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Articolo metodologico

Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

42.9K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/50846

⸱

8 aprile 2014

 ,  , 
1Stem Cell Institute, Paul and Sheila Wellstone Muscular Dystrophy Center, Department of Neurology, University of Minnesota Medical School

In questo articolo

Sommario

L'isolamento e la coltura di una popolazione pura di cellule satelliti quiescenti, una popolazione di cellule staminali muscolari, è essenziale per la comprensione del muscolo biologia delle cellule staminali e rigenerazione, nonché trapianto di cellule staminali per terapie in distrofia muscolare e altre malattie degenerative.

Abstract

Cellule satelliti del muscolo sono una popolazione di cellule staminali necessarie per lo sviluppo post-natale del muscolo scheletrico e la rigenerazione, pari al 2-5% dei nuclei sublaminal nelle fibre muscolari. Nel muscolo adulto, cellule satelliti sono normalmente mitoticamente riposo. Dopo la lesione, tuttavia, le cellule satelliti iniziano proliferazione cellulare per produrre mioblasti, loro progenie, per mediare la rigenerazione del muscolo. Il trapianto di mioblasti derivati ​​dalle cellule satellite è stato ampiamente studiato come una possibile terapia per varie malattie, tra cui rigenerativi distrofia muscolare, insufficienza cardiaca e disfunzione urologica. Trapianto di mioblasti in distrofico muscoli scheletrici, cuore infartuato, e le disfunzioni vie urinarie ha dimostrato che i mioblasti engrafted possono differenziarsi in fibre muscolari nei tessuti dell'ospite e visualizzare miglioramento funzionale parziale in queste malattie. Pertanto, lo sviluppo di metodi di purificazione efficiente di cellule satelliti quiescenti da muscl scheletricoe, così come la creazione di cellule derivate da colture di mioblasti satellitari e metodi di trapianto di mioblasti, sono essenziali per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base di cellule auto-rinnovamento satellitare, attivazione e differenziazione. Inoltre, lo sviluppo di terapie cellulari per la distrofia muscolare e altre malattie rigenerative dipendono anche da questi fattori.

Tuttavia, attuali metodi di purificazione potenziali di cellule satelliti quiescenti richiedono l'uso di costosi fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) macchine. Qui, presentiamo un nuovo metodo per la purificazione rapido, economico e affidabile di cellule satelliti quiescenti di topo adulto muscolo scheletrico per dissociazione enzimatica seguita da cellule magnetico attivato classificare (MACS). Dopo aver isolato cellule satelliti quiescenti puri, queste cellule possono essere coltivate avere un gran numero di mioblasti dopo vari passaggi. Questi appena isolatocellule satelliti quiescenti o ex vivo mioblasti espansi possono essere trapiantate in cardiotossina (CTX) indotta rigenerante topo muscoli scheletrici per esaminare il contributo delle cellule derivate dal donatore alla rigenerazione delle fibre muscolari, nonché compartimenti cellulari satellite per l'esame di auto-rinnovamento attività.

Introduzione

Cellule satelliti muscolari sono una piccola frazione di cellule staminali miogeniche situati sotto la lamina basale delle fibre muscolari scheletriche. Essi sono caratterizzati dall'espressione di Pax7, Pax3, c-Met, M-caderina, CD34, Syndecan-3, e calcitonina 1 - 3. Le cellule satelliti hanno dimostrato di essere responsabile della rigenerazione muscolare come cellule staminali muscolari. Nel muscolo adulto, cellule satelliti sono normalmente mitoticamente riposo 4-8. A seguito di infortunio, le cellule satellite sono attivati, avviare espressione di MyoD, e entrare nel ciclo cellulare per espandere la loro progenie, chiamato cellule precursori miogeniche o mioblasti 3. Dopo diversi cicli di divisione cellulare, mioblasti escono dal ciclo cellulare e fusibile tra loro al fine di differenziamento in miotubi multi-nucleate, seguite da fibre muscolari mature. Mioblasti isolati dal muscolo adulto possono essere facilmente espanse ex vivo. La capacità di mioblasti per diventare fibre muscolari in rigenerazione muscolare e perfibre muscolari ectopiche forma nei tessuti non muscolari è utilizzata da trapianto dei mioblasti, un potenziale approccio terapeutico per la distrofia muscolare di Duchenne (DMD) 4, disfunzioni urologiche 9, e insufficienza cardiaca 10. Infatti, mioblasti sono stati trapiantati con successo nel muscolo di entrambe mdx (modello DMD), topi e pazienti DMD 11-14. I mioblasti normali iniettati fondono con le fibre muscolari ospitante per migliorare l'istologia e la funzione del muscolo malato. Il lavoro precedente ha dimostrato che sottopopolazioni di mioblasti sono più Stem Cell-like e rimangono in uno stato indifferenziato più a lungo nel muscolo durante la rigenerazione muscolare 5. Studi recenti hanno dimostrato che le cellule appena isolate satellitari di muscolo adulto contengono una popolazione di cellule simil-staminali che presenta attecchimento più efficiente e attività di auto-rinnovamento nella rigenerazione del muscolo 5-8. Pertanto, la purificazione di una popolazione pura di cellule satelliti quiescenti da adulto mu scheletricosclerosi è essenziale per la comprensione della biologia delle cellule satelliti, mioblasti e rigenerazione muscolare, e per lo sviluppo di terapie cellulari.

Tuttavia, attuali metodi di purificazione potenziali di cellule satelliti quiescenti richiedono l'uso di un costoso fluorescenza-attivato cell sorting (FACS) 1,2,6-8 macchina. Inoltre, l'esposizione laser FACS tende ad indurre la morte cellulare durante la separazione, che causa bassa resa di cellule satelliti quiescenti 15. Qui, presentiamo un nuovo metodo per la purificazione rapido, economico e affidabile di cellule satelliti quiescenti di topo adulto muscolo scheletrico. Questo metodo utilizza dissociazione enzimatica seguita da cellule magnetico attivato classificare (MACS). Dopo aver isolato cellule satelliti quiescenti puri, queste cellule possono essere coltivate avere un gran numero di mioblasti dopo vari passaggi. Mostriamo anche che l'iniezione intramuscolare di questi appena isolate cellule satellite quiescenti o ex vimioblasti vo espansi possono essere trapiantate in cardiotossina (CTX) indotta rigenerazione del mouse muscolo scheletrico per esaminare il contributo delle cellule derivate dal donatore alla rigenerazione delle fibre muscolari, nonché ai compartimenti cellulari satellitari per l'esame delle attività di auto-rinnovamento.

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Protocollo

Gli animali sono stati alloggiati in un ambiente SPF e sono stati monitorati dalla Direzione Risorse ricerca su animali (RAR) dell'Università del Minnesota. . Gli animali sono stati sacrificati con mezzi adeguati (CO 2 inalazione o iniezione KCl dopo essere stati anestetizzati con iniezione IP di Avertin (250 mg / kg) Tutti i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale (IACUC, numero di codice: 1304-30.492 ) dell'Università del Minnesota.

1. Isolamento di mononucleari cellule dal muscolo scheletrico mouse

  1. Correttamente sacrificare 1 o 2 giovani topi adulti (3-8 settimane).
    1. Pizzicare e fessura la pelle dell'addome con forbici affilate. Staccare la pelle per mostrare completamente tricipiti e muscoli degli arti posteriori (tirare la pelle in direzioni opposte).
    2. Rimuovere tutti i muscoli delle gambe scheletriche (tibiale anteriore, gastrocnemio e quadricipite) e tricipiti lungo le ossa con le forbici. Poi il trasferimento muscoli ghiacciata, sterile PBS in un piatto 10 centimetri.
  2. Lavare il sangue fuori i muscoli in PBS e muscoli trasferimento ad una nuova piastra sterile 6 centimetri: 1 piastra per 1-2 topi.
  3. Rimuovere il tessuto connettivo, vasi sanguigni, fasci nervosi, e tessuto adipogenico sotto un microscopio di dissezione.
  4. Utilizzando le forbici per oftalmologia, tagliare e tritare il tessuto in una pasta liscia (Figure 1A e 1B). Cercate di non lasciare pezzi di grandi dimensioni, in quanto non saranno suddivisi facilmente dalla soluzione enzimatica.
  5. Trasferire i muscoli tritati in una provetta Falcon da 50 ml e aggiungere 5 ml di soluzione di collagenasi (0,2% collagenasi di tipo 2 nel 10% FBS in DMEM). Incubare a 37 ° C per 60 min.
  6. Triturare (su e giù con un ago 18 G) per omogeneizzare la miscela (Figura 1C). Incubare ulteriormente la miscela a 37 ° C per 15 min.
  7. Triturare nuovo per omogeneizzare la miscela a dissociarsi in sospensione singola cella. Aggiungere 2% FBS in DMEM fino a 50 ml nella sospensione di cellule singole e mescolarebene.
  8. Mettere un filtro cella (70 micron) su un tubo ml Falcon 50 (Figura 1D). Trasferire il supernatante contenente le cellule dissociate su un filtro cella e pipetta la sospensione cellulare su e giù sul filtro fino ad attraversare.
  9. Contare il numero di cellule da emocitometro. Centrifugare le provette a 2000 rpm a 4 ° C per 5 minuti; aspirare e scartare il surnatante.
  10. Risospendere con 10 ml di 2% FBS in DMEM. Centrifugare le provette a 2000 rpm a 4 ° C per 5 minuti; aspirare e scartare il surnatante.
  11. Risospendere con 200 ml di 2% FBS in DMEM e sospensione cellulare trasferimento in provette da 1,5 ml microcentrifuga. Solitamente, circa 2 x 10 6 cellule devono essere raccolte da muscoli di 1 mouse. Le cellule saranno diluiti ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule in 100 microlitri di 2% FBS in DMEM.

2. Antibody colorazione e separazione con MACS

Durante il seguente procedures, mantenere condizioni di sterilità utilizzando tamponi sterili. Ogni volume di anticorpi aggiunto e mezzo di sospensione cellulare è calcolato per cellule di muscoli intere di 1 mouse. Se le cellule vengono raccolte da 2 o più topi, la quantità di reagenti dovrebbe essere ottimizzato.

  1. Aggiungere 1 ml ciascuna di CD31-PE, CD45-PE, Sca-1-PE, e integrina anticorpo α7 in 200 microlitri della sospensione cellulare. Incubare in ghiaccio per 30 min.
  2. Lavare le cellule: Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di 2% FBS in DMEM nella sospensione cellulare nella provetta da 1,5 ml e centrifugare a 2000 rpm a 4 ° C per 3 min. Ripetere questa operazione due volte.
  3. Aspirare e scartare il surnatante.
  4. Risospendere le cellule con 200 ml di 2% FBS in DMEM, e aggiungere 10 ml di Anti-PE sfere magnetiche. Incubare in ghiaccio per 30 min.
  5. Lavare le cellule: Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di tampone MACS alla sospensione cellulare nella provetta da 1,5 ml microcentrifuga, e quindi si centrifuga a 2000 rpm a 4 ° C per 3 min. Ripetere questo passaggio twghiaccio. Si noti che le celle devono essere lavati a tampone MACS prima di essere separati da una colonna magnetica.
  6. Aspirare e scartare il surnatante. Risospendere le cellule con 1,0 ml di tampone MACS.
  7. Impostare colonna LD su una tavola magnetica, e sciacquare la colonna con 2.0 ml di tampone MACS (Figura 1E).
  8. Trasferire la sospensione cellulare in colonna LD, e raccogliere la frazione di flusso passante in una provetta da 1,5 ml. Questa frazione contiene cellule PE-negativo.
  9. Centrifugare a 2000 rpm a 4 ° C per 3 minuti, aspirare e scartare il surnatante.
  10. Risospendere le cellule con 200 ml di 2% FBS in DMEM, e aggiungere 10 ml di IgG anti-topo sfere magnetiche. Incubare in ghiaccio per 30 min.
  11. Lavare le cellule: Dopo l'incubazione, aggiungere 1 ml di tampone MACS in sospensione di cellule in provetta da 1,5 ml, quindi si centrifuga a 2000 rpm a 4 ° C per 3 min. Aspirare e scartare il surnatante. Ripetere questa operazione due volte. Risospendere le cellule con 500 microlitri di tampone MACS.
  12. Impostare colonna MS su una tavola magnetica, e sciacquare la colonna con 500 microlitri di tampone MACS (Figura 1F).
  13. Trasferimento sospeso soluzione di cellule nella colonna MS, e scartare la frazione flow-through (integrina α7-negativi cellule).
  14. Sciacquare con 1 ml di tampone MACS, e ripetere questo passaggio due volte.
  15. Dopo il risciacquo, rimuovere colonna dal campo magnetico del separatore. Applicare 1,0 ml di tampone MACS sulla colonna, ed eluire le cellule marcate magneticamente (cellule positive α7-integrina) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga spingendo lo stantuffo della siringa dalla parte superiore della colonna. Raccogliere il flusso continuo in una provetta da 1,5 ml. Ripetere l'eluizione con 1,5 ml di tampone MACS e raccogliere il flow-through.
  16. Centrifugare a 2000 rpm a 4 ° C per 3 minuti, aspirare e scartare il surnatante.
  17. Risospendere le cellule purificate con 1 ml di Myoblast medio (20% FBS conteneva Hams F-10 con bFGF), e cellule piastra su Matrigel rivestite 10 centimetripiastra con 8 ml di Myoblast Piano (5 ml a 6 centimetri piastra) (Figura 1G). Si noti che 1-2 x 10 5 cellule possono potenzialmente essere isolate dal 1 muscolo intatto il mouse.

3. Manutenzione

  1. Concime cellule ogni altro giorno con mezzo Myoblast. La comparsa di mioblasti crescita è di un piccolo e rotondo esprimere MyoD (Figura 2) e Pax7 (dati non mostrati) nel loro nucleo.
  2. Mioblasti dovrebbero essere diversi passaggi prima che il 50% di confluenza o quando si inizia la fusione cellulare. Dopo il risciacquo una volta con PBS, incubare le cellule con soluzione di tripsina 0,25% a 37 ° C per 3 minuti in un incubatore CO 2 e raccogliere le cellule dissociate con mezzo Myoblast. Dopo cellule centrifuga (1000 rpm per 5 min), la sospensione con il mezzo Myoblast e replate cellule su nuove piastre Matrigel rivestite. Piastre di collagene rivestite possono essere utilizzati dopo il passaggio 3. Un piatto di solito può essere suddiviso in 3-5 piatti.

4. Differentiation

  1. Inserire di nuovo con Differenziazione medio ogni altro giorno.
  2. Di giorno 1 nella differenziazione Medium, mioblasti escono dal ciclo cellulare e subiscono differenziazione in catena pesante della miosina (MHC)-positivo miociti. Questi myoctyes iniziano fusione cellulare con l'altro per generare miotubi multinucleate. In genere, la maggior parte dei mioblasti diventano MHC-positivi di differenziazione miociti mononucleate o miotubi (Figura 2) di giorno 3-5 in Differenziazione Medium.

5. Myoblast trapianto in mouse per la rigenerazione muscolare scheletrica

  1. Anestetizzare il mouse con Avertin (250 mg / kg) per via intraperitoneale (IP) iniezione.
  2. Radersi i capelli pelle intorno sul tibiale anteriore (TA) muscolare. Ventiquattro ore prima del trapianto di mioblasti, 10 pM CTX (50 microlitri) viene iniettato per via intramuscolare nel Nod / Scid topo TA muscolare per indurre la rigenerazione muscolare attraverso una siringa da 31 G insulina attraverso la pelle rasata (Figura60, 3).
  3. Mioblasti proliferanti sono dissociate con 0,25% di soluzione di tripsina, e centrifugate a 1000 rpm per 5 min. Aspirare e scartare il surnatante. Risospendere 1 x 10 6 cellule con 50 ml di 2% FBS in DMEM. Trasferire le cellule in sospensione in una siringa da insulina 31 G.
  4. Topi riceventi saranno anestetizzati con Avertin (250 mg / kg) per iniezione IP, e 1 x 10 6 mioblasti (Figura 2) vengono iniettati per via intramuscolare nel muscolo rigenerante TA.
  5. Harvest TA muscolare 1-4 settimane dopo l'iniezione delle cellule per l'analisi istologica (figura 3).

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Risultati

Cellule satelliti quiescenti appena isolate mostrano un piccolo, forma rotonda (Figura 1G), e Pax7 espresso come marcatore definitivo per le cellule satellite quiescenti. Più del 90% delle cellule appena isolate esprimono Pax7 (Figura 1H e 1I). Maggior parte delle cellule contaminate sono da cellule del sangue che non crescono in modo efficiente in vitro seguente condizioni di coltura mioblasti. Così, mioblasti derivati ​​dalle cellule satelliti dominano nella ...

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Discussione

In questo protocollo, cellule satelliti quiescenti possono essere facilmente purificati da adulto muscolo scheletrico di topi da digestione con collagenasi e separazione MACS mediata da anticorpi superficie. Questo metodo richiede circa 6 ore e non necessita di apparecchiature costose come una macchina FACS. Inoltre, questo metodo è relativamente poco costoso rispetto alla superficie di separazione FACS mediata da anticorpi. Una maggiore resa di cellule satelliti quiescenti si aspetta anche in confronto a FACS per quest...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dott. Shahragim Tajbakhsh per la fornitura di topi Myf5 + / nLacZ. Ringraziamo anche Alexander Hron e Michael Baumrucker per la lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Muscular Dystrophy Association (MDA) e Gregory Marzolf Jr. MD Centro Award.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiali
Collagenasi Tipo 2WorthingtonCLS-2100 mg
MarigelBD Biosciences3562345 ml
DMEMGibco-Invitrogen10569010500 ml
Collagene (Coda di Ratto)BD Biosciences354236100 mg (3-4 mg/ml)
Acido aceticoSigma-Aldrich320099-500ML500 ml
bFGF, umano,Gibco-InvitrogenoPHG02631 mg
Albumina sierica bovina (BSA)Sigma-AldrichA5611-1G1 g
Ham' s F10Medium Gibco-Invitrogen11550-043500 ml
Siero fetale bovino (FBS)Fisher Scientific3600511500 ml
Siero di cavalloGibco-Invitrogen26050088500 ml
Penicillina/StreptmicinaGibco-Invitrogen15640055100 ml
salina tamponata con fosfatoGibco-Invitrogen14190144500 ml
0,25% Tripsina/EDTAGibco-Invitrogen25200072500 ml
Ago da 18 G con siringa da 12 mlFisher Scientific22-256-563
Filtro cellulare (70 μ m)Fisher Scientific22-363-548
Falcon tubo da 50 mlBD Biosciences352098
Falcon tubo da 15 mlBD Biosciences352097
10 cm Piastra per coltura tissutaleBD Biosciences353003
6 cm Piastra per coltura tissutaleBD Biosciences353004
Falcon Pipetta monouso da 10 mlBD Biosciences
Anticorpo anti-CD31-PEeBiosciences12-0311
Anticorpo anti-CD45-PEeBiosciences30-F11
Anticorpo Anti-Sca1-PEeBiosciencesDec-81
Anti-Integrina α 7 anticorpiMBL InternationalABIN487462
Microsfere anti-PEMiltenyi Biotec130-048-801
Microsfere IgG anti-topoMiltenyi Biotec130-048-402
Mini & Kit di partenza MidiMACSMiltenyi Biotec130-091-632
Colonna MSMiltenyi Biotec130-042-201
Colonna LDMiltenyi Biotec130-042-901
CardiotossinaSigma AldrichC9759-1MGStock 10 μ M in PBS
31 G Siringa da insulinaBD Biosciences328438
Microcentrifuga refrigerata (Microfuge 22R)Beckman Coulter368826
S241.5 Rotore a secchio oscillanteBeckman Coulter368882
Centrifuga refrigerata (Allegra X-22R)Beckman Coulter392187
Nod/Scid topi immunodeficientiCharles River LaboratoriesCodice ceppo 394Utilizzare topi di 2 mesi
ReagentsRecipe
10% e 2% FBS DMEM DMEM(Gibco-Invitrogen #10569010) con 10% o 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) e 1% Penicillina/Streptomicina (Gibco-Invitrogen #15640055).
Soluzione di collagenasiCollagenasi di tipo 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg di collagenasi di tipo 2 in 10% FBS DMEM.
Matrigel al 10% Matrigel(BD Biosciences: #356234) viene posta su ghiaccio per lo scongelamento durante la notte. Cinque ml di Matrigel vengono diluiti con 45 ml di DMEM e 5 ml di aliquote vengono conservate a -20 ° C fino all'uso.
Cinqueml di soluzione Matrigel vengono posti sul ghiaccio per lo scongelamento e utilizzati per rivestire una lastra da 10 cm a temperatura ambiente per 1 minuto. La piastra è posta in un incubatore CO2 al 5% a 37 ° C per 30 minuti dopo aver rimosso la soluzione di Matrigel e lasciare asciugare la piastra nella cappa di coltura per altri 30 minuti. La soluzione di Matrigel al 10% rimossa viene conservata a -20 ° C per il riutilizzo.
collagene allo 0,01%Mescolare al finale: 0,01% di collagene (collagene, coda di ratto: BD Biosciences #354236) in acido acetico allo 0,2% (320099-500ML) in ddH2O.
PiastraAggiungere 5 ml o 2 ml di soluzione di collagene a una piastra di coltura tissutale da 10 cm o 6 cm e lasciare riposare a temperatura ambiente per tre ore. Quindi, aspirare il liquido e lasciare asciugare nella cappa di coltura per 30 minuti o tutta la notte. Le piastre possono essere conservate a temperatura ambiente per diversi mesi.
madre bFGF bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) viene disciolta con una soluzione BSA allo 0,1% composta da 1 mg di BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) e 2 ml di ddH2O (0,5 mg/ml di bFGF). Aliquot 20 μ l in 500 μ l. provette per microcentrifuga e mantenute in -80 °C.
Myoblast medio500 ml HAM' S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) integrato con il 20% di FBS (Fisher Scientific #03600511), penicillina/streptomicina (Gibco-Invitrogen #15640055) e 10 μ g di bFGF (20 μ l di stock bFGF).
di differenziazione500 ml di DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) integrato con il 5% di siero di cavallo (Gibco-Invitrogen #26050088) e l'1% di penicillina/streptomicina (Gibco-Invitrogen #15640055).
10 μ M Cardiotoxin stock1 mg di Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) viene sciolto con 13,9 ml di PBS.
ricombinante Soluzione 357551 allo 0,2% La soluzione Soluzione di rivestita di collagene La soluzione Terreno

Riferimenti

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