Arricchimento ed eliminazione delle cellule staminali embrionali umane mediante rilevamento di antigeni di superficie cellulare utilizzando gli anticorpi monoclonali TG30 e GCTM-2

Sommario

Descriviamo l'uso degli anticorpi monoclonali TG30 (CD9) e GCTM-2 per il rilevamento combinato di antigeni di superficie cellulare tramite smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS) per l'identificazione e l'arricchimento di cellule staminali embrionali umane vive (hESC) utilizzando la selezione positiva e anche l'uso della selezione negativa per eliminare gli HESC da una popolazione a cellule miste.

Abstract

Le cellule staminali embrionali umane (hESC) possono autorinotizzarsi indefinitamente in vitroe con gli spunti appropriati possono essere indotte a differenziarsi in potenzialmente tutte le lignaggi delle cellule somatiche. I derivati hESC differenziati possono potenzialmente essere utilizzati nelle terapie di trapianto per trattare una varietà di malattie degenerative cellulari. Tuttavia, i protocolli di differenziazione hESC di solito producono una miscela di tipi di cellule target e off-target differenziate, nonché cellule residue indifferenziate. Per la traduzione di derivati hESC differenziati dal laboratorio alla clinica, è importante essere in grado di discriminare tra cellule indifferenziate (pluripotenti) e differenziate e generare metodi per separare queste popolazioni. L'applicazione sicura dei tipi di cellule somatiche derivate da hESC può essere eseguita solo con popolazioni pluripotenti senza cellule staminali, poiché gli hESC residui potrebbero indurre tumori noti come teratomi dopo il trapianto. A tal fine, qui descriviamo una metodologia per rilevare gli antigeni di superficie cellulare associati a pluripotenza con gli anticorpi monoclonali TG30 (CD9) e GCTM-2 tramite smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS) per l'identificazione di pluripotenti TG30^Hi-GCTM-2^Hi hESC utilizzando la selezione positiva. Utilizzando la selezione negativa con la nostra metodologia FACS TG30/GCTM-2, siamo stati in grado di rilevare ed eliminare gli hESC indifferenziati nelle popolazioni sottoposte a differenziazione molto precoce (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). In un ulteriore studio, campioni pluripotenti senza cellule staminali di cellule^NegTG30 Neg -GCTM-2^{differenziate selezionate} utilizzando il nostro protocollo FACS TG30/GCTM-2 non formavano teratomi una volta trapiantati in topi immunocompro compromessi, supportando la robustezza del nostro protocollo. D'altra parte, la passaging consecutiva mediata da TG30/GCTM-2 FACS di hESC pluripotenti arricchiti TG30^Hi-GCTM-2^Hi non ha influito sulla loro capacità di autorinotizzo in vitro o sulla loro pluripotenza intrinseca. Pertanto, le caratteristiche della nostra metodologia FACS TG30/GCTM-2 forniscono un saggio sensibile per ottenere popolazioni altamente arricchite di hPSC come input per test di differenziazione e per liberare hESC potenzialmente tumorigenico (o residuo) dalle popolazioni di cellule derivate.

Introduzione

L'HPSC (hPSC) comprende le cellule staminali embrionali umane (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hIPSC). HPSC può rinnovarsi autonomamente in condizioni cultura appropriate senza perdere la propria capacità nota come "pluripotenza". La pluripotenza è definita come il potenziale per una cellula di differenziarsi in essenzialmente in qualsiasi lignaggio cellulare somatico, comprese le cellule rappresentative di ciascuno dei tre strati embrionali delle cellule germinali. Il notevole potenziale dell'hPSC fornisce un mezzo per una grande varietà di applicazioni a base cellulare, comprese le opzioni terapeutiche. Ad esempio, ci sono disturbi che coinvolgono la morte cellulare e la degenerazione, in cui la normale funzionalità delle cellule nel corpo umano è compromessa, come insufficienza cardiaca, lesioni spinali, diabete, morbo di Parkinson, alcuni tumori e altre patologie cliniche. I pazienti che soffrono di queste condizioni potrebbero potenzialmente essere trattati trapiantando cellule somatiche sane e funzionali che sono state derivate dall'hPSC in laboratorio. Tuttavia, gli attuali protocolli di differenziazione hPSC non sono efficienti al 100% e producono una miscela di tipi di cellule target e off-target differenziati, nonché hPSC residui che non hanno subito differenziazione, continuando invece ad auto-rinnovarsi^1-3. La presenza anche di un piccolo numero di hPSC in un campione di cellule somatiche derivate da hPSC destinate al trapianto in pazienti costituisce un grave rischio clinico in quanto queste cellule per loro natura intrinseca per formare tessuti di tutti e tre gli strati germinali embrionali, potrebbero potenzialmente formare in vivo un tipo di tumore noto come teratoma. Pertanto, solo le popolazioni di cellule bersaglio determinate per essere libere da cellule staminali pluripotenti possono essere considerate sicure per il trapianto nei pazienti. Ci sono diversi approcci segnalati per realizzare potenzialmente l'eliminazione degli hPSC residui in seguito alla differenziazione (per la revisione vedi Polanco e Laslett⁴). Abbiamo precedentemente segnalato l'uso degli anticorpi monoclonali TG30 (CD9) e GCTM-2 accoppiati allo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (FACS) per identificare le cellule staminali pluripotenti e discriminarle dalle cellule sottoposte a una fase precoce di differenziazione nelle colture delle^{linee hESC 5-7}.

Un vantaggio dell'uso di anticorpi per rilevare gli antigeni superficiali cellulari è che le cellule bersaglio sono solitamente vitali dopo il legame anticorpale e /o l'etichettatura. Pertanto, le cellule bersaglio possono essere raccolte dopo l'etichettatura degli anticorpi e riculturate per l'espansione e ulteriori applicazioni prima del trapianto. Un avvertimento per gli antigeni di superficie cellulare espressi su hPSC è che non sono esclusivi dello stadio pluripotente e sono in molti casi ri-espressi temporaneamente durante lo sviluppo e saranno quindi rilevati in alcuni tipi di cellule differenziate. Pertanto, se l'obiettivo è quello di utilizzare anticorpi per rilevare le cellule pluripotenti umane ed epurarle da un campione di cellule derivate dall'hPSC, gli anticorpi selezionati non dovrebbero reagire anche con antigeni sui tipi di cellule differenziate specifiche destinati al trapianto. Sfortunatamente, ci sono un numero limitato di anticorpi che rilevano marcatori di superficie cellulare su HPSC ^{vivi 4}, rendendo limitate le opzioni per la selezione. Inoltre, alcuni studi hanno sottolineato che il rilevamento di un singolo marcatore di superficie cellulare non è sufficiente per eliminare tutti gli hPSC, suggerendo che qualsiasi tentativo di eliminare tutte le sottopopolazioni pluripotenti hPSC dovrebbe basarsi su metodi che utilizzano due o più anticorpi che rilevano epitopi diversi espressi da hPSC ^9-10. Come accennato in precedenza, solo le cellule derivate dall'hPSC che potrebbero essere determinate come popolazioni di cellule pluripotenti libere da cellule staminali sono appropriate per il trapianto umano. Il raggiungimento di questo livello di rigore potrebbe non essere raggiunto con un solo passaggio attraverso una tecnologia di smistamento delle cellule mediata da anticorpi. Per ottenere definitivamente campioni pluripotenti senza cellule staminali può essere necessaria la ricoltura della popolazione arricchita di cellule bersaglio differenziate e successivi cicli di smistamento cellulare.

Nel nostro laboratorio, abbiamo ampiamente caratterizzato due anticorpi hES cellula-superficie, TG30 (CD9) e GCTM-2, per il rilevamento di cellule pluripotenti vive. I nostri studi hanno dimostrato che il rilevamento combinato di TG30 e GCTM-2 è fortemente correlato con l'espressione di geni associati alla pluripotenza canonica nelle linee ^{hESC 5-7}. L'immunoprofiling FACS TG30/GCTM-2 ha costantemente dimostrato che le colture hESC costituiscono un gradiente continuo quantitativo di espressione TG30/GCTM-2 ^5-7. Abbiamo arbitrariamente stabilito quattro popolazioni (P) di cellule all'interno di questo gradiente TG30/GCTM-2: P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid) e P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) ^5-7. La nostra caratterizzazione di queste popolazioni cellulari P4, P5, P6 e P7 ha dimostrato che le sottofrazioni P6 e P7 esprimono un gran numero di geni associati alla pluripotenza e formano in modo efficiente colonie simili a staminali quando vengono riculturate dopo FACS ^2-3. D'altra parte, le cellule P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) esprimono un gran numero di marcatori di differenziazione e costituiscono i tipi di cellule spontaneamente differenziati che tipicamente si verificano nelle colture in espansione delle ^{linee hESC 5-6}. Abbiamo deciso di testare le potenzialità del nostro TG30/GCTM-2 FACS per l'eliminazione selettiva degli hPSC residui dopo la differenziazione in fase iniziale, e anche per l'arricchimento delle popolazioni pluripotenti di cellule staminali. Il protocollo descritto di seguito mostra come raccogliere e ricolturare le cellule P4 differenziate (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) dopo FACS per eseguire l'eliminazione del pluripotente P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). Inoltre, spieghiamo anche la raccolta e la ricoltura di cellule pluripotenti P7 (TG30^Hi-GCTM-2^{Hi) per}ottenere una coltura arricchita di cellule pluripotenti, che potrebbe successivamente essere utilizzata come popolazione di input definita per aumentare potenzialmente l'efficienza e la coerenza dei test di differenziazione.

Protocollo

Il seguente protocollo è stato eseguito utilizzando le colture standard hESC-MEL1¹¹ fornite dalla struttura StemCore della Monash University (Melbourne). Questa linea cellulare viene regolarmente coltivata su uno strato di fibroblasti embrionali di topo inattivati mitoticamente (MEF) in bFGF integrato hESC/KOSR media⁷ e viene mantenuta con dissociazione enzimatica (Collagenasi) ogni 5-7 giorni⁸. Le colture hESC coltivate fino a ~80% di confluenza in flaconi da 75 cm² (T75) sono utilizzate come popolazioni di input per questo protocollo. Tutte le procedure di manipolazione cellulare descritte di seguito devono essere eseguite in condizioni asettiche in un armadio di biosicurezza di classe II filtrato con HEPA.

Due giorni prima di eseguire un saggio FACS TG30/GCTM-2, preparare le piastre di coltura T75 (descritte nella sezione 1) che devono essere utilizzate per la ricoltura delle cellule recuperate dopo facs (descritte nella sezione 4).

1. Semina di MEF e preparazione di mezzi condizionati con MEF

1.1 GIORNO -2: Placcatura dei MEF in mastri T75

1. Pipetta 10 ml di gelatina 0,1% con v in ogni pallone T75 e inclinazione per rivestire la superficie uniformemente.
2. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in un armadio per la biosicurezza.
3. Aspirare la soluzione di gelatina.
4. Aggiungere 20 ml di MEF-medium al pallone e pre-equilibrare a 37 °C/5% CO_{2 per} 30 min in un incubatore di coltura cellulare.
5. Mef inattivati mitoticamente su mambi preparati alle seguenti densità. Per 1/3 semi di densità MEF 1,4 x 10⁴ celle/cm² (T75= 1 x 10⁶ MEF). Per semi MEF a piena densità 5,3 x 10⁴ celle/cm² (T75 = 4 x 10⁶ MEF).

Nota: usiamo regolarmente MEF che sono stati inattivati mitoticamente dall'irradiazione γ'irradiazione. Un protocollo per la preparazione γ MEF irradiati a mosca può essere trovato in Michalska¹².

6. Incubare colture di MEF irradiate a 37 °C/5% CO₂ durante la notte. I flaconi 1/3 possono essere incubati per 1-4 giorni senza cambio MEF-medium. Questi contenitori sono utilizzati per la piastratura di celle post-FACS (come nel protocollo 4). I contenitori MEF completi vengono incubati durante la notte per generare CM come di seguito nel passaggio 1.2.

1.2 GIORNO -1: Preparazione di mezzi condizionati con MEF (CM)

1. Aspira mef-medium da flaconi full-MEF T75.
2. Aggiungere mezzo pre-equilibrato da 25 ml hESC/KOSR integrato con 5 ng/ml di FGF-2 umano per pallone T75. Incubare a 37 °C/5% CO₂ per 24 ore.
3. Raccogliere il mezzo condizionato da MEF (CM) in un tubo di coltura tissutale sterile, integrare appena CM con FGF-2 umano da 10 ng/ml e filtrare utilizzando un filtro in polieteresolfone da 0,22 μm.
4. Per produrre CM aggiuntivo, ripetere i passaggi 1.2.2 e 1.2.3 ogni giorno sulla stessa cultura MEF per una settimana.

Il giorno dell'esecuzione di un saggio TG30/GCTM-2, sostituire MEF-medium in flaconi MEF T75 da 1/3 con CM e pre-equilibrare per almeno 30 minuti prima di seminare hESC o cellule derivate da hESC recuperate dalla procedura descritta di seguito. Cm viene utilizzato fresco o conservato a 4 °C per un massimo di 2 settimane. CM viene utilizzato in questo protocollo in quanto nelle nostre mani aumenta la vitalità delle cellule post-FACS rispetto ai supporti non condizionati (risultati non mostrati).

2. Esecuzione di un saggio FACS TG30/GCTM-2: dissociazione delle colture di massa hESC in singole cellule

Nota: Prechill 20% FBS/DMEM-F12 medio a 4 °C.

1. Aspirare il supporto hESC/KOSR da due flaconi T75 con una linea hESC colta.
2. Risciacquare le cellule in ogni T75 con 10 ml di DPBS e aspirare a rimuovere.
3. Aggiungere 3 ml di soluzione di dissociazione TrypLE Express in ogni pallone T75. Incubare a 37 °C/5% CO₂ per 5 min.
4. Urtare il lato dei contenitori per ottenere lo slogamento completo delle cellule. Controllare al microscopio. Se le cellule non si dislodare facilmente, incubare per altri 2-3 min a 37 °C/5% CO₂.
5. Aggiungere 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (mantenuto a 4 °C) a ciascun pallone T75. Utilizzando una pipetta sterile da 10 ml triturare delicatamente le cellule dissociate più volte contro la parete del pallone per ottenere una sospensione prevalentemente a singola cella.
6. Posizionare un colino cellulare da 70 μm su un tubo sterile in polipropilene da 50 ml. Utilizzare una pipetta sterile da 10 ml per forzare le sospensioni a cella singola hESC raggruppate dai due contenitori T75 attraverso il colino.
7. Scartare il filtro cellulare, sostituire il coperchio del tubo e centrifugare la sospensione hESC raggruppata a 1.000 x g per 2 min.
8. Scartare il supernatante e lavare le cellule rimescolando delicatamente il pellet in 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (prechilled a 4 °C).
9. Eseguire una seconda centrifugazione a 1.000 x g per 2 min.
10. Scartare il supernatante, aggiungere 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (prechilled a 4 °C) e triturare delicatamente alle cellule di sospensione. Mettere il tubo da 50 ml sul ghiaccio. Questo tubo verrà utilizzato per la procedura di immunosottenzione del campione di ordinamento descritta di seguito.
11. Prendere 20 μl della sospensione a singola cella hESC (fase 2.10) per il conteggio del numero di cellulare usando un emotocitometro. Dovresti aspettarti una resa di 10-15 milioni di cellule per pallone T75.

Nota: FBS viene utilizzato in questa parte del protocollo per aumentare la vitalità cellulare dopo facs.

3. Colorazione immunofluorescente degli antigeni di superficie cellulare TG30 e GCTM-2

1. Aliquota 150 μl (~100.000 cellule) di una sospensione a cella singola hESC (dal passo 2.11) in ciascuno dei sei tubi a microcentrifugo da 1,5 ml. Queste sei aliquote saranno utilizzate per i controlli di colorazione necessari per calibrare il saggio sulla macchina FACS. La restante sospensione cellulare di ~ 9 ml sarà il campione di ordinamento in cui le impostazioni cultura dissociate verranno costate per il rilevamento di TG30 e GCTM-2, secondo le tabelle 1 e 2.
2. Eseguire reazioni di legame di anticorpi primari nel 20% FBS/DMEM-F12. I volumi di reazione finali devono essere di ~9 ml per il campione di ordinamento e di 200 μl per i controlli. Includere i controlli dell'isotipo come anticorpi primari. Posizionare i tubi orizzontalmente sul ghiaccio e mescolare delicatamente per 30 minuti su una piattaforma a dondolo.
3. Centrifugare le reazioni anticorpali primarie a 1.000 x g per 2 min.
4. Scartare il supernatante e lavare le cellule risosospensione del pellet in 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (prechilled a 4 °C) per il campione di ordinamento e 200 μl per i controlli.
5. Eseguire un secondo giro a 1.000 x g per 2 min.
6. Eseguire reazioni di legame di anticorpi secondari nel 20% FBS/DMEM-F12. I volumi di reazione finale devono essere di 2,5 ml per il campione di ordinamento e di 200 μl per i comandi. Preparare il tubo di reazione PE-anti-mouse CD90.2 in questa fase. Posizionare i tubi orizzontalmente sul ghiaccio e mescolare delicatamente per 30 minuti su una piattaforma a dondolo.

Nota: Durante questo periodo di incubazione, è conveniente raccogliere CM e preparare 1/3 mif T75 flaconi con CM come nella sezione 1.2.

7. Centrifugare reazioni anticorpali secondarie a 1.000 x g per 2 min.
8. Scartare il supernatante e lavare le cellule DUE VOLTE risospendendo il pellet in 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (prechilled a 4 °C) per il campione di ordinamento e 200 μl per i controlli.
9. Eseguire un giro a 1.000 x g per 2 minuti seguendo ogni lavaggio e posizionare i tubi sul ghiaccio.
10. Scartare supernaganti e pellet di cellule resuspende in FBS/DMEM-F12 al 20% integrati con ioduro di propidio (PI) a 0,3 μg/ml. Utilizzare 2-3 ml per il campione di ordinamento e 300 μl per i controlli.

Nota: NON aggiungere PI al tubo di controllo con celle non macchiate.

11. Utilizzare una micropipetta P1000 per forzare ogni singola sospensione cellulare attraverso un filtro a celle a coperchio da 35 μm, accoppiato a provette di fondo rotonde in polistirolo a tubo da 5 ml.
12. Centrifuga a 50 g/min per forzare la sospensione residua delle cellule sui coperchi del colino.
13. Rimorsi ogni singola sospensione cellulare toccando i lati dei tubi e posizionarsi sul ghiaccio. Le celle sono ora pronte per facs. Si prega di procedere immediatamente.

4. Coltura post-FACS delle celle di subfrazione TG30/GCTM-2 in flaconi da 75 cm² (T75)

1. In precedenza abbiamo segnalato come impostare una macchina FACS per l'immunoprofiling TG30/GCTM-2⁷. La procedura consente il recupero di hESC singoli praticabili, liberi da MEF, e all'interno delle porte di P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid) e P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) - vedi figura 1E. Impostare la macchina FACS per TG30/GCTM-2 FACS come nel report precedente per recuperare le sottofrazioni di celle da utilizzare successivamente.
2. Aggiungere 1 ml di CM, preparato come al passaggio 1.2, a ciascuna delle due provette rotonde in polistirolo da 5 ml prima di raccogliere le celle dalla macchina FACS. Mettiti sul ghiaccio.
3. Recuperare 400.000 celle ciascuna da sottofrazioni di cellule P4 differenziate (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) e pluripotenti P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)utilizzando TG30/GCTM-2 FACS.
4. Centrifugare i tubi di raccolta a 1.000 x g per 5 min.
5. Aspirate i supernatanti. Aggiungere 1 ml prequilibrato 37 °C/5% CO₂ CM per rimescolare ogni pellet di cella utilizzando un micropipettor P1000. Seminare le cellule per ogni frazione su un masto pre-equilibrato da 1/3 MEF T75 con CM (preparato secondo il passaggio 1.2)
6. Coltura a 37 °C/5% CO_{2 per 24} ore in un incubatore di coltura cellulare.
7. Aspirare cm ogni giorno e sostituire con CM appena preparato (come nella fase 1.2) per circa due settimane. Le colture di cellule pluripotenti P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)mostrano colonie simili a staminali umane dopo una settimana e raggiungono ~80% di confluenza a 9-11 giorni. Le colture di cellule P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) crescono principalmente come un prato di cellule simili a fibroblasti che raggiunge la confluenza a 11-13 giorni. In questa fase, se necessario, le colture cellulari P4 e P7 possono essere utilizzate per la ricoltura consecutiva mediata da TG30/GCTM-2 di sottofrazioni P4 o P7 (vedere figure 2 e 3).

Risultati

Le derivate hESC che sono pluripotenti senza cellule staminali possono essere ottenute mediante passaging consecutivo di cellule dalla sottofrazione P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg).

Rapporti precedenti hanno stabilito che nelle colture standard hESC coesiste una miscela di sottopopolazioni che mostrano un gradiente di espressione di geni associati alla^{pluripotenza 5,6,13}. Il rilevamento combinato di antigeni di superficie cellulare come TG30 (CD9) e GCTM-2 consente la discriminazione di un certo numero di sottoinsiemi di cellule nella fase pluripotente e in varie fasi della differenziazione precoce, come indicato dalla loro espressione di marcatori di cellule staminali e fattori di trascrizione specifici di lignaggio^5,6,13. In accordo con i rapporti precedenti, siamo stati in grado di discriminare le cellule P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)e P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) nella linea hESC-MEL1 utilizzata per questo studio (Figura 1). Con questo risultato, abbiamo proceduto alla raccolta di cellule P4 differenziate (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) e cellule pluripotenti P7 (TG30^Hi-GCTM-2^{Hi) per}ulteriori culture negli studi descritti di seguito.

Abbiamo studiato se utilizzando un approccio di selezione negativa potremmo eliminare gli hESC indifferenziati dalle popolazioni cellulari sottoposte a differenziazione molto precoce (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). Abbiamo utilizzato un numero definito di cellule P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) che sono state coltivate consecutivamente dopo facs (Figura 2A) per circa due settimane e rianalizzate utilizzando TG30/GCTM-2 FACS prima di ripiazzarsi in ogni passaggio. I risultati hanno mostrato che la sottofrazione P4 arricchita per i tipi di cellule^{differenziate}TG30 Neg -GCTM-2^Neg dopo il passaging consecutivo, e una presenza minore di cellule P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)al passaggio iniziale(Figura 2A, Passaggio 1) alla fine sono scomparse dopo un ulteriore passaggio, diventando campioni pluripotenti senza cellule staminali(Figura 2A,Passaggio 3).

L'arricchimento delle cellule hESC pluripotenti può essere ottenuto mediante la raccolta di cellule TG30^Hi-GCTM-2^Hi.

Sulla base di osservazioni precedenti che utilizzano questo saggio, ci aspetteremmo un arricchimento di hSESR pluripotenti raccogliendo cellule P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) che dovrebbero formare colonie hESC. Pertanto, abbiamo anche studiato la passaging consecutiva mediata da TG30/GCTM-2 FACS di celle pluripotenti P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). In queste colture P7, l'immunoprofiling FACS TG30/GCTM-2 è stato eseguito prima di ripiaggiare le cellule ad ogni passaggio e solo le cellule P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) sono state ricolcolture. In questo modo, abbiamo osservato che la maggior parte delle cellule si trovava nelle sottofrazioni associate alla pluripotenza (P6 e P7), indicando un arricchimento di cellule pluripotenti che mantenevano anche la capacità di differenziare e generare una piccola percentuale di cellule P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)(Figura 3A). Inoltre, le colture di cellule P7 hanno mostrato un gran numero di colonie simili a hESC durante la passaging (Figura 3B), indicando anche il mantenimento dello stato di pluripotenza.

Figura 1. Strategia di ordinamento rappresentativa per ottenere le sottofrazioni FACS TG30/GCTM-2. (A): Le sospensioni cellulari hES dissociate sono ordinate come singole celle e i potenziali grumi o doppietti vengono gated con la dispersione in avanti per altezza e area (FSC-H e FSC-A). B): I potenziali detriti vengono rimossi con FSC-A e SSC-A e solo le cellule intatte vengono ulteriormente ordinate. C): Le cellule non disponibili sono escluse sulla base della fluorescenza propidio ioduro (PI) (FSC-A e FL3-A). D): Le celle dell'alimentatore MEF sono state gategate dalla selezione negativa basata sull'espressione del mouse CD90.2-PE (FL2-A e SSC-A). E): La frazione hESC isolata, priva di alimentatori MEF, viene infine frazionata in sottopopolazioni P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg),P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low),P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid)e P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). Il gate negativo (TG30^Neg-GCTM-2^Neg, chiamato P4) è stato impostato in base all'autofluorescenza di fondo per le cellule non macchiate e anche ai controlli dell'isotipo. (F): Percentuali delle diverse sottopopolazioni gated tipiche di un'analisi citometrica a flusso TG30/GCTM-2. Clicca qui per visualizzare la figura più grande.

Figura 2. Colture consecutive rappresentative di cellule P4 spontaneamente differenziate (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)dalla linea hESC-MEL1. (A): Grafici FACS rappresentativi TG30/GCTM-2 che mostrano sottoinsiemi gated di celle (P4, P5, P6 e P7) discriminati dal livello di espressione rilevata dei marcatori di superficie cellulare TG30 e GCTM-2. Una popolazione iniziale di 400.000 derivati hESC che espongono l'immunoprofiling P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)viene raccolta da colture sfuse della linea hESC-MEL1. Queste cellule P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) vengono passaggi consecutivamente dopo facs in condizioni favorevoli al rinnovo hESC nei contenitori T75, fino a raggiungere la confluenza (11-13 giorni). Prima di ogni passaggio, TG30/GCTM-2 FACS viene eseguito per raccogliere e ricolturare solo i tipi di cellule differenziate P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). B): Morfologia tipica del prato delle cellule differenziate P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)dopo 14 giorni. C): Sporadiche colonie simili a hESC viste dopo 14 giorni mescolate con il prato delle cellule P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) solo al passaggio 1, sono molto probabilmente generate contaminando le cellule P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). Barra di scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare la figura più grande.

Figura 3. Le celle P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) derivate da linee hESC possono essere passaggi consecutivamente dopo facs senza perdere le loro proprietà pluripotenti intrinseche. Immunoprofilazione RAPPRESENTATIVA TG30/GCTM-2 FACS dei diversi passaggi consecutivi, che mostra i sottoinsiemi discriminati di cellule (P4, P5, P6 e P7) in base al livello di espressione di TG30 e GCTM-2. (A): Una popolazione iniziale di 400.000 celle che mostra le caratteristiche P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) viene recuperata dalle colture di massa della linea hESC-MEL1. Le cellule Pluripotenti P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) vengono passaggi consecutivamente dopo facs in condizioni favorevoli al rinnovo hESC nei contenitori T75, fino a raggiungere ~80% di confluenza (9-11 giorni). L'immunoprofiling FACS TG30/GCTM-2 viene eseguito prima di ripiazzarsi le cellule ad ogni passaggio e vengono ricolturate solo le cellule P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). I risultati mostrano che le celle P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) conservano le loro caratteristiche pluripotenti con la successiva passaging, compresa la conservazione dell'espressione (TG30^Hi-GCTM-2^Hi),la formazione di colonie simili a hESC (mostrate in B) e il mantenimento della capacità di differenziare come si può dedurre dalla ricapitolazione di una piccola frazione di P4 differenziato (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) in ciascuno dei gradienti FACS. Barra di scala = 200 μm. Clicca qui per visualizzare la figura più grande.

Campione (volumi di reazione)	Anticorpo primario	Anticorpo secondario	PE Rat Anti-Mouse CD90.2 b	Propidio Ioduro c
Campione di ordinamento (~9 ml per gli AB primari, 2,5 ml per gli OC secondari)	(TG30 + GCTM-2) A	AF 488 capra anti-topo IgG2a + AF 647 capra anti-topo IgM	+	+
Control-1: TG30 (200 μl)	TG30	AF 488 capra anti-topo IgG2a	-	+
Control-2: GCTM-2 (200 μl)	GCTM-2	AF 647 capra anti-topo IgM	-	+
Control-3: CD90.2 anti-mouse (200 μl)	-	-	+	+
Control-4: Ficoerytrina (PE) (200 μl)	Isotipo IgG2a del mouse	R-fichertrina capra anti-topo IgG2a	-	+
Control-5: Isotipo di immunoglobulina del topo (200 μl)	Isotipo IgG2a del mouse + isotipo IgM	AF 488 capra anti-topo IgG2a + AF 647 capra anti-topo IgM	-	+
Control-6: Cellule non macchiate (200 μl)	-	-	-	-

La tabella 1. Ordinare l'esempio e i controlli per l'ordinamento FACS. ^A Il campione di ordinamento è immunosostenibile contemporaneamente agli anticorpi TG30 e GCTM-2. ^b PE-anti-mouse CD90.2 viene utilizzato per riconoscere le celle del mouse e rimuovere i MEF dagli hESC durante FACS¹⁴. ^c Le cellule non disponibili sono escluse mediante ioduro di propidio ad una concentrazione finale di 0,3 μg/ml. Reagente aggiunto (+), non aggiunto (-) al tubo di reazione.

anticorpo	ospite	Isotype	Diluizione di lavoro
TG30 (1,4 mg/ml)	topo	IgG2a	1:1,000
GCTM-2 (supernatante ibridoma)	topo	Igm	1:5 ~ 1:10 a
AF 488 capra anti-topo IgG2a	capra	Policlinico	1:500
AF 647 capra anti-topo IgM	capra	Policlinico	1:500
R-fichererina (PE) capra anti-topo IgG2a	capra	Policlinico	1:1,000
Anti-mouse CD90.2	ratto	IgG2b	1:100
IgG2a del mouse purificato, κ Controllo isotipo	topo	IgG2a	1:200
IgM del mouse purificato, controllo isotipo κ	topo	Igm	1:200

La tabella 2. Dettagli e diluizioni degli anticorpi per lo smistamento FACS. ^{a A} causa dell'espressione estremamente elevata di GCTM-2 sulla superficie cellulare degli hESC non è possibile raggiungere la saturazione con questo anticorpo. Ogni lotto di supernatante ibridoma GCTM-2 deve essere titolato su un controllo standard o su un lotto precedente per ottenere risultati simili con hESC in scala ed evitare una colorazione troppo.

Nome del mezzo	composizione
hESC/KOSR medio	Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) integrato con 20% Knockout Serum Replacement (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% MEM Aminoacidi Non essenziali, 0,1 mM 2-Mercaptoetanolo, 10 ng/ml fattore di crescita dei fibroblasti umani 2 (FGF-2) e Pen/Strep a 1x.
Mef medium	Mezzo aquila modificato di Dulbecco, glucosio alto (DMEM) integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS), 2 mM GlutaMAX e Penna / Strep a 1x.

La tabella 3. Composizione dei mezzi di coltura.

Discussione

Nel contesto clinico, i tipi di cellule somatiche differenziate sono il prodotto finale desiderato per i trapianti e le applicazioni terapeutiche, e l'hPSC è una fonte autorinovo e scalabile per generare quelle cellule somatiche o i loro progenitori in laboratorio. La presenza di hESC residui indifferenziati con un potenziale intrinseco per la formazione di teratoma è un rischio per la sicurezza quando si considerano cellule somatiche derivate da hESC per il trapianto in pazienti. Per una revisione di questo e di altri rischi associati alla terapia cellulare si prega di consultare Sharpe et al. ¹⁶ Pertanto, per realizzare tali applicazioni, è imperativo che i ricercatori mirino a generare popolazioni cellulari bersaglio che siano anche pluripotenti senza cellule staminali. A tal fine, dimostriamo qui che utilizzando la nostra metodologia FACS TG30/GCTM-2 è possibile monitorare la presenza di cellule pluripotenti (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) in una popolazione cellulare differenziante e ottenere derivati differenziati hESC vitali che possono essere arricchiti e ricolturati dopo facs. Sebbene non sia possibile ottenere campioni pluripotenti al 100% senza cellule staminali con un unico passaggio del nostro protocollo, i derivati hESC arricchiti possono essere ricolturati e dopo aver raggiunto la purezza consecutiva delle cellule somatiche al 100%. La dimostrata vitalità delle cellule somatiche per l'espansione post-FACS consente potenzialmente anche la produzione di un numero adeguato di cellule adatte a potenziali terapie di trapianto.

I risultati incoraggianti di questo studio pilota ci hanno spinto a svolgere un'indagine più completa utilizzando il nostro protocollo TG30/GCTM-2 in uno studio comparativo con diverse linee di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC)¹⁵. In quello studio, abbiamo scoperto che campioni pluripotenti privi di cellule staminali ottenuti utilizzando il nostro protocollo FACS TG30/GCTM-2 non generavano teratomi quando trapiantati in topi immuno-privi. Pertanto, possiamo affermare con sicurezza che con l'uso di questo protocollo in vitro, le colture cellulari di differenziazione in fase iniziale determinate per essere libere da cellule pluripotenti TG30^Hi-GCTM-2^Hi non sviluppano teratomi in vivo. Ciò supporta fortemente la robustezza del nostro saggio, fornendo un potenziale approccio per eliminare il rischio di formazione di teratoma prima dell'uso di cellule derivate da hPSC in applicazioni cliniche.

Al contrario, mostriamo anche che il saggio FACS TG30/GCTM-2 può essere utilizzato per recuperare una popolazione cellulare pluripotente con un alto livello di espressione di questi due antigeni di superficie (TG30^Hi-GCTM-2^Hi). Studi precedenti hanno dimostrato che le cellule HI TG30^Hi-GCTM-2^{Hi mostrano} la più alta correlazione con l'espressione oct4^hi e formano il più alto numero di colonie simili a hESC^5,6,13,15. Motiviamo quindi che la rete a pluripotenza viene attivata ai suoi livelli massimi nelle celle di esprimezione TG30^Hi-GCTM-2^Hi. Riteniamo che l'utilizzo del nostro protocollo FACS TG30/GCTM-2 e il recupero di celle P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi)potrebbero consentire la purificazione su larga scala delle colture hESC vive arricchite, come input per i test di differenziazione.

In conclusione, dimostriamo qui la potenzialità dei nostri saggi FACS basati sull'espressione combinata di antigeni di superficie TG30 e GCTM-2 sia per l'eliminazione che per l'arricchimento degli hESC. È probabile che anche gli studi futuri con protocolli per la differenziazione diretta degli hPSC siano informativi riguardo a questa potenzialità. Siamo consapevoli che in alcuni saggi in cui i derivati hESC differenziati esprimono temporaneamente TG30 (CD9) o GCTM-2, questi due anticorpi potrebbero non essere appropriati o sufficienti per eliminare le cellule pluripotenti da una popolazione differenziata in un particolare momento nel saggio⁶. Pertanto, è continuamente necessario trovare nuovi anticorpi che riconoscano specificamente gli HESC vivi per superare la possibile limitazione della reazione incrociata con alcuni tipi di cellule differenziate.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Nome lungo: Dulbecco's Modified Eagle Medium: Miscela di nutrienti F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Nome lungo: Sostituzione del siero knockout
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	Nome lungo: Integratore GlutaMAX
Aminoacidi non essenziali	Life Technologies	11140050	Nome lungo: Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM
Mercaptoetanolo	Life Technologies	21985023	Nome lungo: 2-Mercaptoetanolo
DPBS	Life Technologies	14190250	Nome lungo: Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, senza calcio, senza magnesio
TrypLE Express	Life Technologies	12604039	Nome lungo: TrypLE Express (1x), senza fenolo rosso
AF-488	Life Technologies	A21131	Nome lungo: Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG2a
AF-647	Life Technologies	A21238	Nome lungo: Alexa Fluor 647 capra anti-topo IgM
PE-anti IgG2a	Life Technologies	P21139	Nome lungo: R-Ficoeritrin capra anti-topo IgG2a (γ 2a) Coniugato
DMEM	Life Technologies	11965-092	Nome lungo: Dulbecco's Modified Eagle Pen
/Strep	Life Technologies	15140-122	Nome lungo: Penicillina-streptomicina, acqua
distillata	Life Technologies	15230-089.	Nome lungo: Acqua distillata sterile
PI	SIGMA	P4864	Nome lungo: Soluzione di ioduro di propidio
FBS	SIGMA	12203C	Nome lungo: Gelatina di siero bovino fetale
	SIGMA	G-1890	Nome lungo: Gelatina da pelle suina
FGF-2	umano Millipore	GF003AF-100UG	Nome lungo: Fattore di crescita dei fibroblasti di base, ricombinante umano, senza animali
Filtro 0,22 μ m	Millipore	SCGPU02RE	nome lungo: Stericup-GP, 0.22 μ M, polietersulfone, 250 ml, radiosterilizzato
70 μ m Cell Strainer	Becton Dickinson	352350	Nome lungo: Cell strainer con 70 μ m Maglia di nylon
35 μ m Filtro per cellule con coperchio, provetta da 5 ml	Becton Dickinson	352235	Long Name: Provetta da 5 ml in polistirene a fondo tondo, con tappo per filtro cellulare (35 μ m)
5 ml Provetta in polistirene a fondo tondo	Becton Dickinson	352054	Nome lungo: 5 ml di polistirene provetta a fondo tondo, sterile
Controllo dell'isotipo IgG2a	Becton Dickinson	554126	Nome lungo: Topo purificato IgG2a, κ Controllo dell'isotipo
IgM Controllo dell'isotipo	Becton Dickinson	553472	Nome lungo: IgM di topo purificato, κ Controllo isotipico
PE-CD90.2	Becton Dickinson	553014	Nome lungo: PE Rat Anti-Mouse CD90.2
Calibrazione a 8 picchi	Becton Dickinson	559123	Nome lungo: Arcobaleno Calibrazione Particelle (8 picchi)
Tubo sterile in polipropilene da 50 ml	Greiner Bio-One	227261	Nome lungo: Tubo in polipropilene da 50 ml con fondo conico,
pallone sterile T75	Greiner Bio-One	658175	Nome lungo: CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Palloni
TG30	Merck Millipore	MAB4427	Nome lungo: TG30 Anticorpo, clone TG30
GCTM-2	Merck Millipore	MAB4346	Nome lungo: GCTM-2 non è disponibile in commercio, ma TG343 e l'anticorpo monoclonale equivalente sono
Tabella 4. Elenco dei materiali e del reagente
Macchina FACS	Becton Dickinson		FACSVantage SE con opzione FACSDiva
Microscopio invertito	Olympus		IX71
Tabella 5. Elenco delle attrezzature.