Multiplex fluorescente Microarray per salivare umana Protein Analysis Utilizzando polimerici Microsfere e fasci di fibre ottiche

Shuai Nie; Elena Benito-Peña; Huaibin Zhang; Yue Wu; David R. Walt

doi:10.3791/50726

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Articolo metodologico

Multiplex fluorescente Microarray per salivare umana Protein Analysis Utilizzando polimerici Microsfere e fasci di fibre ottiche

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DOI:

10.3791/50726

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10 ottobre 2013

Shuai Nie¹ , Elena Benito-Peña¹^,² , Huaibin Zhang¹ , Yue Wu³ , David R. Walt¹

¹Department of Chemistry, Tufts University, ²Department of Analytical Chemistry, Complutense University (Spain), ³Department of Electrical and Computer Engineering, Tufts University

In questo articolo

Sommario

Descriviamo una procedura per la profilatura proteine salivari utilizzo di matrici di anticorpi a base di microsfere-multiplex. Gli anticorpi monoclonali sono stati legati covalentemente a colorante fluorescente con codifica 4.5 micron microsfere polimeriche utilizzando la chimica carbodiimmide. Le microsfere modificati sono stati depositati in pozzetti in fibra ottica per misurare i livelli di proteine nella saliva mediante saggi immunologici panino fluorescenza.

Abstract

Qui, si descrive un protocollo per misurare simultaneamente sei proteine nella saliva utilizzando una matrice anticorpo basato microsfere fibra ottica. La tecnologia immuno-array impiegato unisce i vantaggi di base microsfere sospensione matrice fabbricazione con l'uso della microscopia a fluorescenza. Come descritto nel protocollo video, disponibili in commercio microsfere polimeriche 4,5 micron sono stati codificati in sette tipi diversi, differenziati per la concentrazione di due coloranti fluorescenti fisicamente intrappolati all'interno delle microsfere. Le microsfere codificati contenenti gruppi carbossilici superficiali sono stati modificati con anticorpi monoclonali di cattura attraverso EDC / NHS chimica di accoppiamento. Per assemblare il microarray di proteine, i diversi tipi di microsfere codificati e funzionalizzati sono stati mescolati e depositati in modo casuale in 4,5 micron pozzetti, che sono state incise chimicamente in corrispondenza dell'estremità prossimale di un fascio di fibre ottiche. Il fascio di fibre ottiche è stato utilizzato sia come vettore per l'imaging e la microspheres. Una volta assemblato, il microarray è stata utilizzata per catturare proteine nel supernatante saliva raccolti dalla clinica. Il rilevamento è basata su un immunodosaggio a sandwich utilizzando una miscela di anticorpi biotinilati rilevamento per diversi analiti con una sonda fluorescente streptavidina coniugata, R-ficoeritrina. Il microarray è stato ripreso al microscopio a fluorescenza in tre diversi canali, due per la registrazione microsfere e uno per il segnale di test. Le micrografie fluorescenza sono stati poi decodificati e analizzati utilizzando un algoritmo in casa in MATLAB.

Introduzione

Dal primo microarray riportato da Mark Schena e colleghi nella metà degli anni 1990, questo potente strumento è stato utilizzato in molti campi della ricerca biologica ^1. Microarray anticorpo in grado di rilevare simultaneamente molteplici proteine nei fluidi diagnostici, come il sangue, hanno importanti applicazioni in diagnostica clinica e biomarker di screening ^2-10. Saliva, che contiene molti degli stessi analiti come sangue, è stato considerato come un'alternativa preferibile al sangue poiché la raccolta saliva è sicuro, non invasivo, e può essere effettuata da minimamente addestrato personale medico ^11-13. Attualmente, l&#....