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Abbiamo presentato un protocollo di cinque giorni per la preparazione di un Escherichia coli endogeno basato sistema di espressione acellulare TX-TL. Una cronologia esempio per la creazione dei reagenti - estratto di cellule greggio e tampone - può essere trovato in Figura 1. Una volta creati, questi possono essere conservati a -80 ° C per un massimo di un anno. Dopo i reagenti sono creati, setup sperimentale e l'esecuzione può essere fatto in meno di 8 ore.
Inoltre, abbiamo ottimizzato le condizioni di espressione del sistema di espressione acellulare TX-TL. Altre aggiunte forniti dall'utente, come tamponi o soluzioni di DNA, devono essere calibrati per la tossicità anticipo. Ad esempio, diversi metodi di elaborazione dei risultati plasmidi di espressione differente dovuto contenuto di sale. Abbiamo anche testato l'effetto di tampone di eluizione Tris-Cl sull'efficienza reazione (Figura 5).
Un esempio di calibrazione grezzo estratto cellulare, riferendosi passo 4,1-4,9, è mostratoin figura 4a. In generale, i nostri esperimenti mostrano che l'estratto cellulare grezzo è più sensibile ai livelli di Mg-glutammato, seguiti da livelli di K-glutammato. Per dimostrare il sistema di libera espressione di cellule, abbiamo costruito e testato un ciclo di feedback negativo in base a tet repressione. 26 (Figura 6). Nel sistema di espressione cell-free, la stessa corsa circuito con e senza ATC mostra un end-point cambiamento di espressione di 7 volte di deGFP giornalista dopo otto ore di espressione. Anche se questo esperimento non richiede induttori globali o repressori, se necessario, possono essere aggiunti in "Mix Preparazione Maestro".
Figura 1. Timeline di estratto di cellule greggio, soluzione di aminoacidi, e la preparazione soluzione energetica. Timelin A cinque giorni e per l'esecuzione tipica del protocollo è dato sopra, ottimizzato per incubazioni overnight e fasi di lavoro durante il giorno.
Figura 2. Costi e analisi di espressione di competere estratti cellulari greggio. a) Ripartizione dei costi di manodopera e dei materiali del sistema di libera espressione di cellule TX-TL. Sulla base dei costi dei reagenti come di Dicembre 2012, e il costo del lavoro di $ 14 all'ora. B) Confronto dei costi di sistema libera espressione di cellule TX-TL vs altri sistemi commerciali. I costi sono ripartiti per ml, anche se i volumi di reazione possono variare per kit. C) Confronto tra TX-TL cell-free sistema di espressione del rendimento rispetto ad altri sistemi commerciali. Resa espressione proteica determinata dalle norme produttore./ 50762fig2large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 3. Caricamento e lavorazione di un tubo tallone-pestaggio. a) Dimostrazione della corretta viscosità della soluzione di cellule-tallone. Soluzione Cell-tallone avrà una viscosità dipende da molti fattori, tra cui quantità di tampone S30A aggiunto, la quantità di perline aggiunti, e il tempo trascorso sul ghiaccio. B) Caricamento di tubo tallone battendo prima breve centrifugazione tavolo. La centrifugazione rimuove le bolle accumulate durante il caricamento. C) Bolle emersione dopo tavolo centrifugazione. La dimensione delle bolle varia, possono essere spuntato o rimosso utilizzando un puntale d) completamente riempito tubo tallone battere prima di tappatura.. Un menisco si forma nel tallone battendo tube, e il tappo ha abbastanza per coprire e causare piccole quantità per riempire troppo. e) apparecchio filtrante correttamente caricato. Questi possono essere riutilizzati. F) Confronto correttamente vs tubo tallone battere correttamente elaborato. Il tubo sulla sinistra è un tubo ben-beat - è dotato di un piccolo e ben delineato strato superiore, e molto chiaro surnatante. Il tubo a destra è ottimale, in base al formato grande, secondo strato nebuloso e il surnatante nebuloso. Tubi che sono subottimale non dovrebbero essere sottoposti a ulteriori elaborazioni.
Figura 4. Proprietà di preparati estratto grezzo. a) curva di taratura tipici per estratto cellulare grezzo. Estratto grezzo è calibrato per ulteriori Mg-glutammato, K-glutammato, e livelli DTT, in questo ordine. Viene mostrato endpoint fluorescence dopo 8 ore, così come velocità massima di produzione di proteine sulla base di una media mobile a 12 minuti. Sulla base di queste trame, un intervallo accettabile di ulteriori Mg-glutammato è di 4 mm, K-glutammato è 60-80 mm, DTT è 0-3 mm. Si noti che ogni estratto grezzo deve essere calibrato in modo indipendente per queste tre variabili. B) Variazione dalle preparazioni estratto. È mostrato Endpoint fluorescenza di due estratti grezzi preparati in date diverse, le barre di errore sono 1 deviazione standard da tre piste indipendenti in giorni diversi. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 5. Effetti della soluzione di DNA sull'efficienza espressione. a) Confronto tra due diversi depurazionemodalità di trattamento dei plasmidi. 1 nM di pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 viene preparata utilizzando solo un kit QIAprep Spin Miniprep (metodo di purificazione 1) o post-elaborata con un kit di purificazione QIAquick PCR (metodo di purificazione 2). Puo 'endpoint fluorescenza dopo 8 ore, così come velocità massima di produzione di proteine sulla base di una media mobile a 12 minuti. Le barre di errore sono 1 deviazione standard da quattro piste indipendenti in giorni diversi. B) Effetto del tampone di eluizione (Tris-Cl). Diverse concentrazioni di Tris-Cl sono confrontati in una reazione espressione cell-free base all'espressione di 1 nM di pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Le concentrazioni indicate sono concentrazioni finali di Tris-Cl nella reazione; tampone di eluizione utilizzato è 10 mM Tris-Cl. Le barre di errore sono 1 deviazione standard da tre piste indipendenti in giorni diversi. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 6. Esempio di run TX-TL di un ciclo di feedback negativo. a) la configurazione di esempio di una reazione esecuzione cell-free. Prove "a" "off" stato del ciclo di feedback negativo rispetto, con controlli positivi e negativi.
B) plasmide mappa di feedback negativo.
C) I risultati rappresentativi. Dati riflette esperimento in a) e b), con controllo negativo sottratto dal segnale. Circuito genetico mostrato in insert. Le barre di errore sono 1 deviazione standard da tre piste indipendenti in giorni diversi.
Clicca qui per ingrandire la figura .
| Nome | Concentrazione | Importo | Sterilizzazione | Note |
| Cloramfenicolo (Cm) | 34 mg / ml in etanolo | 1 ml | Filtro sterilizzare (0,22 micron) | Può essere fatto in grandi volumi conservati a -20 ° C per un uso successivo. |
| 2xYT + P + piastra Cm agar | 31 g / L 2xYT, 40 mM potassio fosfato bibasico, 22 mM fosfato di potassio monobasico, 34 mg / ml di cloramfenicolo | 1 piastra | Autoclave | |
| 2xYT + P supporti | 31 g / L 2xYT, 40 mM potassio fosfato bibasico, 22 mM fosfato di potassio monobasico | 4 L | Autoclave | |
Tabella 1. Reagenti per giorno 1 del protocollo estratto cellulare grezzo.
| Nome | Concentrazione | Importo | Sterilizzazione | Note |
| Tris base | 2 M | 250 ml | Sterilizzare Filter (0,22 micron) o in autoclave | Può essere conservato a temperatura ambiente. |
| DTT | 1 M | 6 ml | Filtro sterilizzare (0,22 micron) | Può essere fatto in grandi volumi e conservati a -20 ° C per un uso successivo. |
| Tampone S30A | 14 mM Mg-glutammato, 60 mM K-glutammato, 50 mM Tris, pH 7.7 | 2 L | Autoclave | Per raggiungere pH 7.7, titolare con acido acetico. Aggiungi DTT a 2 mm di concentramento finale appena prima dell'uso. Conservare a 4 ° C. |
| Tampone S30B | 14 mM Mg-glutammato, 60 mm K-glutammato, ~ Tris 5 mM, pH 8,2 | 2 L | Autoclave | Per raggiungere pH 8,2, titolare con 2MTris. Aggiungi DTT a 1 mM concentrazione finale appena prima dell'uso. Conservare a 4 ° C. |
Tabella 2. Reagenti per il giorno 2 del protocollo estratto cellulare grezzo.
| Falco |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| Vuoto 50 ml Falcon (g) | | | | |
| 50 ml Falcon con pellet (g) | | | | |
| Massa Pellet (50 ml Falcon con pellet - vuoto 50 ml Falcon) (g) | | | | |
| S30A volume di tampone di aggiungere (massa pellet * 0,9) (ml) | | | |
| Massa totale di perline per aggiungere (massa pellet * 5.0) (g) | | | | |
Tabella 3. Tampone S30A e calcolatrice massa tallone, per il giorno 3 del protocollo estratto cellulare grezzo.
| Nome | Concentrazione | Importo | Sterilizzazione | Note |
| HEPES | 2 M, pH 8 | 4 ml | Nessuno | Per raggiungere pH 8, titolare con KOH. |
| Nucleotide Mix | , 94 mM CTP 156 mM ATP e GTP e UTP, pH 7.5 | 1,5 ml | Nessuno | Per raggiungere pH 7.5, titolare con KOH. |
| tRNA | 50 mg / ml | 600 microlitri | Nessuno | |
| CoA | 65 mm | 600 microlitri | Nessuno | |
| NAD | 175 mM, pH 7,5-8 | 300 ml | Nessuno | Per raggiungere pH 7.5-8, titolare con Tris a 2 M. |
| cAMP | 650 mM, pH 8 | 200 ml | Nessuno | Per raggiungere pH 8, titolare con Tris a 2 M. |
| Acido folinico | 33.9 mM | 300 ml | Nessuno | Anche se sono necessari solo 300 ml, ricetta supplementare è di 1.15 ml. |
| Spermidina | 1 M | 150 microlitri | Nessuno | Conservare a 4 ° C, calore a 37 ° C per fondere. |
| 3-PGA | 1.4 M, pH 7.5 | 3.2 ml | Nessuno | Per raggiungere pH 7.5, titolare con Tris a 2 M. |
Tabella 4. Reagenti per prepararsi per il protocollo Energy Solution.
Supplemental Materiale 1. Ricette per Articoli.
Cloramfenicolo, 34 mg / ml: Preparare 0,51 g cloramfenicolo e aggiungere etanolo a 15 ml. Sterilizzare Filter (0,22 micron), aliquota da 1 ml tubi, conservare a -20 ° C per un uso successivo.
2xYT + P + piastra Cm agar: Preparare 1,24 g 2xYT, 1,6 ml di soluzione di potassio fosfato bibasico @ 1 M, 0,88 ml di potassio fosfato monobasico @ 1 M, 0,6 g di agar, e l'acqua a 40 ml. Autoclave. Lasciate raffreddare a 50 ° C e aggiungere 40 microlitri Cm. Aliquota 25 ml in una piastra di Petri di 100 x 15 mm, e lasciate raffreddare per un'ora.
2xYT + P supporti: Preparare 124 g 2xYT, 160 ml di fosfato di potassio dibasico @ 1 M, soluzione di 88 ml di potassio fosfato monobasico @ 1 M, e acqua per 4 L. Aliquot fuori in 2 x 1,88 L e 0,24 L. Autoclave.
Tris base, 2 M: Preparare 60,57 g di base Tris e acqua a 250 ml. Sterilizzare, conservare a temperatura ambiente per un uso successivo.
DTT, 1 M: Preparare 2.31 g DTT e acqua a 15 ml. Sterilizzare Filter (0,22 micron), aliquota da 1 ml tubi, conservare a -20 ° C per un uso successivo.
Tampone S30A: Preparare 10.88 g Mg-glutammato e 24,39 g K-glutammato, 50 ml Tris a 2M, acido acetico (a pH 7,7), e acqua per 2 L. Autoclave, conservare a 4 ° C, aggiungere 4 ml di 1 M DTT prima dell'uso.
Tampone S30B: Preparare 10.88 g Mg-glutammato e 24,39 g K-glutammato, Tris a 2 M (pH 8.2), e acqua per 2 L. Autoclave, conservare a 4 ° C, aggiungere 2 ml di 1 M DTT prima dell'uso.
HEPES: Preparare 1.91 g HEPES (MW 238,21), KOH (a pH 8), e acqua a 4 ml.
tRNA: Preparare 30 mg di tRNA e acqua a 600 ml.
CoA: Preparare 30 mg di CoA (MW 767,53) e l'acqua a 600 ml.
NAD: Aggiungere 34.83 mg di NAD (MW 663,43), Tris a 2 M (a pH 7,5-8), e acqua a 300 ml. (Aggiungere 27 ml di Tris a 2 M per portare la soluzione a pH 7,5-8).
cAMP: Aggiungere 42.80 mg di cAMP (MW 329,22), Tris a 2 M (a pH 8), e acqua di 200 microlitri. (Aggiungere 73 ml di Tris a 2 M per portare la soluzione a pH 8).
Acido folinico (33,9 mm): A 20 mg di solido sale di calcio di acido folico (511,5 MW), aggiungere 1,15 ml di acqua.
Spermidina: Preparare 23.55 ml di spermidina (MW 145,25) e acqua a 150 ml. Preparare a temperatura ambiente dopo la fusione brevemente a 37 ° C.
3-PGA: Aggiungere 1,03 g di 3-PGA (MW 230,02), Tris a 2 M (pH 7,5), e acqua a 3,2 ml. (Aggiungere 1,73 ml di Tris a 2 M per portare la soluzione a pH 7,5).
Nucleotide Mix: Aggiungere 145 mg di ATP dipotassio diidrato sale (619,4 MW), 133 mg di GTP sale disodico (MW 567,14), 79,4 mg di CTP diidrato sale disodico (MW 563,16), 82,6 mg di diidrato UTP sale trisodico (MW 586,12) , KOH al 15% di diluizione (a pH 7,5), e acqua a 1,5 ml. (Aggiungere 353 ml di KOH al 15% diluizione per portare la soluzione a pH 7,5).
Supplemental materiale 2. Bradford Assay.
- Rimuovere agente Bradford da 4 ° C e impostare a temperatura ambiente.
- Preparare 50 ml BSA standard a 1 mg / ml ed a 0.1 mg / ml.
- Preparare 40 ml 20x diluizione dell'estratto dal punto 1.47.
- Aggiungere 800 microlitri di acqua a 7 cuvette.
- Preparare cuvette standard per la 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 ml 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 ml 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 microlitri 1 mg / ml BSA) , 6 mg / ml (6 ml 1 mg / ml BSA).
- Preparare cuvette sperimentali per 2 ml di campione e 4 ml di campione.
- Aggiungere 200 ml di agente Bradford ad ogni provetta e mescolare bene by pipettaggio. Incubare a temperatura ambiente per almeno 10 min.
- Produrre curva standard a OD 595 nm utilizzando cuvette dal punto 6.5. Rifiuta curva standard se r 2 <0,95.
- Determinare la concentrazione di estratto di OD a 595 nm utilizzando cuvette dal punto 6.6.
Materiale supplementare 3. Buffer foglio di calibrazione.
Vedere TXTL_e (template) _calibration_JoVE.xlsx .
Materiale supplementare 4. Libera espressione-Cell eseguito foglio di calcolo.
Vedere TXTL _JoVE.xlsx .