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Articolo metodologico

Whole-cell MALDI-TOF spettrometria di massa è un metodo accurato e rapido per analizzare diverse modalità di attivazione dei macrofagi

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DOI:

10.3791/50926

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26 dicembre 2013

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1Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses Tropicales et Emergentes (URMITE), CNRS UMR 7278, INSERM U1095, Aix Marseille Université, 2Service de médecine interne, post-urgence et thérapeutique, Hôpital de la Timone

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'uso della spettrometria di massa MALDI-TOF a cellula intera su cellule eucariotiche. Qui, illustriamo l'accuratezza di questa tecnica analizzando gli stati di attivazione multipli dei macrofagi in risposta al loro microambiente.

Abstract

MALDI-TOF è una tecnica di spettrometria di massa ampiamente utilizzata in chimica e biochimica. È stato anche applicato in medicina per identificare molecole e biomarcatori. Recentemente, è stato utilizzato in microbiologia per l'identificazione di routine di batteri cresciuti da campioni clinici, senza fasi di preparazione o frazionamento. Noi e altri abbiamo applicato con successo questa tecnica di spettrometria di massa MALDI-TOF a cellula intera alle cellule eucariotiche. Le applicazioni attuali spaziano dall'identificazione del tipo di cellula al controllo di qualità, alla valutazione delle colture cellulari e alle applicazioni diagnostiche. Qui, descriviamo il suo utilizzo per esplorare i vari fenotipi di polarizzazione dei macrofagi in risposta a citochine o batteri uccisi dal calore. Ha permesso l'identificazione di impronte digitali specifiche dei macrofagi che sono rappresentative della diversità delle risposte proteomiche dei macrofagi. Questa applicazione illustra l'accuratezza e la semplicità del metodo. Il protocollo qui descritto può essere utile per studiare la risposta immunitaria dell'ospite in condizioni patologiche o può essere esteso ad applicazioni diagnostiche più ampie.

Introduzione

La spettrometria di massa a tempo di volo con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice (MALDI-TOF MS) è una tecnica di spettrometria di massa popolare per studiare campioni biologici. L'utilizzo di un raggio laser e di una matrice ad assorbimento di energia consente un processo di ionizzazione morbida: l'evaporazione e la genesi di grandi biomolecole per lo più a carica singola. Questo processo è chiamato desorbimento/ionizzazione, giustificando l'acronimo MALDI. Questi ioni vengono poi accelerati mediante applicazione di tensione ed entrano in un analizzatore TOF che permette la separazione di questi ioni e la quantificazione delle rispettive masse1.

MALDI-TOF MS è stato ampiamente utilizzato in biologia, chimica e medicina per identificare molecole e biomarcatori2-4 o per monitorare le modifiche post-traduzionali su proteins5,6. Recentemente, diversi gruppi hanno applicato la MALDI-TOF MS all'identificazione di microrganismi da campioni clinici7,8. Questa applicazione microbiologica è ora utilizzata di routine in ambito clinico. MALDI-TOF a celle intere presenta molti vantaggi rispetto alle applicazioni classiche di MALDI-TOF MS. I campioni contenenti cellule intere vengono processati direttamente, evitando lunghe fasi di frazionamento o separazione di grandi quantità di materiale. Inoltre, non è necessaria alcuna caratterizzazione dei vari picchi: l'intero spettro è considerato come un'impronta digitale del campione, e gli algoritmi di corrispondenza confrontano lo spettro testato con un database di spettri di riferimento.

Noi e altri abbiamo applicato questa tecnica di analisi dell'intera cellula alle cellule eucariotiche. Molte applicazioni possono essere derivate da questa tecnica: (1) identificare i principali tipi di cellule da un campione misto9-11; (2) valutare la vitalità delle colture cellulari nel tempo (comprese le applicazioni industriali di controllo qualità)12; (3) monitorare gli stati di attivazione di una singola cellula di tipo13; (4) valutare la trasformazione maligna di un campione clinico14,15.

Qui, descriviamo l'uso di MALDI-TOF MS a cellula intera per esplorare i vari fenotipi di polarizzazione dei macrofagi in risposta a citochine o batteri uccisi dal calore. I macrofagi svolgono un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria ai patogeni microbici. Rilevano gli agenti infettivi nei tessuti attraverso recettori di riconoscimento dei modelli in grado di rilevare i modelli microbici conservati, come il lipopolisaccaride (LPS)16. I macrofagi sono cellule professionali che presentano l'antigene che interagiscono con le cellule T per montare la risposta immunitaria adattativa. Le cellule T influenzano i macrofagi rilasciando citochine che rafforzano o regolano l'attività microbicida dei macrofagi. Per analogia con la polarizzazione dei linfociti Th1/Th2, i macrofagi infiammatori, microbicidi e tumoricidi sono stati classificati in macrofagi M1 e i macrofagi immunoregolatori come macrofagi M217-19. Con il termine M1 si intende la classica attivazione dei macrofagi da parte di citochine di tipo I, come l'interferone (IFN)-γ e il fattore di necrosi tumorale (TNF), o di prodotti batterici, come LPS18,20-23, mentre i macrofagi attivati da vie alternative (interleuchina (IL)-4, IL-10, Transforming Growth Factor-β1 sono considerati macrofagi M219,24,25. L'elevata plasticità fenotipica e funzionale dei macrofagi in risposta al loro microambiente rende questi macrofagi utili per analizzare sottili cambiamenti con un approccio MALDI-TOF MS.

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Protocollo

Nel presente protocollo, la tecnica MALDI-TOF a cellula intera viene utilizzata per ottenere uno spettro di massa considerato come un'impronta digitale del campione. Un'analisi bioinformatica ha permesso il confronto e la classificazione di queste impronte digitali. Questo protocollo prevedeva tre parti principali:

  1. La preparazione dei campioni biologici: controllo dei macrofagi e dei macrofagi stimolati con diversi agonisti.
  2. L'analisi di ogni tipo di campione con repliche tecniche mediante MALDI-TOF MS a cellula intera.
  3. L'analisi bioinformatica dei dati grezzi.

Prepara soluzioni sterili per l'isolamento e la coltura cellulare. Preparare e conservare tutti i reagenti a 4 °C

1. Preparazione di monociti umani

  1. Preparare il terreno di coltura cellulare. Aggiungere 55 ml di siero umano AB+ o siero fetale bovino (FBS) e 5 ml di soluzione antibiotica (penicillina a 10.000 UI/ml e streptomicina a 10.000 μg/ml; concentrazione finale di 100 UI/ml per la penicillina e 100 μg/ml per la streptomicina) al terreno RPMI 1640 (500 ml).
    1. Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dai leucopacks (concentrati di leucociti).
      1. Preparare tubi da 50 ml contenenti 15 ml di Ficoll. Diluire il sangue in soluzione salina (vol/vol, 1/10). Depositare 30 ml di PBMC diluiti su Ficoll come descritto in precedenza26.
      2. Centrifugare a 700 x g per 20 min. Recuperare le PBMC all'interfaccia tra Ficoll (densità di 1,077 g/ml) e plasma diluito. Diluire le PBMC in terreno di coltura e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
    2. Preparare monociti CD14+ da PBMC utilizzando biglie magnetiche rivestite con anticorpi anti-CD14.
      Nota: Conservare i prodotti e le cellule a 4 °C fino all'ottenimento dei monociti.
      1. Preparare il tampone di corsa costituito da soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) pH 7,2, albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5% e acido etilendiamminotetraacetico 2 mM (EDTA).
      2. Dissociare delicatamente le PBMC pellettate (10,7 cellule per saggio) in 80 μl di tampone di corsa.
      3. Aggiungere 20 μl di microsfere CD14 alle PBMC. Mescolare e incubare le PBMC per 15 minuti. Lavare le PBMC con 5 ml di tampone di scorrimento e centrifugare a 300 x g per 5 minuti. Dissociare delicatamente le PBMC pellettate in 500 μl di tampone di corsa per 108 PBMC.
        Nota: utilizzare 500 μl di tampone di funzionamento per concentrazioni di PBMC inferiori a 108 PBMC.
      4. Procedi alla separazione magnetica.
        Nota: per meno di 2 x 108 PBMC, utilizzare la colonna MS; per più di 2 x 108 PBMC e meno di 2 x 109 PBMC, utilizzare la colonna LS.
      5. Sciacquare la precolonna e la colonna con il tampone di scorrimento (500 μl per la colonna MS o 3 ml per la colonna LS). Aggiungere le PBMC nella precolonna (attendere che le celle non etichettate passino attraverso la colonna). Risciacquare 3 volte con il tampone di scorrimento (500 μl per la colonna MS o 3 ml per la colonna LS). Rimuovere la precolonna.
      6. Posizionare la colonna su provette da 15 ml. Aggiungere il tampone di corsa (1 ml per la colonna MS o 5 ml per la colonna LS) sulla colonna ed eluire le cellule CD14+ applicando una pressione sulla colonna.
      7. Centrifugare l'eluato a 300 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante. Lavare il pellet di monociti con 10 ml di terreno di coltura.
        Nota: analizzare la purezza della preparazione dei monociti utilizzando anticorpi anti-CD14 e citometria a flusso (classicamente superiore al 95%).
  2. Differenziazione dei monociti in macrofagi.
    1. Incubare i monociti (10-6 monociti per pozzetto in piastre a 6 pozzetti) in 3 ml di terreno di coltura contenente il 10% di siero umano AB+ a 37 °C. Dopo 4 giorni, sostituire il terreno di coltura contenente siero umano con 3 ml di terreno di coltura contenente il 10% di FBS per altri 3 giorni.
    2. Identificare la popolazione cellulare ottenuta come macrofagi derivati da monociti (MDM) mediante citometria a flusso (vedi Figura 1).
      1. Sostituire il terreno di coltura con 3 ml di PBS. Raschiare gli MDM con un poliziotto di gomma e raccogliere le sospensioni MDM. Centrifugare a 400 x g per 5 min. Aggiungere PBS contenente il 2% di BSA agli MDM pellettati e agitare delicatamente la sospensione cellulare. Regolare la concentrazione cellulare (10-6 MDM in 200 ml di PBS) e incubare a 4 °C.
      2. Aggiungere 10 ml di anticorpi anti-CD14 e 10 ml di anticorpi anti-CD68 alla sospensione MDM e incubare a 4 °C per 20 minuti al buio.
        Nota: questi anticorpi devono essere marcati con due diversi fluorocromi coerenti con l'analisi di citometria a flusso. Ad esempio, gli anticorpi anti-CD14 possono essere coniugati con ficoeritrina accoppiata (per la colorazione dei monociti) e gli anticorpi anti-CD68 con Alexa Fluor 647 accoppiato (per la colorazione dei macrofagi).
      3. Centrifugare gli MDM a 400 x g per 5 minuti. Rimuovere i surnatanti. Dissociare delicatamente il pellet cellulare e incubare gli MDM in 250 ml di paraformaldeide al 3% (PFA) per 15 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare MDM fissati con PFA a 400 x g per 5 min. Lavare gli MDM con 3 ml di PBS e centrifugare gli MDM a 400 x g per 5 minuti. Dissociare delicatamente il pellet MDM in 400 ml di PBS.
      4. Analizzare la differenziazione dei monociti (che esprimono CD14 ma non CD68) in monociti (che esprimono CD68 ma non CD14). Nota: classicamente più del 95% delle cellule sono MDM.
  3. Stimolazione di MDM per 18 ore.
    1. Sostituire il terreno di coltura degli MDM aderenti con un terreno di coltura fresco da 3 ml (contenente il 10% di FBS).
    2. Per indurre una polarizzazione M1 o M2, utilizzare le seguenti citochine ricombinanti umane: IFN-γ e TNF per la polarizzazione M1 e IL-4 per la polarizzazione M2. I macrofagi M1 si ottengono anche mediante stimolazione con LPS. Si noti che le soluzioni madre di citochine si conservano a -80 °C e che la soluzione madre di LPS si conserva a -20 °C.
      1. Diluire la soluzione madre di IFN-gγ (1 mg/ml) a 1/100 in terreno di coltura per ottenere una diluizione di 10 ng/ml. Aggiungere 6 μl di questa diluizione di IFN-γ agli MDM per ottenere una concentrazione finale di IFN-γ di 20 ng/ml.
      2. Diluire la soluzione madre di TNF (1 mg/ml) a 1/100 in terreno di coltura per ottenere una diluizione di 10 ng/ml. Aggiungere 6 μl di questa diluizione di TNF agli MDM per ottenere una concentrazione finale di TNF di 20 ng/ml.
      3. Diluire la soluzione madre di IL-4 (1 mg/ml) a 1/100 in terreno di coltura per ottenere una diluizione di 10 ng/ml. Aggiungere 6 μl di questa diluizione di IL-4 agli MDM per ottenere una concentrazione finale di IL-4 di 20 ng/ml.
      4. Aggiungere 3 μl della soluzione madre di LPS (1 mg/ml) agli MDM per ottenere una concentrazione finale di LPS di 1 μg/ml.
    3. Per stimolare gli MDM con i batteri, utilizzare batteri uccisi dal calore. Lavare i batteri vivi con PBS e riscaldarli a 95 °C per 1 ora. Utilizzare Orientia tsutsugamushi (ceppo Kato (CSUR R163), Mycobacterium bovis (Bacillus Calmette-Guérin, BCG CIP ceppo 671203) e Coxiella burnetii (Nine Mile in fase I) erano perché questi agenti patogeni sono noti per infettare i macrofagi. Quindi, preparare una sospensione di O. tsutsugamushi a 109 batteri/ml. Aggiungi 50 μl agli MDM. Ripetere lo stesso passaggio per M. bovis e C. burnetii.
  4. Preparazione di campioni biologici per MALDI-TOF MS.
    1. Lavare MDM stimolati con PBS senza Ca2+ o Mg2+ (le cellule possono agglutinare in presenza di Ca2+ o Mg2+). Raschiare gli MDM con un poliziotto di gomma e raccogliere le sospensioni MDM. Centrifugare gli MDM. Lavare nuovamente gli MDM in PBS senza Ca2+ o Mg2+ a 400 x g per 5 minuti per eliminare la contaminazione da FBS.
    2. Regolare la concentrazione cellulare (2 x 106 MDM per saggio). Centrifugare gli MDM a 400 x g per 5 minuti e scartare i surnatanti. Raccogliere i pellet cellulari in 20 μl di PBS senza Ca2+ o Mg2+.
    3. Analizzare immediatamente i campioni o conservarli in PBS a -80 °C prima dell'analisi.

2. Analisi dei macrofagi mediante MS Maldi-TOF a cellula intera

  1. Preparazione della matrice CHCA.
    1. Aggiungere 500 μl di acetonitrile, 250 μl di acido trifluoroacetico al 10% e 250 μl di acqua per cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) in una fiala. Diluire 10 mg di CHCA in questa soluzione fino a una concentrazione finale di 10 mg/ml. Mescolare e sonicare per almeno 20 min.
      Nota: la sonicazione migliorerà la saturazione della matrice, ma questo passaggio non è obbligatorio.
    2. Centrifugare a 13.000 x g per 5 min. Scartare il pellet e conservare il surnatante.
      Nota: preparare la soluzione della matrice appena prima dell'uso. Una soluzione di matrice che contiene cristalli non consente una buona ionizzazione delle molecole del campione, e questo può influire sulla qualità degli spettri.
  2. Preparazione del bersaglio in acciaio MALDI.
    1. Inumidire il bersaglio in acciaio lucido con acqua calda del rubinetto. Strofinare con carta per salviette di precisione. Aggiungere il 70% di etanolo e strofinare. Risciacquare con acqua strofinando. Aggiungere il 70% di etanolo e strofinare con carta di precisione.
    2. Immergere il bersaglio in etanolo al 70% e sonicare per almeno 15 minuti. Coprire il bersaglio con 500 μl in 1 ml di acido trifluoroacetico all'80%. Strofinare e pulire con carta di precisione. Risciacquare con acqua HPLC senza strofinare. Asciugare il bersaglio a temperatura ambiente.
      Nota: un target pulito in modo improprio può influire sulla qualità degli spettri.
  3. Preparazione dei depositi.
    1. Posizionare il bersaglio pulito su un supporto orizzontale e livellato per ottenere depositi uniformi.
    2. Scongelare delicatamente i campioni MDM con ghiaccio. Nota: uno scongelamento rapido e vigoroso può alterare i campioni, compromettendo così la qualità degli spettri. Omogeneizzare gli MDM (pipettando avanti e indietro la sospensione cellulare) prima della deposizione di 1 μl (contenente circa 1 x 105 cellule) sul bersaglio MALDI. Aggiungere 1 μl della soluzione di matrice MALDI sul campione. Evitare di mescolare il punto con la pipetta. La miscelazione dei punti con le pipette altera la qualità degli spettri. Deporre 12-16 campioni/saggio (repliche tecniche).
    3. Evaporare spontaneamente a temperatura ambiente. Nota: l'evaporazione avviene gradualmente e porta alla formazione di cristalli di matrice/campione. I depositi possono essere immediatamente analizzati o conservati al buio per diversi giorni prima dell'analisi (fino a 2 settimane).
    4. L'utente deve controllare che le citochine o i batteri uccisi dal calore utilizzati nell'esperimento non forniscano picchi all'interno dell'intervallo degli spettri dei macrofagi stimolati. Qui, abbiamo verificato che le citochine e i batteri uccisi dal calore da soli non fornivano alcun segnale all'interno dell'intervallo studiato (0-20 kDa).
  4. Messa a punto con spettrometro di massa e acquisizione dati.
    1. Inserire il bersaglio in acciaio contenente i campioni nello spettrometro di massa.
    2. Configura lo spettrometro di massa ed esegui l'acquisizione dei dati. Utilizzare la configurazione predefinita per l'acquisizione automatica dei dati.
    3. Nota: una panoramica dettagliata della configurazione del software flexControl è riportata nell'appendice/Tabella 1. Questo può variare a seconda dello spettrometro di massa e del software utilizzato.

3. Analisi bioinformatica

Nota: l'analisi bioinformatica è stata eseguita utilizzando il software di analisi statistica gratuito e open source R, insieme a librerie di analisi specifiche (MALDIquant). R può essere scaricato gratuitamente dal suo sito web http://cran.r-project.org/. Una descrizione dettagliata dello script è fornita come materiale supplementare.

  1. Caricamento e pretrattamento dei dati grezzi.
    1. Memorizza i dati grezzi sul computer associato allo spettrometro di massa in più file e cartelle. Recuperare la cartella radice dell'esperimento con tutte le sottocartelle. Copia la cartella principale sul personal computer per l'analisi.
    2. Utilizzate le librerie readBrukerFlexData e MALDIquant per caricare e analizzare i dati grezzi.
      Nota: readBrukerFlexData consente il caricamento di dati grezzi dallo spettrometro di massa in un oggetto specifico in R per ulteriori analisi. Per ulteriori informazioni, vedere la descrizione di MALDIquant 27.
    3. Analizza gli spettri generati.
      Nota: ogni spettro è costituito da un elenco di picchi con le rispettive masse e intensità (abbondanza relativa). Utilizzare la radice quadrata delle intensità per migliorare la visualizzazione grafica degli spettri. Correggere lo sfondo utilizzando un algoritmo di peak-clipping non lineare sensibile alle statistiche per la stima della linea di base27. Utilizzare un rapporto segnale/rumore di 6 per rilevare i picchi. Si consideri che i picchi rilevati sono simili tra gli spettri quando i valori di massa/carica (m/z) rientrano in una finestra di 2.000 ppm.
  2. Definizione e calcolo del punteggio. Classificare gli spettri utilizzando un clustering gerarchico con un algoritmo di reparto per l'agglomerazione e una matrice di dissimilarità basata sulla distanza di Jaccard.
    Nota: l'indice di Jaccard misura la somiglianza tra i set di campioni booleani (cioè la presenza/assenza di un elenco di picchi).
  3. Confronto tra spettri e osservazione.
    1. Analizza i grafici degli spettri grezzi. Nota: l'asse x rappresenta il rapporto m/z (in Dalton) e l'asse y rappresenta l'intensità (abbondanza relativa).
    2. Valutare la somiglianza tra gli spettri mediante clustering gerarchico. Rappresentano la somiglianza (o divergenza) come dendrogramma.
    3. Valutare la riproducibilità mediante la rappresentazione virtuale in gel-view. Nota: la rappresentazione virtuale gel-view è un grafico della mappa di calore modificato in cui l'abbondanza relativa è codificata a colori con intensità crescenti di blu.

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Risultati

L'obiettivo del presente protocollo è dimostrare l'accuratezza della spettrometria di massa MALDI-TOF su cellule intere per valutare la risposta dei macrofagi al loro microambiente.

Figura 1 descrive la preparazione di macrofagi stimolati da campioni di sangue. Figura 2 rappresenta l'analisi di monociti e MDM mediante citometria a flusso. Si noti che i monociti esprimevano CD14 ma non CD68 (Figura 1A). Al contrario, gli MDM esprimevano CD68 ma...

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Discussione

Questo protocollo descrive l'uso di MALDI-TOF-MS su cellule intere eucariotiche. Qui, illustriamo l'accuratezza del metodo analizzando i molteplici stati di attivazione dei macrofagi in risposta al loro microambiente.

Il successo del protocollo si basa su pochi passaggi critici. Innanzitutto, qualsiasi contaminante in soluzione può alterare gli spettri. Ad esempio, è importante lavare le cellule nella PBS per rimuovere il terreno di coltura e le proteine del siero prima della deposizione sul b...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare. RO, JLM e CC sono inventori di un brevetto internazionale WO 2011/154650, denominato "Procédé d'identification de cellules de mammifères par spectrométrie de masse MALDI-TOF".

Ringraziamenti

Richard Ouedraogo è supportato da una sovvenzione del Ministère de la Santé (PHRC 2010). Ringraziamo Laurent Gorvel, Christophe Flaudrops e Nicolas Amstrong per l'assistenza tecnica.

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Riferimenti

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