi maturi, che mediano l'infiammazione cronica e promuovere la riparazione tissutale rimuovendo detriti tissutali e producendo citochine anti-infiammatorie. Iniezione intraperitoneale di luminol (5-ammino-2 ,3-diidro-1 ,4-phthalazinedione, sale di sodio) consente il rilevamento di infiammazione acuta largamente mediata da tessuto-infiltranti neutrofili. Luminol reagisce specificamente con il superossido generato all'interno delle fagosomi di neutrofili dal risultato bioluminescenza da una mieloperossidasi (MPO) reazione mediata. Lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrati) reagisce anche con superossido per generare bioluminescenza. Tuttavia, lucigenina bioluminescenza è indipendente MPO e si basa esclusivamente su fagociti NADPH ossidasi (Phox) nei macrofagi durante l'infiammazione cronica. Insieme, luminol e lucigenina consentono la visualizzazione non invasiva e la valutazione longitudinale di diverse popolazioni fagocita tutto fasi infiammatorie acute e croniche. Dato il ruolo importante di infiammazione in una varietà di malattie umane, crediamo che questo metodo di imaging non invasivo può aiutare ad indagare i ruoli differenziali di neutrofili e macrofagi in una varietà di condizioni patologiche.

Introduzione

Infiammazione è una risposta biologica altamente regolato coinvolti in una varietà di malattie umane, comprese infezione microbica ^1, guarigione delle ferite ^{2, 3} diabete, cancro ^{4, 5} cardiovascolari, neurodegenerative ^{6, 7} e malattie autoimmuni. Infiammazione dei tessuti richiede un buon coordinamento delle varie cellule immunitarie al fine di ottenere l'autorizzazione patogeno, la riparazione dei tessuti, e risoluzione malattia. Neutrofili e macrofagi sono importanti mediatori immunitari di infiammazione dei tessuti. Nella fase acuta di infiammazione, i neutrofili sono i primi soccorritori a diversi stimoli nocivi e d....

Protocollo

Nota: Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli istituzionali approvate e linee guida per la cura degli animali.

1. Reagenti e soluzioni

1. Soluzione PMA per sc inoculazione: Preparare una soluzione stock di phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a 5 mg / ml in DMSO. Conservare la soluzione di riserva a -20 ° C. Prima di inoculazione, scongelare la soluzione di riserva e portare a 1 mg / ml di PMA in PBS.
2. LPS soluzione per sc inoculazione: Sciogliere lipopolisaccaride (LPS da Salmonella enterica sierotipo Enteritidis) in PBS sterile a 1 mg / ml prima sc inoculazione.

Risultati

Abbiamo eseguito l'imaging bioluminescenza longitudinale per valutare l'infiammazione acuta e cronica in modelli sperimentali di infiammazione. Forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) è una proteina potente chinasi C (PKC) agonista che attiva Phox per la produzione di anione superossido e innesca risposte infiammatorie acute intense ^21. SC iniezione di 50 mg di PMA in NCR topi nudi ha causato una rapida irritazione e infiammazione acuta in siti di iniezione ^{18, 22, 23.} Abbiamo eseguito l'.......

Discussione

In questo rapporto, si dimostra un metodo bioluminescenza per l'imaging non invasivo di infiammazione negli animali viventi. Uso di due substrati luminescenti, luminol e lucigenina, il metodo può distinguere diverse fasi di infiammazione. Bioluminescenza luminol è associato neutrofili nella fase acuta dell'infiammazione, mentre lucigenina bioluminescenza è mediata dai macrofagi nella fase cronica. Relativamente piccolo (PM = 177.16 g / mol) e senza carica elettricamente, luminol può facilmente penetrare sia nel .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	P8139
Lipopolisaccaride da Salmonella enterica sierotipo enteritidis	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	L2012
Luminol (5-ammino-2,3-diidro-1,4-ftalazindione, sale sodico)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	A4685
Lucigenina (nitrato di bis-N-metilacridinio)	Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO	M8010
Sistema di imaging IVIS Spectrum con pacchetto software Living Imaging 4.2	Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA