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Articolo metodologico

In vitro per valutare l'impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione

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DOI:

10.3791/50821

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15 ottobre 2013

 ,  ,  ,  , 
1The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM)

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Abbiamo sviluppato un test in vitro per studiare il ruolo delle vie immunomodulanti nella regolazione della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4.

Abstract

Esaurimento delle cellule T è un fattore importante nella riuscita di liquidazione patogeno durante le infezioni virali croniche. Percorsi immunomodulanti, come PD-1 e IL-10, sono upregulated su questa esposizione all'antigene corso e contribuiscono alla perdita della proliferazione, riduzione della funzione citolitica e compromessa produzione di citochine da parte di cellule T CD4 e CD8. Nel modello murino di infezione LCMV, somministrazione di bloccare anticorpi contro queste due vie aumentata risposte delle cellule T. Tuttavia, attualmente non vi è prova in vitro per misurare l'impatto di tale blocco sulla secrezione di citochine in cellule da campioni umani. Il nostro protocollo e approccio sperimentale ci consentono di quantificare con precisione e in modo efficiente il ripristino della produzione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 da soggetti infetti da HIV.

Qui, ci raffiguriamo un disegno sperimentale in vitro che consente misurazioni della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 e il loro impatto su altri celsottoinsiemi l. Cellule T CD8 erano esaurite dal sangue intero e che restano PBMC sono state isolate tramite metodo di separazione Ficoll. PBMC CD8-impoverito sono state poi incubate con anticorpi bloccanti contro PD-L1 e / o IL-10Rα e, dopo stimolazione con HIV-1 piscina Gag peptide, le cellule sono state incubate a 37 ° C, 5% CO 2. Dopo 48 ore, il surnatante è stato raccolto per l'analisi di citochine da perline array e pellet cellulari sono stati raccolti sia per l'analisi fenotipica mediante citometria a flusso o l'analisi trascrizionale mediante qRT-PCR. Per un'analisi più dettagliata, diverse popolazioni cellulari sono stati ottenuti selettiva sottoinsieme esaurimento da PBMC o di classificare mediante citometria a flusso, prima di essere valutato negli stessi dosaggi. Questi metodi forniscono un approccio altamente sensibile e specifico per determinare la modulazione della produzione di citochine da parte di cellule T-helper antigene-specifiche e determinare interazioni funzionali tra diverse popolazioni di cellule immunitarie.

Introduzione

Durante le infezioni virali persistenti, specifiche cellule-T virus acquisiscono difetti funzionali in un processo noto come l'esaurimento delle cellule T. All'inizio studi in vivo nel modello murino LCMV di infezione virale cronica indicato che le cellule T virus-specifici esauste una riduzione della funzione citolitica contro cellule infettate da virus, perdono la loro capacità di proliferare e una capacità ridotta di produrre citochine come IL-2, TNF- α e IFN-γ 1,2. Complessa rete di percorsi immunomodulanti, come PD-1 e IL-10, sono upregulated durante le infezioni croniche e contribuire alla disfunzione delle cellule T (recensito in 3,4). Nella somministrazione in vivo di bloccare anticorpi contro queste vie inibitorie nel topo LCMV modello di funzione delle cellule T virus-specifici esaurite e la clearance virale maggiore restaurato, indicando che l'esaurimento delle cellule T è un fenomeno parzialmente reversibile (recensito in 5).

Giudizio su °e modello LCMV sono stati rapidamente estesa a infezioni virali croniche umani quali HBV, HCV e HIV 5. In cronica da HIV-1, PD-1 e IL-10 percorsi sono upregulated in soggetti infetti e correlano con parametri di progressione della malattia, direttamente con la carica virale e inversamente con la conta CD4 6-8. Anticorpo blocco dei PD-1 o IL-10 percorsi in vitro restaurato proliferazione di HIV-specifiche cellule T CD4 e CD8 indicano che, simile al modello di topo LCMV, esaurimento delle cellule T nell'uomo è un fenomeno parzialmente reversibile. Tuttavia, a causa della natura delicata di esperimenti su campioni umani nonché limitazioni nella sensibilità dei saggi in vitro, un'indagine approfondita dei profili ripristino funzionale ottenuti da questi interventi è sorprendentemente assente. Saggi di proliferazione sono stati, finora, l'unico test affidabile in vitro testato in maggior parte degli studi, ma vi è una notevole mancanza di prove sull'impatto di questi, tra l'interventi su: 1) la capacità di uccisione delle cellule T citotossiche, 2) l'effetto antivirale di cellule T sulla replicazione virale, 3) il profilo secrezione di citochine, e 4) l'effetto su aiuto delle cellule T CD4 su altri sottogruppi di cellule.

Intracellulare di citochine colorazione (ICS) è un flusso molto utile e ampiamente utilizzati saggio basato citometria che viene utilizzato per rilevare la produzione di citochine in vari tipi di cellule, sia nei topi e nell'uomo. E 'stato anche utilizzato per studiare l'effetto di anticorpi blocco di vie inibitorie. In saggi ICS, secrezione di citochine è bloccata con l'aggiunta di brefeldina e / o Monensina. Le citochine intrappolati all'interno delle cellule sono poi rilevate con anticorpi fluorescenti con citometria a flusso policromo. La durata del test è solitamente limitato a 6 o 12 ore dopo la stimolazione antigene poiché sia ​​brefeldina e monensina, che sono tipicamente aggiunti in 2 ore di antigene indicato, sono tossici per le cellule. Il saggio ICS è una potente tecnica che è stata i utilen l'indagine l'effetto della somministrazione in vivo di bloccare intervento anticorpo nei topi in cui le cellule sono state estratte dopo un certo periodo di tempo dopo l'esposizione anticorpo 9. Tuttavia, vi sono diverse limitazioni per l'applicazione di questo approccio sperimentale per valutare l'impatto del blocco dei recettori inibitori in campioni umani. Durante l'esecuzione di interventi di anticorpi vie inibitorie in un hr stimolazione 6 o 12 in vitro (tipicamente il caso con campioni umani), il blocco dei recettori inibitori in molti casi non modifica la frequenza di rispondere cellule T antigene-specifiche come misurata mediante saggi circuiti integrati standard 6, 7. Le misurazioni della produzione di citochine per cella misurati mediante media o la mediana intensità di fluorescenza hanno dato risultati inconsistenti 6, 7, 10. D'altra parte, quando ICS viene eseguita in un punto temporale in ritardo dopo la stimolazione (ovvero sei giorni), le variazioni del numero di citochina-secernente cells possono essere osservati. Le differenze sono un effetto combinato della proliferazione alterata, sopravvivenza, e cambiamenti nella funzione effettrice che si accumulano durante il periodo di tempo specificato 6. Un modo per superare in parte questi limiti è quello di incubare per lunghi periodi di tempo (ad esempio 36 hr, 60 hr, ecc.) Con l'antigene prima l'aggiunta del bloccante secrezione di citochine senza attendere la proliferazione si verifichi. Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per determinare la cinetica di secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 e CD8 11,12, tuttavia, questo approccio non è in grado di rilevare piccole risposte e non dia un risultato integrata della secrezione di citochine totale verificano poiché la stimolazione. Pertanto, ICS non è un metodo abbastanza sensibile per rilevare l'impatto del blocco di vie inibitorie sulla quantità di citochine prodotte dalle cellule T attivate rispetto a mRNA quantitativa o misure di secrezione di citochine nel supernatant agli stessi punti temporali. Inoltre, la maggior parte delle citochine prodotte dalle cellule T attivate agire in maniera autocrina contribuendo al feedback positivo o negativo passanti attraverso l'interazione con le cellule presentanti l'antigene. Pertanto, l'aggiunta di brefeldina o Monensina durante il saggio ICS impedisce la secrezione di citochine e quindi la stimolazione delle cellule T non è ottimale. Infine, il rilevamento di citochine multiple con ICS è limitata dalla disponibilità e sensibilità di anticorpi per il rilevamento di citochine mediante citometria a flusso, nonché da vincoli nel numero di fluorocromi che possono essere utilizzati contemporaneamente in un dato pannello.

Abbiamo sviluppato un approccio altamente sensibile in vitro sperimentale per valutare l'impatto delle vie immunomodulanti nella regolazione della secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 e successivamente CD4 contribuiscono a cellule presentanti l'antigene (APC) e le cellule natural killer (cellule NK). Questo metodo può anche essere utilizzato per valutare l'impact del blocco di molecole inibitori sulla funzione delle cellule T CD8 mediante deplezione delle cellule T CD4 da PBMC o stimolando con peptidi ottimali che vengono riconosciuti solo dalle cellule T CD8. In contrasto intracellulari saggi citochina colorazione, abbiamo deciso di non interferire con la secrezione di citochine da HIV-specifiche cellule T CD4 per essere in grado di: 1) effettuare una quantificazione più accurata dei livelli di citochine prodotte; 2) indagare un pannello più ampio di citochine o molecole effettrici e 3) valutare l'impatto delle citochine prodotte da HIV-specifiche cellule T CD4 su altri sottoinsiemi di cellule. Stimoliamo CD8 PBMC impoverito a HIV-1 Gag piscina peptide in presenza di anticorpi bloccanti per la via immunoregolatorio di interesse. Dopo il tempo desiderato di incubazione, di solito 48 ore, raccogliamo il surnatante per misurare la secrezione di citochine con array di perline e raccogliere i pellet cellulari sia per l'analisi fenotipica delle diverse sottopopolazioni cellulari o per l'analisi trascrizionale. Da segnalare, al tempo til suo 48 punto di tempo hr, noi non rileva una significativa popolazione di cellule proliferanti T 12. Questo è un approccio flessibile e diversi adattamenti di questo motivo può essere applicato per affrontare diverse ipotesi. Per esempio, i singoli sottogruppi di cellule (come HIV-specifiche cellule T CD4 o PD-1 le cellule T CD4 elevati, ecc.) Possono essere scelti dopo 12 ore di incubazione prima ulteriore incubazione per 36 ore seguita da collezione di supernatanti e pellet cellulari indagare più specificamente l'impatto degli interventi del blocco sulla secrezione di citochine da sottopopolazioni definite di PBMC.

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Protocollo

1. Impoverimento e isolamento delle PBMC mediante Ficoll Separazione

  1. Deplezione delle cellule T CD8 +, aggiungendo umano CD8 + Depletion Cocktail a 50 microlitri / ml di sangue intero.
  2. Mescolare bene e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (18-25 ° C).
  3. Dopo l'incubazione, mescolare sangue intero con HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank senza Ca 2 + o Mg 2 +) e strato sopra Histopaque. Spin a 340 rcf per 30 minuti (senza freni, accelerazione lenta).
  4. Raccogliere PBMC e trasferire in un nuovo conico 50ml. Lavare 2x con 45 ml RPMI 1640 supplementato con 50 UI di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 1% HEPES facendo girare per 10 min a 340 rcf.

2. Anticorpo Blockade e stimolazione antigene-specifica delle cellule

  1. Risospendere le cellule a 2x10 6 per condizione in RPMI 1640 contenente il 10% di siero umano supplementato con 50 UI di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 1% HEPES,pari a 500 microlitri per ogni condizione.
  2. Aliquota 500 microlitri di sospensione cellulare per provetta FACS.
  3. A seconda del percorso studiato, aggiungere PD-L1, IL-10Rα anticorpi bloccanti e / o controlli isotipo a 10 pg / ml e incubare per 15 min a 37 ° C, 5% CO 2.
  4. Stimolare le cellule con una piscina peptide HIV-1 Gag ad una concentrazione finale di 1 mg / ml / peptide. Includono anche un controllo "nessuno stimolo" per ogni condizione di blocco. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 48 ore.

3. Raccolta e analisi del surnatante

  1. Dopo 48 ore, centrifugare tubi FACS per 7 minuti a 340 rcf.
  2. Raccogliere accuratamente 2 x 225 microlitri surnatante in provette Eppendorf per gli array di perline Luminex senza disturbare il pellet.
  3. Inattivare virus nel supernatante raccolto con 25 microlitri 0,5% Tween-PBS per ottenere una concentrazione finale di 0,05% PBS-Tween.
  4. Il negozio di raccolta surnatanti che non sono immediately utilizzato in un -80 ° C freezer.
  5. Misurare le concentrazioni di citochine desiderati utilizzando il kit di Millipore Luminex secondo il protocollo del produttore.

4. Raccolta e analisi fenotipica delle cellule tramite Citometria a Flusso

  1. Dopo aver raccolto il surnatante, lavare le cellule in 3 ml di PBS. Spin le cellule per 7 minuti a 340 rcf e decantare lavaggio in eccesso.
  2. Stain per la redditività con un LIVE / DEAD fissabile Morto Kit Stain cellulare secondo il protocollo del produttore.
  3. Lavare le cellule in PBS per 7 minuti a 340 rcf e a 4 ° C. Risospendere in 100 microlitri di PBS 1% FBS.
  4. Se la colorazione per i monociti o altre cellule presentanti l'antigene, i recettori Fc blocco con l'aggiunta di 1,4 ml di FcR blocco reagenti e vortex per miscelare.
  5. Incubare per 10 minuti a 4 ° C.
  6. Aggiungere anticorpi di superficie, vortex e incubare per 20 min a 4 ° C al buio.
  7. Lavare le cellule con PBS 1% FBS, decantare lavaggio in eccesso, e aggiungere 200 microlitri paraformaldeide al 4%. Covarea temperatura ambiente per 20 minuti al buio.
  8. Lavare le cellule con PBS 1% FBS, risospendere in 250 microlitri di PBS 1% FBS, e di acquisire una multilaser citofluorimetro (es. BD LSRII o Fortessa).

5. Analisi delle celle tramite qRT-PCR

  1. Per le cellule non analizzato mediante citometria a flusso: dopo la raccolta surnatante, Lisare le cellule in 300 microlitri Qiagen Buffer RLT contenente 1% di beta-mercaptoetanolo. Se non continuando con protocollo, le cellule possono essere congelati a -80 ° C dopo questo punto.
  2. Isolare l'RNA utilizzando un kit di isolamento di RNA seguendo il protocollo del produttore.
  3. Sintetizzare cDNA da RNA utilizzando un kit di sintesi di cDNA seguendo il protocollo del produttore.
  4. Eseguire la PCR quantitativa utilizzando la tecnologia SYBR Green.
  5. Creare una miscela di innesco per ciascun primer utilizzati compresi geni housekeeping (ad esempio IL-13, IL-10, IFN-γ, GAPDH) aggiungendo primer per priva di nucleasi acqua per ottenere una concentrazione finale di 10pM. Tenere su ghiaccio.
  6. Creare un master mix per ogni primer con l'aggiunta di 10,5 microlitri di acqua priva di nucleasi, 12,5 microlitri SYBR green, e 1 microlitri miscela di primer per piastra bene. Tenere su ghiaccio.
  7. Pipettare 24 microlitri master mix in ogni pozzetto della piastra che verrà utilizzato.
  8. Aggiungere 1 ml di cDNA a ciascun pozzetto secondo il modello.
  9. Cap pozzi e piatto di centrifuga per 3 minuti a 800 rcf.
  10. Eseguire piastra su una macchina qRT-PCR, ad esempio, uno strumento Stratagene Mx3005P.

6. Adattamento per intracellulare di citochine colorazione a 48 ore

Aggiungi brefeldina e Monensin 6 ore prima intracellulare di citochine colorazione. Brefeldina viene aggiunto ad una concentrazione di 10 ug / ml mentre Monensina viene aggiunto secondo le istruzioni del produttore. Per comodità, brefeldina può essere aggiunto 12 hr prima di macchiare ad una concentrazione di 5 mg / ml.

  1. Dopo macchia di superficie, lavare le cellule con PBS 1% FBS e macchia nelextracellulare citochine come IL-12, IFN-γ e TNF-α utilizzando un kit di fissaggio / Permeabilization soluzioni e protocollo.
  2. Lavare le cellule, risospendere in 250 microlitri di PBS 1% FBS, ed eseguito su un multilaser citofluorimetro (es. BD LSR II o Fortessa).

7. Adattamento per ordinamento celle

  1. 16 ore dopo la stimolazione, macchia per la vitalità usando LIVE / DEAD fissabile Morto Kit Stain cellulare secondo il protocollo del produttore. Mantenere le cellule in ghiaccio durante tutta la procedura.
  2. Lavare le cellule con PBS per 7 minuti a 340 rcf e a 4 ° C. Risospendere in 100 microlitri di PBS 1% FBS.
  3. Aggiungi anticorpi di superficie, vortex per miscelare e incubare cellule sul ghiaccio al buio per 20 min.
  4. Lavare le cellule con PBS 1% FBS a 340 rcf e a 4 ° C e risospendere in 500 ml RPMI freddo 1640 contenente il 10% di siero fetale bovino supplementato con 50 UI di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 1% HEPES.
  5. Celle filtranti con 5 ml di polistirolorene tubo a fondo rotondo con tappo Cell-Strainer.
  6. Preparare le provette di raccolta per l'ordinamento con l'aggiunta di 200 ml RPMI 1640 contenente il 10% siero fetale bovino integrata con 50 UI di penicillina, 50 mg / ml di streptomicina, 2 mM L-glutammina e 1% HEPES a ciascun tubo. Tenere tutte le provette in ghiaccio durante ordinamento.
  7. In diretta ordinare i sottoinsiemi di cellule di interesse su uno strumento (ad es BD FACS Aria II) che si trova in una struttura attrezzata per materiale a rischio biologico.
  8. Dopo celle sono state filtrate, posto celle torna in incubatrice per quantità desiderata di tempo e di seguire con l'analisi collezione surnatante / Luminex e analisi collezione pellet di cellule / PCR.

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Risultati

Per effettuare le misurazioni di citochine tramite questo sistema in vitro, è essenziale essere in grado di distinguere le risposte antigene-specifiche rispetto al controllo senza stimolazione. In generale, abbiamo preso in considerazione le risposte positive da tutti i valori della stimolazione antigenica che danno almeno tre volte aumento dei livelli di citochine rispetto al controllo nessuno stimolo e che erano all'interno della gamma lineare del test. Stiamo usando ad alta sensibilità saggi di matrice tallo...

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Discussione

Collezione surnatante è una parte fondamentale di questo progetto sperimentale. Durante la raccolta surnatanti per il dosaggio Luminex, sono state fatte aliquote e conservati a -80 ° C per evitare la degradazione della proteina causa gelo-disgelo. Congelamento e scongelamento può essere processi dure per le proteine, e riducendo al minimo freeze-disgelo, il segnale sarà massimizzata in saggi. Pertanto, è più facile ottenere dati ripetibile e preciso quando si lavora da aliquote che sono stati scongelati freeze-lo stesso...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

Ringraziamo Gordon Freeman per fornire l'anticorpo blocco anti-PD-L1. Ringraziamo il personale clinico e di laboratorio presso il Massachusetts General Hospital e tutti i partecipanti di studio per il loro prezioso ruolo in questo progetto.

Questo studio è stato sostenuto dal National Institute of Allergy e Malattie Infettive dei National Institutes of Health (PO1 AI-080192; DEK), il National Heart Lung and Blood Institute dei National Institutes of Health (RO1 HL-092565; DEK). DEK è supportato da un Research Scholar Premio alla Carriera della Salute Research Fund Quebec (FRQS). FP è supportata da una sovvenzione borsa di studio del General Hospital Comitato Esecutivo del Massachusetts per la ricerca e la Harvard Global Institute Salute (HGHI).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione salina bilanciata di Hanks senza Ca2+ o Mg2+SigmaH9394
RPMI 1640SigmaR0883
Histopaque-1077Sigma10771
Siero umano ABGemini BioProducts100-512
Penicillina/StreptomicinaMediatech30 001 CI
L-glutamminaMediatech25 005 CI
HEPES tamponeMediatech25060CI
Reagente bloccante FcR, umanoMiltenyi130-059-901
RosetteSep Umano CD8+ Depletion Cocktail Stem Cell15663
LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte riparabile, per eccitazione UVInvitrogenL23105
Rneasy Mini KitQiagen74104
Sistema di trascrizione inversa Improm-IIPromegaA3800
Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master MixAgilent600830
BD Kit di soluzioni per fissazione/permeabilizzazione Cytofix/CytopermBD554714
Tween-20FisherBP337100
IFN-γ primerInvitrogenFOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA
GAPDH primerInvitrogenFOR: TCATCTCTGCCCCCTCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG

Riferimenti

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