Multiplex fluorescente Microarray per salivare umana Protein Analysis Utilizzando polimerici Microsfere e fasci di fibre ottiche

Summary

Descriviamo una procedura per la profilatura proteine ​​salivari utilizzo di matrici di anticorpi a base di microsfere-multiplex. Gli anticorpi monoclonali sono stati legati covalentemente a colorante fluorescente con codifica 4.5 micron microsfere polimeriche utilizzando la chimica carbodiimmide. Le microsfere modificati sono stati depositati in pozzetti in fibra ottica per misurare i livelli di proteine ​​nella saliva mediante saggi immunologici panino fluorescenza.

Abstract

Qui, si descrive un protocollo per misurare simultaneamente sei proteine ​​nella saliva utilizzando una matrice anticorpo basato microsfere fibra ottica. La tecnologia immuno-array impiegato unisce i vantaggi di base microsfere sospensione matrice fabbricazione con l'uso della microscopia a fluorescenza. Come descritto nel protocollo video, disponibili in commercio microsfere polimeriche 4,5 micron sono stati codificati in sette tipi diversi, differenziati per la concentrazione di due coloranti fluorescenti fisicamente intrappolati all'interno delle microsfere. Le microsfere codificati contenenti gruppi carbossilici superficiali sono stati modificati con anticorpi monoclonali di cattura attraverso EDC / NHS chimica di accoppiamento. Per assemblare il microarray di proteine, i diversi tipi di microsfere codificati e funzionalizzati sono stati mescolati e depositati in modo casuale in 4,5 micron pozzetti, che sono state incise chimicamente in corrispondenza dell'estremità prossimale di un fascio di fibre ottiche. Il fascio di fibre ottiche è stato utilizzato sia come vettore per l'imaging e la microspheres. Una volta assemblato, il microarray è stata utilizzata per catturare proteine ​​nel supernatante saliva raccolti dalla clinica. Il rilevamento è basata su un immunodosaggio a sandwich utilizzando una miscela di anticorpi biotinilati rilevamento per diversi analiti con una sonda fluorescente streptavidina coniugata, R-ficoeritrina. Il microarray è stato ripreso al microscopio a fluorescenza in tre diversi canali, due per la registrazione microsfere e uno per il segnale di test. Le micrografie fluorescenza sono stati poi decodificati e analizzati utilizzando un algoritmo in casa in MATLAB.

Introduction

Dal primo microarray riportato da Mark Schena e colleghi nella metà degli anni 1990, questo potente strumento è stato utilizzato in molti campi della ricerca biologica ^1. Microarray anticorpo in grado di rilevare simultaneamente molteplici proteine ​​nei fluidi diagnostici, come il sangue, hanno importanti applicazioni in diagnostica clinica e biomarker di screening ^2-10. Saliva, che contiene molti degli stessi analiti come sangue, è stato considerato come un'alternativa preferibile al sangue poiché la raccolta saliva è sicuro, non invasivo, e può essere effettuata da minimamente addestrato personale medico ^11-13. Attualmente, l'analisi delle proteine ​​multiplex utilizzando campioni di saliva è limitata da diversi fattori importanti, tra cui la bassa concentrazione di analita bersaglio ¹⁴ e l'ampia gamma di concentrazione di diversi biomarker ^15.

.

Qui, dimostriamo l'analisi di sei proteine: fattore di crescita vascolare endoteliale umana (VEGF), proteina interferone gamma-indotta 10 (IP-10), interleuchina-8 (IL-8), fattore di crescita epidermico (EGF), metallopeptidasi matrice 9 (MMP-9), interleuchina-1 beta (IL-1β) . Le prestazioni del metodo è stata inizialmente verificata utilizzando soluzioni standard costituendo proteine ​​ricombinanti analiti e tampone di bloccaggio. Campioni di saliva reali raccolti dai pazienti di diverse malattie respiratorie croniche nonché controlli sani sono stati anche testati con prestazioni soddisfacenti. Il protocollo dovrebbe essere applicabile ad altri analiti proteici e altri saggi a base di microsfere. Questa piattaforma offre notevoli vantaggi nel campo Analytical Chemistry quanto consente rapido, preciso e riproducibile analisi simultanea di basse concentrazioni di diverse proteine ​​con un'ampia gamma dinamica, minime interazioni non specifiche, consumi campione ridotto e basso costo rispetto ad un analogo immunoenzimatici Assay (ELISA).

Protocol

Figura 1. . Flusso di lavoro per l'applicazione matrice anticorpo microsfere fibra ottica alla saliva profiling (1) Microsfere sono codificati internamente con due coloranti fluorescenti, (2) le microsfere sono codificati esternamente modificate con anticorpi monoclonali specifici per proteine, (3) le microsfere multiplati sono mescolati, e (4) depositati in modo casuale in micropozzetti incise in corrispondenza dell'estremità prossimale di un fascio di fibre ottiche; (5) proteine ​​salivari sono catturati da microsfere mediante immunodosaggio a sandwich, e (6) quantificati tramite microscopia a fluorescenza.

1. Microsfere Codifica

1. Pesare europio sodio (III) thenoyltrifluoroacetonate triidrato (Eu-TTA, PM = 869,54 g / mol) in un flaconcino di vetro ambrato e preparare una soluzione stock di 200 mm in tetraidrofurano (THF). Mescolare delicatamente pipettando; verificare visivamenteil colorante è completamente sciolto.
2. Pesare cumarina 30 (C30, PM = 347,41 g / mol) in un flaconcino di vetro ambrato e preparare una soluzione madre di 12 mm in THF. Mescolare delicatamente pipettando, verificare visivamente il colorante è completamente sciolto.
3. Preparare 700 ml di soluzione di lavoro per ogni tipo di microsfere utilizzando le soluzioni madre e THF e raggiungere la concentrazione finale elencati nella Tabella 1.
4. Garantire microsfere (10% w / v) sono ben sospesi con vortex, e quindi trasferire 60 microlitri di sospensione in una provetta da 1,5 ml.
5. Aggiungere 600 microlitri di PBS alla sospensione microsfere e mescolare pipettando 20x. Centrifugare la provetta a 10.000 rpm per 3 minuti e rimuovere con cura il supernatante. Ripetere questo processo un altro 2x per lavare le microsfere.
6. Lavare il pellet microsfere 3x con THF utilizzando una procedura simile a passo 1.5.
7. Centrifugare la sospensione di microsfere / THF a 10.000 rpm per 3 minuti, rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 600 microlitriSoluzione di lavoro elencati nella tabella 1. Trasferire il composto in una nuova provetta 1,5 ml.
8. Sigillare la provetta con Parafilm e metterlo su un agitatore. Agitare a 3.000 rpm ed incubare per 24 ore, proteggere dalla luce coprendo la configurazione utilizzando un box coperto con un foglio di alluminio.
9. Centrifugare la sospensione di microsfere a 10.000 rpm per 3 minuti per formare un pellet.
10. Rimuovere il surnatante colorante, lavare le microsfere 6x con 600 microlitri metanolo e poi con 600 microlitri di PBS contenente 0,01% Tween-20 un'altra 6x, come descritto al punto 1.5.
11. Conservare le microsfere codificati in 600 microlitri di PBS contenente 0,01% Tween-20 a 4 ° C fino al momento dell'uso, proteggere dalla luce.

Nome del tipo di microsfere:	1	2	3	4	5	6	7
Eu-TTA (mm)	100	100	10	100	10
C30 (mm)		1	1	6	6	1	6

Tabella 1. Le concentrazioni di Eu-TTA e C30 soluzioni di lavoro.

2. Preparazione di microsfere di proteine ​​di cattura

1. Prepara il MES tampone [2 - (N-morfolino) Acido etansolfonico (MES) 0.1 M, NaCl 0,9%, SDS 0,01%, pH 5.7] e PBS / SDS (sodio fosfato 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS 0,01%, pH 7.4) in anticipo a temperatura ambiente.
2. Aggiungere 200 microlitri di sospensione di microsfere codificato (contenente microsfere ~ 2 mg) in una Safe-Lock da 1,5 ml provetta. È importante utilizzare questo tipo di provetta per evitare perdite durante l'incubazione nel passaggio 2.6.
3. Lavare le microsfere con 600 microlitri tampone MES 3x come descritto al punto 1.5. Aggiungere 700 microlitri MES al pellet microsfere e mescolare bene pipettando.
4. Preparare 0,105 g / ml 1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimide cloridrato (EDC, PM = 191,7 g / mol) e 0,163 g / ml solfo-N-Idrossisulfosuccinimide (solfo-NHS, PM = 217,13 g / mol) soluzioni tampone MES in tubi separati.
5. Aggiungere 150 ml preparati al momento EDC soluzione goccia a goccia nella sospensione di microsfere. L'EDC idrolizza molto rapidamente, quindi è indispensabile utilizzare una soluzione appena fatto per garantire l'efficienza immobilizzazione. Subito dopo l'aggiunta della CED, aggiungere 150 microlitri soluzione solfo-NHS alle microsfere, mescolare bene pipettando e verificare la sospensione è omogenea.
6. Chiudere la provetta, sigillarlo con Parafilm, e metterlo su un agitatore. Agitare a 1.500 rpm per 4 ore, proteggere dalla luce utilizzando una casella coperta con un foglio di alluminio.
7. Centrifugare le microsfere suspensione a 10.000 rpm per 3 minuti per formare un pellet e rimuovere il surnatante. Lavare le microsfere con 500 microlitri di PBS / SDS 3x tampone come descritto nel punto 1.5.
8. Aggiungere 200 microlitri tampone PBS / SDS al pellet, mescolare bene le microsfere e trasferire la soluzione a 300 ml PBS / SDS contenente 60 mcg anticorpi di cattura. E 'importante sospendere il pellet microsfere e poi aggiungere la sospensione di microsfere nella soluzione di anticorpi.
9. Incubare la miscela di anticorpi-microsfere agitando a 1.500 rpm per 4 ore su un agitatore, proteggere dalla luce utilizzando una casella coperta con un foglio di alluminio.
10. Centrifugare la sospensione di microsfere a 10.000 rpm per 3 minuti per formare un pellet e rimuovere il surnatante. Lavare le microsfere con 500 microlitri StartingBlock (TBS) bloccando 3x tampone, come descritto al punto 1.5.
11. Mescolare microsfere di 1 ml di TBS blocco del buffer e incubare microsfere a 1.500 rpm per 1 ora su un agitatore, proteggere dalla luce usando una caletta boxrosso con un foglio di alluminio.
12. Centrifugare la sospensione di microsfere a 7.000 rpm per 3 minuti per formare un pellet e rimuovere il surnatante. Lavare il 3x pellet con 500 microlitri TBS tampone di bloccaggio, come descritto al punto 1.5.
13. Centrifugare microsfere a 7.000 rpm per 3 minuti per formare un pellet e rimuovere il surnatante. Aggiungere 500 microlitri TBS tampone bloccante e mescolare pipettaggio.
14. Conservare la sospensione di microsfere modificato a 4 ° C fino al momento dell'uso, proteggere dalla luce.
15. Ripetere questa procedura per fare altri tipi di microsfere utilizzando anticorpi corrispondenti.

3. Fibra ottica Microarray Assemblea

1. Mescolare 50 ml di ogni tipo di microsfere di proteine ​​di cattura in una nuova provetta autoclave. Centrifugare le microsfere di archivi piscina a 7.000 rpm per 3 minuti e rimuovere il surnatante in modo che il volume rimanente è di circa 100 ml.
2. Tagliate a mano fasci di fibre ottiche a circa 5 cm di lunghezza esequenzialmente lucidare entrambe le estremità su una macchina di lucidatura utilizzando 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5 e 0,05 micron diamante dimensioni lappatura film. Sonicare il fascio lucido in acqua deionizzata per 2 minuti per rimuovere eventuali particelle.
3. Mettere una piccola barretta magnetica in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga, aggiungere 400 ml di PBS privo di proteine ​​tampone e agitare su un piatto agitazione magnetica per 30 minuti per eliminare le bolle d'aria.
4. Etch una estremità del fascio di fibre lucidato in una soluzione 0,025 N HCl per 150 sec ^10,16. Immergere Immediatamente e sonicare fine inciso in acqua deionizzata per 1 min. Asciugare i fasci di fibre con aria compressa.
5. Montare il fascio di fibre su un supporto in fibra e bloccare l'estremità inciso in, privo di proteine ​​PBS senza bolle per 1 ora.
6. Cassetta 1 microlitri aliquota della sospensione microsfere memorizzato sull'estremità incisa del fascio di fibre ottiche. Proteggere il setup dalla luce con una scatola con un foglio di alluminio, e attendere 15 min. Il volume della sospensionediminuisce per evaporazione e costringere le microsfere nei pozzetti incisi. Ripetere questa fase di carico ancora una volta.
7. Usare un tampone imbevuto di soluzione campione per rimuovere microsfere che non sono intrappolati nei pozzetti. Il microarray di proteine ​​è ora pronto per l'uso. Andare subito al punto 4.1 per l'analisi della saliva.

4. Analisi Saliva Esempio di utilizzo di microsfere Microarray

1. Aggiungere 200 microlitri soluzione campione (100 microlitri surnatante saliva diluita con un volume uguale di StartingBlock T20 (PBS) tampone di bloccaggio. Il protocollo di raccolta per saliva supernatante è stato pubblicato in precedenza ^10). in 0,5 ml autoclavato provetta. Immergere il microarray proteina caricata sulla fibra nella soluzione e incubare l'agitatore a 600 rpm per 2 ore, al riparo dalla luce utilizzando una casella coperto con un foglio di alluminio.
2. Preparare 20 ml di tampone di lavaggio aggiungendo 200 microlitri soluzione BSA 10% e 200 ml 10% Tween-20 in 19,6 ml di PBS, mix bene da scuotendo delicatamente.
3. Immergere il microarray di proteine ​​in una nuova provetta autoclavato contenente 200 microlitri di tampone di lavaggio e agitare a 600 rpm per 2 min. Ripetere questo lavaggio 3x.
4. Incubare il microarray in soluzione 100 ml di un cocktail anticorpo contenente 5 mg / ml di anti-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, anticorpi biotinilati rilevazione IL-1β in StartingBlock T20 (PBS) tampone di bloccaggio per 30 minuti a temperatura ambiente su shaker a 600 rpm camera, proteggere dalla luce utilizzando una casella coperto con un foglio di alluminio.
5. Lavare 3x microarray con tampone di lavaggio come descritto al punto 4.3.
6. Incubare il microarray in 200 ml di mcg / ml streptavidina R-ficoeritrina coniugato (SAPE) soluzione 20 in PBS a 600 rpm l'agitatore per 10 min, proteggere dalla luce utilizzando una casella coperto con un foglio di alluminio.
7. Lavare il 5x microarray con tampone di lavaggio come descritto al punto 4.3.
8. Pulire l'estremità distale della fibra (cioè, l'estremità di distanzadalle microsfere) combinare con un tampone imbevuto di etanolo assoluto.
9. Asciugare entrambe le estremità della fibra con aria compressa. Montare la fibra su un microscopio epifluorescente e immagine attraverso l'estremità distale della fibra.
10. Acquisire le immagini microsfere corrispondenti a Eu-TTA, C30, e SAPE intensità di emissione di fluorescenza. Impostazione filtri ottici e tempi di esposizione per imaging di fluorescenza di Eu-TTA, C30, e SAPE sono rappresentati nella tabella 2.

Canale	Eu-TTA	C30	SAPE
Exciter	365/10x	350/50x	546/10x
Beamsplitter	525DCLP	400DCLP	560LP
Emettitore	620/60m	460/50m	580/30m
Tempo di esposizione	1 sec	0,3 sec	1 sec

Tabella 2. Parametri per le tre immagini fluorescenti del microarray.

Results

Immagini di fluorescenza da tre canali che mostrano una piccola sezione del fascio di fibre ottiche sono mostrati nelle figure 2A-C. Queste immagini sono stati analizzati utilizzando un algoritmo scritto in MATLAB (come descritto in maggior dettaglio nella sezione Discussione). L'analisi impiega sia informazioni dall'immagine codifica Eu-TTA (Figura 2A) e l'immagine di codifica C30 (Figura 2B) per decodificare le microsfere, e sono state calcolate le intensità di fluore...

Discussion

I ricercatori dovrebbero prestare particolare attenzione alle seguenti passi: per una migliore precisione di decodifica, è necessario verificare le microsfere sono omogeneamente sospesi in tutta incubazione e lavare passaggi durante la procedura di codifica microsfere. Inoltre, le microsfere codificati devono essere protetti dalla luce durante l'intero esperimento. Dopo le procedure di codifica e di conservazione appropriate, abbiamo scoperto che la precisione complessiva decodifica era al di sopra del 99%. Le micro...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Colorante Eu-TTA	Fisher Scientific	AC42319-0010
THF	Sigma-Aldrich	34865-100ML
Fiala di vetro ambrato	Fisher Scientific	03-339-23B
Cumarina 30 colorante	Sigma-Aldrich	546127-100MG
Microsfere	Bangslabs	PC05N/6698
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
PBS 10x concentrato	Sigma-Aldrich	P5493-1L
Acqua	Sigma-Aldrich	W4502-1L
Metanolo	Sigma-Aldrich	34860-100ML
Tw-20	Sigma-Aldrich	P7949-100 ml
BupH MES soluzione salina tamponata	Thermo Scientific	28390
SDS	Sigma-Aldrich	05030-500ML-F
Soluzione NaOH	Fisher Scientific	SS256-500
Provetta per microcentrifuga con blocco sicuro	VWR labshop	53511-997
EDC	Thermo Scientific	22980
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510
Anticorpo di cattura VEGF umano	R& D Systems	MAB293
Anticorpo di cattura IP-10 umano	R& D Systems	MAB266
Anticorpo umano di cattura IL-8	R& D Systems	MAB208
R& R	& D Systems	MAB636
R & R	& D Systems	MAB936
IL-1β cattura l'anticorpo	R& D Systems	MAB601
Anticorpo di controllo dell'isotipo IgG1 di topo	R& D Systems	MAB002
Tampone StartingBlock (TBS)	Thermo Scientific	37542
Soluzione standard HCl 1,0 N	Sigma-Aldrich	318949-500 ml Provette
microcentrifuga da 0,5 ml	Fisher Scientific	05-408-120
Tampone privo di proteine (PBS)	Thermo Scientific	37572
VEGF umano ricombinante 165	R& D Systems	293-VE
R & 10 umano ricombinante	D Systems	266-IP
IL-8 umano ricombinante	R& D Systems	208-IL
EGF umano ricombinante	R& D Systems	236-EG
MMP-9 umano ricombinante	R& D Systems	911-MP
IL-1 umana ricombinanteβ	R& D Systems	201-LB
StartingBlock T20 (PBS) tampone	Thermo Scientific	37539
Blocker BSA in PBS	Thermo Scientific	37525
Anticorpo di rilevamento VEGF biotinilato	R& D Systems	BAF293
Anticorpo di rilevamento IP-10 biotinilato	R& D Systems	BAF266
Anticorpo di rilevamento IL-8 biotinilato	R& D Systems	BAF208
Anticorpo per la rilevazione di EGF biotinilato	R& D Systems	BAF236
Anticorpo di rilevamento MMP-9 biotinilato	R& D Systems	BAF911
Biotinilato IL-1β anticorpo di rilevamento	R& D Systems	BAF201
Streptavidina, R-ficoeritrina	Invitrogen	S-21388
Etanolo (200 proof)	Sigma-Aldrich	E7023-500ML