Legame covalente di BMP-2 su superfici utilizzando un auto-assemblato Monolayer Approccio

Summary

Noi descriviamo un metodo per realizzare immobilizzazione efficiente di BMP-2 sulle superfici. Il nostro approccio si basa sulla formazione di un monostrato auto-assemblato per realizzare il legame di BMP-2 attraverso i suoi residui amminici liberi covalente. Questo metodo è un utile strumento per studiare la segnalazione alla membrana cellulare.

Abstract

Proteina morfogenetica 2 (BMP-2) è un fattore di crescita incorporato nella matrice extracellulare del tessuto osseo. BMP-2 funge da innesco della differenziazione delle cellule mesenchimali in osteoblasti, stimolando così la guarigione e la formazione ossea novo de. L'uso clinico di ricombinante umano BMP-2 (rhBMP-2) in combinazione con ponteggi ha sollevato controversie recenti, in base alla modalità di presentazione e l'importo da erogare. Il protocollo qui presentato fornisce un modo semplice ed efficace per fornire BMP-2 per studi in vitro su cellule. Si descrive come formare un monostrato auto-assemblato composto da un linker eterobifunzionale, e mostriamo la successiva fase vincolante per ottenere l'immobilizzazione covalente di rhBMP-2. Con questo approccio è possibile ottenere una presentazione sostenuta di BMP-2, pur mantenendo l'attività biologica della proteina. Infatti, l'immobilizzazione superficie di BMP-2 consente indagini mirate impedendo annunci aspecificheorption, riducendo la quantità di fattore di crescita e, in particolare, ostacolando rilascio incontrollato dalla superficie. Entrambi gli eventi di segnalazione a breve e lungo termine, innescato da BMP-2 si svolgono quando le cellule sono esposte a superfici che presentano covalentemente immobilizzato rhBMP-2, rendendo questo approccio adatto per studi in vitro sulle risposte cellulari ai BMP-2 stimolazione.

Introduction

Proteina morfogenetica ossea 2 (BMP-2) è un membro del fattore di crescita trasformante (TGF-β) famiglia e agisce come induttore del de novo formazione ossea e regolatore di diversi tessuti durante lo sviluppo embrionale e adulta omeostasi ^1-3. Ogni monomero del omodimerica BMP-2 proteina biologicamente attiva contiene un motivo "cisteina nodo", che è altamente conservata in tutti BMP ^4. Sei dei sette residui di cisteina formano legami disolfuro intramolecolari che stabilizzano ciascun monomero, mentre la settima cisteina è coinvolto nella dimerizzazione, formando un legame intermolecolare tra i due monomeri ^5,6. Questo nodo di cisteina altamente conservati definisce la struttura tridimensionale della proteina BMP-2 e determina le proprietà uniche, come la resistenza al calore, denaturanti e acido pH ^7-9. BMP-2 si lega a serina / treonina chinasi recettori transmembrana, inducendo così la trasduzione del segnale ^{10-12. A seconda della modalità di oligomerizzazione recettoriale, diverse vie di segnalazione vengono attivati: una cascata di segnalazione Smad-indipendente conduce ad induzione fosfatasi alcalina tramite segnalazione p38, mentre un percorso Smad-dipendente attivata risultati fosforilazione recettoriale in Smad traslocazione nucleare complesso e l'attivazione della trascrizione dei specifici geni bersaglio, come l'inibitore di differenziazione (Id) 12-14.}

In osso, BMP-2 induce la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali in osteoblasti, stimolando così la guarigione e de novo formazione di osso. Attualmente, ricombinante espresso BMP-2 è applicata clinicamente per migliorare la guarigione di siti fratturati. Una strategia comune in ingegneria del tessuto osseo è l'uso di fattori di crescita iniettabili, che è meno invasivo rispetto a sistemi di applicazione locale. Tuttavia, studi in vivo ed applicazioni cliniche hanno dimostrato che la breve emivita biologica, loc aspecificalizzazione e rapida domiciliazione del BMP-2 può portare a diversi problemi locali, ectopiche e sistemiche ^15. Quindi, per ottenere una presentazione efficace, l'intrappolamento o immobilizzazione di BMP-2 all'interno o sul materiale necessario alla sua consegna locale e costante a sito bersaglio. Consegna sostenuta può essere ottenuto con metodi di conservazione non covalenti, come intrappolamento fisico, adsorbimento o complessazione di ioni ^16. Tuttavia, è noto che adsorbimento non specifico di proteine ​​su superfici può causarne la denaturazione delle molecole ^17. Per il legame di fattori di crescita covalente, diversi tipi di supporti sono stati sviluppati negli ultimi dieci anni. L'uso di molecole bifunzionali che mirano linking amminici o carbossilici gruppi della proteina per esempio, è un tipo di approccio che non richiede necessariamente modificazione delle proteine ​​per raggiungere la sua immobilizzazione. Infatti, mentre modificazione delle proteine ​​offre il vantaggio di controllare l'orientamento proteine,l'introduzione di domini artificiali, tag e catene peptidiche specifiche del sito può alterare l'attività biologica di fattori di crescita ^17. Così, per aggirare denaturazione dovuta all'interazione con il materiale di supporto, le superfici possono essere funzionalizzati anticipo, per esempio, con un monostrato auto-assemblato (SAM) di una molecola di collegamento, seguito da accoppiamento del fattore desiderato ^18. Abbiamo usato un approccio basato SAM per immobilizzare covalentemente BMP-2 su una superficie di mira i suoi residui amminici liberi e abbiamo dimostrato che la proteina immobilizzata mantiene sia la sua attività biologica a breve e lungo termine ^19. Questo protocollo fornisce un modo semplice ed efficace per fornire BMP-2 alle cellule per studi in vitro sui meccanismi che si verificano a livello della membrana cellulare e regolano segnalazione intracellulare responsabili per la segnalazione osteogenico.

Protocol

1. Sintesi di 11-Mercaptoundecanoyl-N-idrossisuccinimmide Ester (MU-NHS)

1. Aggiungere goccia a goccia una soluzione di 500 mg di N-idrossisuccinimmide e 30 mg 4 - (dimetilammino) piridina in 10 ml di acetone (pa) a 1 g di acido 11-mercaptoundecanoic in 40 ml di diclorometano (pa) a temperatura ambiente (RT).
2. Raffreddare la reazione a 0 ° C e aggiungere goccia a goccia 1,1 g N, N '-dicicloesilcarbodiimmide in 10 ml di diclorometano (in atmosfera di azoto). Mantenere la reazione a bassa temperatura per 1 ora e poi agitare a temperatura ambiente durante la notte.
3. Filtrare il precipitato e asciugare sotto pressione ridotta. Purificare il prodotto mediante cromatografia flash con benzene petrolio e acetato di etile (pa) in un rapporto di 1:1.

2. Preparazione di strati d'oro omogenei

1. Vetrini pulite con panni di precisione e sonicare per 5 minuti in una soluzione contenente una miscela 1:1 di acetato di etile (pa) e metanolo (pa). Rinse substrati con metanolo e asciugare sotto flusso di azoto.
2. Posizionare i supporti puliti nel dispositivo di rivestimento polverizzazione. Evacuare la camera. Rimuovere lo strato di ossido di cromo superiore dal bersaglio di cromo sputtering per 60 sec. Porre i campioni sotto la trave di metallo e ricoprirli con uno strato di cromo 10 nm, seguita da rivestimento con uno strato di oro 40 nm.

3. Immobilizzazione superficie di BMP-2

1. Sciogliere MU-NHS in N, N-dimethlyformamide (DMF) a una concentrazione finale di circa 1 mM e incubare substrati d'oro nella soluzione MU-NHS a temperatura ambiente per 4 ore sotto atmosfera di azoto.
2. Superfici Sonicare in DMF per 2 minuti, sciacquare con DMF e MeOH e asciugare sotto flusso di azoto.
3. Preparare una soluzione stock di rhBMP-2 in sterile HCl 4 mm, con una concentrazione di 100 pg / ml (negozio aliquote a -80 ° C). Per diluizioni di lavoro (3,5 mcg / ml), diluire la soluzione madre in PBS / NaCl (PBS contenente 1 M NaCl) e unegolare a pH 8,5 immediatamente prima dell'uso.
4. Incubare superfici funzionalizzate MU-NHS nella soluzione rhBMP-2 ore a 4 ° C per una notte. Rimuovere il surnatante incubazione. Superfici Sonicare in PBS / NaCl per 2 minuti e lavare 3x con PBS sterile / NaCl.

4. Caratterizzazione superficiale

1. Per bloccare l'adsorbimento non specifico di anticorpo, incubare superfici con BSA 5% (w / v) in PBS per 1 ora a RT, seguita da incubazione con un anti-BMP-2 anticorpi (1:100 in 1% (w / v ) soluzione di BSA / PBS) per 1 ora a RT. Lavare le superfici due volte con PBS e ultrasuoni per 30 sec.
2. Incubare substrati con HRP-anticorpo secondario coniugato (1:1000 in 1% (w / v) di BSA / PBS) per 30 min a temperatura ambiente, poi lavare due volte con PBS.
3. Utilizzare Ampliflu test Red per misurare l'attività enzimatica HRP a 570 nm con un lettore di piastre.

5. Analisi dell'attività biologica

1. Seed 1 x 10 ⁵ topo C2C12 mioblasti per pozzetto in 6 pozzetti plAtes in terreno di coltura, costituiti da un elevato glucosio DMEM contenente piruvato supplementato con 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina e incubare per 24 ore a 37 ° C / 5% di CO _2.
2. Morire di fame cellule in DMEM senza siero per 3-5 ore prima di semina sulle superfici decorate con immobilizzata BMP-2.
3. Per le indagini dell'induzione segnalazione breve termine, sostituire il mezzo da 200 microlitri DMEM fresco senza siero e posizionare le immobilizzati BMP-2 superfici sopra le celle. La superficie deve essere maneggiato con le pinzette punta fine per evitare di graffiare.
4. Rimuovere delicatamente le superfici e aspirare il terreno con una pipetta, lavare le cellule due volte con PBS. Procedere all'analisi delle risposte delle cellule.
5. Per l'analisi dell'attività biologica a lungo termine, cellule piastra su superfici e cultura loro a 37 ° C / 5% di CO ₂ in condizioni di siero bassi (2% FBS) per sei giorni.

Results

Nella nostra configurazione, l'oro è stato scelto come eccipiente in quanto fornisce un sistema biologicamente aspecifica ma chimicamente sintonizzabile. Inoltre, l'applicazione di monostrati auto-assemblaggio comporta molti vantaggi: SAM adsorbe spontaneamente tramite loro "testa-gruppi" a metalli e formare monostrati con pochi difetti, mentre i loro gruppi terminali funzionali possono essere ulteriormente modificati. Così prevedono la piattaforma per adattare le proprietà dell'interfaccia controllata in modo ancora al...

Discussion

In questo protocollo si descrive la preparazione di superfici funzionalizzate con bioattivo rhBMP-2. Questo approccio comprende due fasi: 1) la formazione iniziale di una auto-assemblaggio monostrato (SAM) di un linker bifunzionale sulla superficie di oro; 2) immobilizzazione covalente della proteina rhBMP-2. Nel lavoro precedente, abbiamo convalidato l'effettivo legame del linker bifunzionale e il fattore di crescita, e dimostrato che in superficie immobilizzato rhBMP-2 mantiene la sua attività biologica ^19.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-idrossisuccinimide	Sigma-Aldrich	130672
4-(dimetilammino)piridina	Sigma-Aldrich	522805
Acetone	AppliChem	A2282
acido 11-mercaptoundecanoico	Sigma-Aldrich	674427
Diclorometano	Merck	106050
N,N'-dicicloesilcarbodiimmide	Sigma-Aldrich	D80002
Petrolio benzene	Merck
Vetrini coprioggetti	Carl Roth	M 875
Acetato di etile	AppliChem	A3550
Metanolo	Carl Roth	4627
N,N-dimetilformammide	Carl Roth	T921
rhBMP-2	R& D Systems	355-BM	Senza carriere; espresso in E.coli
PBS	PAA	H15-002
NaCl	Carl Roth	HN00.2
Poli(dimetilsilossano) (PDMS)	Dow Corning
Kit elastomero siliconico Sylgard 184	Dow Corning
Anti-rhBMP-2	Sigma	B9553
Capra anti-topo IgG-HRP	Santa Cruz	sc-2005	Anticorpo secondario
Ampliflu Red test	Sigma	90101
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), liquido	Gibco	41966	ad alto contenuto di glucosio
(FBS)	Sigma	F7524	Filtrato sterile, testato in coltura cellulare
Pen/Strep	Gibco	15140
Tripsina 0,05% (1x) con EDTA 4Na	Gibco	25300
Glicina (0,1 M)	Riedel-de Haë n	33226
IGEPAL CA-630 (1%)	Sigma	I8896	Tampone di lisi (saggio ALP)19
Cloruro di magnesio (MgCl2)(1 mM)	Carl Roth	HNO3.2
Cloruro di zinco (ZnCl2) (1 mM)	Carl Roth	3533.1
p-nitrofenilfosfato (pNPP)	Sigma	S0942	Substrato della fosfatasi
Anti-misina catena pesante (MHC)	Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi, Università dell'Iowa	MF20	Anticorpo monoclonale
Alexa Fluor 488 Capra anti-topo IgG	Invitrogen	A11001
DAPI	Sigma	D9542
Equipment
Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequenza 35 kHz	BANDELIN electronic GmbH Co. KG
MED 020 Sistema di rivestimento catodico	BAL-TEC AG		Condizioni di rivestimento Cr: 120 mA, 1,3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5,0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Lettore di lastre	Tecan