Il trapianto cellulare rappresenta una strategia per il trattamento della degenerazione retinica caratterizzata dalla perdita di fotorecettore. Qui descriviamo un metodo per l'arricchimento dei fotorecettori trapiantabili e il loro innesto subretinale in topi adulti.
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Articolo metodologico
Trapianto subretinale di cellule precursori del fotorecettore purificato MACS nella retina del topo adulto
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La compromissione della vista e la cecità dovute alla perdita delle cellule che percepiscono la luce della retina, cioè dei fotorecettori, rappresentano la ragione principale della disabilità nei paesi industrializzati. La sostituzione dei fotorecettori degenerati con il trapianto di cellule rappresenta una possibile opzione di trattamento nelle future applicazioni cliniche. Infatti, recenti studi preclinici hanno dimostrato che i fotorecettori immaturi, isolati dalla retina neonatale del topo al giorno 4 postnatale, hanno il potenziale per integrarsi nella retina del topo adulto dopo il trapianto subretinale. Le cellule donatrici hanno generato una morfologia fotorecettori matura che include segmenti interni ed esterni, un corpo cellulare rotondo situato nello strato nucleare esterno e terminali sinaptici in prossimità delle cellule bipolari endogene. In effetti, recenti rapporti hanno dimostrato che i fotorecettori dei donatori si integrano funzionalmente nei circuiti neurali dei topi ospiti. Per una futura applicazione clinica di tale approccio di sostituzione cellulare, le sospensioni purificate delle cellule scelte devono essere generate e posizionate nella posizione corretta per una corretta integrazione nell'occhio. Per l'arricchimento dei precursori del fotorecettore, lo smistamento dovrebbe basarsi su specifici antigeni di superficie cellulare per evitare la modifica genetica delle cellule donatrici da parte dei reporter. Qui mostriamo lo smistamento cellulare associato al magnetico (MACS) - arricchimento dei precursori del fotorecettore a bastone trapiantabile isolati dalla retina neonatale di topi reporter specifici del fotorecettore basati sul marcatore di superficie cellulare CD73. L'incubazione con anticorpi anti-CD73 seguita da anticorpi secondari coniugati con micro-perline ha permesso l'arricchimento dei precursori del fotorecettore dell'asta da parte del MACS a circa il 90%. Rispetto alla citometria a flusso, MACS ha il vantaggio che può essere più facile da applicare agli standard GMP e che elevate quantità di cellule possono essere ordinate in brevi periodi di tempo relativi. L'iniezione di sospensioni cellulari arricchite nello spazio subretinale dei topi adulti di tipo selvatico ha comportato un tasso di integrazione 3 volte superiore rispetto alle sospensioni cellulari nonsortite.
Introduzione
La visione è uno dei sensi primi degli umani. La compromissione di questo senso e della cecità sono una delle principali ragioni della disabilità nei paesi industrializzati. La causa predominante di compromissione della vista o cecità è la degenerazione retinica, caratterizzata da perdita cellulare fotorecettore, in quanto può essere osservata nella degenerazione maculare, retinite pigmentosa, distrofia conica-asta e altre condizioni. Ad oggi, non è disponibile una terapia efficace per ripristinare la visione persa. Nel 2006 e nel 2008 due diversi laboratori hanno riportato, indipendenti l'uno dall'altro, un trapianto riuscito di cellule precursori del fotorecettore di bastone in retine di topi adulti di tiposelvatico 1,2. Così, derivante dalla possibilità di trapianto di cellule precursori del fotorecettore anche in una retina degenerata, per sostituire i fotorecettori degenerati e ripristinare la visione. Infatti, è stato dimostrato di recente che tali cellule precursori fotorecettori trapiantate suscitano criteri morfologici di fotorecettori maturi di tipo selvatico, come i segmentiesterni 3adeguatamente sviluppati, terminali sinaptici in prossimità di cellule bipolari endogene e un corpo cellulare rotondo situato nello stratonucleare esterno 2-4,nonché la capacità di integrarsi funzionalmente nel circuito neurale ospite5-7. Uno dei principi principali di questa strategia è l'uso della retina dei giovani topi postnatale giorno 4 (PN 4, PN0 è definita come giorno di nascita), con conseguente miscela di diversi tipi di cellule per il trapianto. Sullo sfondo di una futura applicazione terapeutica, questa miscela deve essere purificata per le cellule precursori del fotorecettore. CD73 è stato descritto come il primo marcatore di superficie cellulare specifico per i giovani fotorecettori nella retina8-10. Qui, dimostriamo un metodo di purificazione delle cellule precursori del fotorecettore basato su questo marcatore di superficie cellulare e con l'uso della tecnica macs (magnetic-associated cell sorting). MACS potrebbe avere vantaggi rispetto alle tecniche di smistamento delle celle attivate fluorescentmente, a causa dei tempi di smistamento rapidi e della più facile regolazione delle condizioni GMP. Potremmo dimostrare un arricchimento di ~ 90% e un tasso di integrazione fino a 3 volte superiore quando trapiantiamo la popolazione arricchita nello spazio subretinale nelle retine adulte di tipo selvatico. Pertanto, l'arricchimento cellulare precursore del fotorecettore basato su MACS e il trapianto subretinale sono tecniche affidabili e promettenti per lo sviluppo di una strategia terapeutica rigenerativa per il trattamento della degenerazione retinica.
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Protocollo
Uso etico e cura degli animali dichiarazione:
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in stretta conformità con le leggi dell'Unione Europea e della Germania (Tierschutzgesetz) e hanno aderito alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e della visione. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico animale della TU Dresda e della Landesdirektion Dresden (numero di approvazione: 24D-9168.11-1/2008-33).
1. Prima di iniziare la dissociazione cellulare e l'ordinamento cellulare
- Etichettare tre tubi di reazione da 15 ml con: Lavaggio (W), Frazione positiva (+) e Frazione negativa (-).
2. Dissociazione della retina
- Decapitare i cuccioli PN 4 usando una forbice.
- Risciacquare la testa dei cuccioli poco dopo nel 70% di etanolo seguito dal lavaggio in PBS.
- Trasferire la testa in HBSS freddo ed enucleare l'occhio (ripetere questo passaggio per tutte le teste). Per enucleare, aprire le palpebre e fissare l'occhio con forcep curve nella regione del nervo ottico. Quindi tira l'occhio con attenzione fuori dall'orbita.
- Dopo aver enucleato tutti gli occhi, isolare la retina: introdurre una forbice chiusa nel nervo ottico e aprire le lame. Sbirciare l'RPE/chorid out. Rimuovere le lenti e i vasi sanguigni utilizzando forcep curve.
- Trasferire le retine isolate in un tubo di reazione da 1,5 ml contenente la soluzione di papaina (fornita dal kit di dissociazione della papaina).
- Incubare le retine nella soluzione di papaina per 30-60 minuti in un bagno d'acqua o shaker (400 giri/min) a 37 °C.
- Mentre le retine incubano nella soluzione di papaina, pipetta 1 ml di soluzione ovomucoide in un tubo di reazione da 15 ml (etichetta "1").
- Aggiungere 60 μl di DNasi I (10 mg/ml) + 60 μl di soluzione ovomucoide (fornita dal kit) + 520 μl di EBSS in un tubo di reazione da 15 ml (etichetta "2").
- Dopo l'incubazione della papaina, trasferire la soluzione di papaina contenente le retine parzialmente digerite nel tubo di reazione "2".
- Utilizzando una pipetta lucida antincendio, eseguire la dissociazione meccanica (10 volte su e giù).
- Pipettare la sospensione a cella singola al tubo di reazione "1". Prova a generare 2 strati strati stratificando delicatamente la sospensione cellulare sopra la soluzione ovomucoide.
- Centrifuga per 5 min a 300 x g (circa 1.300 giri/min).
- Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 500 μl di tampone MACS.
3. Ordinamento delle celle mediante MACS (Magnetic Associated Cell Sorting)
- Aggiungere anticorpo anti-CD73 del ratto X μl a 500 μl per ottenere una concentrazione finale di 10 μg/ml.
- Incubare 5 minuti sul ghiaccio.
- Riempire il tubo di reazione da 15 ml a 10 ml con tampone MACS e centrifugarlo per 5 minuti ad una velocità di 300 x g.
- Rimuovere il supernatante.
- Rimpiorsi il pellet in tampone MACS da 480 μl e aggiungere 120 μl di microperline IgG di capra anti-ratto.
- Incubare 15 minuti sul ghiaccio; non agitarlo, scuoterlo o mescolarlo.
- Riempire il tubo di reazione da 15 ml a 5 ml con tampone MACS e centrifugarlo per 5 minuti a 300 x g.
- Poiché il tubo di reazione è stato centrifugato:
- Regolare una colonna LS nel supporto magnetico.
- Mettere il filtro di preseparazione sopra la colonna LS.
- Idratare il filtro di preseparazione e la colonna LS con tampone MACS da 3 ml e raccogliere il tampone MACS nel tubo di lavaggio (W).
- Rimuovere il supernatante.
- Rimosi il pellet in tampone MACS da 500 μl.
- Caricare la sospensione cellulare da 500 μl sul filtro, quindi aggiungere 1 ml di tampone MACS al filtro e raccogliere la frazione negativa nel tubo di reazione della frazione negativa (-).
- Aggiungere quindi 3 x 3 ml di buffer MACS alla colonna per lavare via le celle non associate alla colonna
- Una volta che questi 9 ml sono attraverso la colonna LS, rimuovere la colonna dal supporto magnetico e installarla sopra il tubo di reazione della frazione positiva (+).
- Caricare rapidamente 5 ml di buffer MACS nella colonna LS e mettere lo stantuffo nella colonna LS e premerlo verso il basso fino a quando l'intero buffer non passa attraverso la colonna.
- Centrifugare il tubo di reazione contenente la frazione positiva per 5 min a 300 x g.
- Rimuovere il supernatante, resuspend in 500 μl di tampone MACS e mantenere a 4 °C.
- Contare la quantità totale di celle utilizzando un dispositivo comune di conteggio delle celle.
- Preparare una sospensione cellulare dalla frazione ordinata positiva contenente 2 x 105 celle/μl nel buffer MACS e mantenerla a 4 °C
4. Trapianto di cellule precursori fotorecettore ordinate da MAC nella retina del topo
- Assicurarsi di avere tutte le seguenti soluzioni pronte: 1 ml di PBS sterile o HBSS, 10 μl DNAse I, 1-2 ml sterile deionizzato H2O, aliquote delle frazioni di sospensione cellulare a 4 °C.
- Anestetizzare il topo adulto (cioè 2-4 mesi)con un'iniezione intraperitoneale di cloridrato di medetomidina (0,01 mg/10 g di peso corporeo), chetamina (0,75 mg/10 g di peso corporeo). Quindi fare un'iniezione sottocutanea di Buprenorfina (0,05 mg / kg di peso corporeo) per alleviare il dolore.
- Dilatare gli alunni con un calo di Fenilefrina 2.5%-Tropicamid 0.5%.
- Fissare il mouse nel supporto della testa del mouse e posizionarlo al microscopio stereo.
- Applicare una goccia di gel visidico per evitare l'asciugatura dell'occhio.
- Fare un piccolo foro al confine tra sclera e cornea (rispettivamente ora serrata)usando uno sterile 30 G 1/2 in ago.
- Tagliare un coperchio comune scivolare in piccoli pezzi (circa 5 mm x 5 mm) utilizzando una penna diamanta, posizionare uno di questi pezzi sopra la cornea, consentendo la visualizzazione diretta della retina.
- Sciacquare più volte la siringa microliter presterilizzata con acqua deionizzata.
- Caricare la siringa microliter con 1 μl di sospensione cellulare, dirigere l'ago tangenzialmente attraverso la congiuntiva e la sclera e posizionare sotto controllo visivo nella metà nasale della retina.
- Punzonare delicatamente un foro nella retina fino a raggiungere lo spazio subretinale, iniettare la sospensione cellulare nello spazio subretinale.
- Osservare il distacco bolloso della retina, che dovrebbe essere uniforme, coprendo circa 1/4 dello spazio retinico senza alcun sanguinamento.
- Ritirare delicatamente la siringa, il foro retinica si sigilla automaticamente.
- Sciacquare più volte la siringa del microlitro con acqua deionizzata.
- Rilasciare il mouse dal supporto della testa.
- Svegliare il topo iniettando cloridrato di atipamozolo per invertire l'effetto cloridrato di medetomidina.
- Posizionare il mouse per il tempo di risveglio in una camera calda e scura (circa 25 °C).
- I successivi 2 giorni dopo il trapianto, la buprenorfina (0,05 mg / kg di peso corporeo) deve essere somministrata per iniezione sottocutanea al mattino e al pomeriggio per alleviare il dolore.
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Risultati
Al fine di valutare la capacità dei fotorecettori dell'asta di integrarsi nella retina del mouse, è stata utilizzata una linea di reporter del topo, in cui GFP è guidata dalla cerniera neurale retina leucina (Nrl, Nrl-GFP)promotrice 11. L'Nrl è il primo marcatore dei fotorecettori di aste che inizia la sua espressione all'E12.5 per tutta l'età adulta, consentendo una specifica etichettatura delle cellule fotorecettori dell'asta del donatore.
I cuccioli di PN 4 Nrl-GFP sono stati dec...
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Discussione
Il trapianto subretinale di cellule precursori del fotorecettore rappresenta uno strumento affidabile per ottenere l'integrazione di queste cellule sensibili alla luce nelle retine ospiti innumero significativo 1,2. Ciò potrebbe consentire l'istituzione di una terapia cellulare per il trattamento delle malattie degenerative retiniche in futuro6. La popolazione donatrice di cellule, attualmente isolata dalle retine PN 4, è una miscela di diversi tipi di cellule, da cui solo le cellule precursori del fotorecettore si inte...
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ci piace ringraziare Anand Swaroop per aver fornito topi Nrl-GFP, Jochen Haas per il supporto tecnico e Sindy Böhme ed Emely Lessmann per l'allevamento.
Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): FZT 111 - Center of Regenerative Therapies Dresden, dal CRTD Seed Grant Program, dall'SFB 655 e dal ProRetina e.V. fondazione, il DIGS-BB Graduate Program Dresden e il Fundação para a Ciência e Tecnologia (SFRH/BD/60787/2009)
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema di dissociazione della papaina | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | fornito DNasi I non viene utilizzato nel metodo |
| Ratto purificato anti-topo CD73, clone TY/23 | BD Pharmingen | 550738 | Concentrazione di riserva 0,5 mg/ml |
| Capra Anti-ratto IgG MicroBeads | Miltenyi | 130-048-501 | Volume totale di 2 ml |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Utilizzato per contare il numero totale di cellule |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| HBSS | Gibco | 14025050 | Utilizzato per la dissociazione delle retine |
| Trypan blue | Sigma | Fluka93595 | Utilizzato per contare il numero totale di cellule |
| Vidisic | Dr. Mann Pharma / Andreae-Noris Zahn AG | ||
| Domitor | Pfizer | 76579 | |
| Ketamina 10% | Ratiopharm | 7538843 | |
| Antisedan | Pfizer | 76590 | |
| Fenilefrrina 2,5%-Tropicamid 0,5%Cliniche | universitarie Dresda Farmacia | ||
| Filtri di preseparazione | Miltenyi | 130-041-407 | |
| LS Colonne | Miltenyi | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | |
| Separatore QuadroMACS | Miltenyi | 130-090-976 | |
| Pipetta Pasteur in vetro lucidato a fuoco | Marca | 74777 20 | La pipetta' Le punte devono essere lucidate a fuoco e sterilizzate in autoclave. |
| MACS 15 ml rack per provette | Miltenyi | 130-091-052 | |
| Camera di conteggio cellulare | Carl Roth | T728.1 | |
| Provette sterili da 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
| Leica M651 MSD | Leica | M651 MSD | può essere utilizzato al posto di Olympus SZX10 |
| Olympus SZX10 | può | essere utilizzato al posto di Leica M651 MSD | |
| Stereomicroscopio invertito Olympus CKX41 | Olympus | CKX41 | |
| Cappa per colture cellulari Thermo Scientific MSC-Advance | Thermo Scientific | 51025411 | |
| Provetta di reazione da 1,5 ml | Sarstedt | 727706400 | |
| Provetta di reazione da 2 ml | Sarstedt | 72695 | |
| Eppendorf Centrifuge 5702 | VWR (Eppendorf) | 521-0733 | |
| Supporto per testa di mouse | myNeurolab | 471030 | |
| BD Microlance 3 30 G 1/2 in | BD Pharmingen | 304000 | |
| Siringa da microlitro Hamilton 5 &; l, 75RN | Hamilton | 065-7634-01 | consegnato senza aghi |
| Hamilton RN ago speciale 34 G | Hamilton | 065-207434 | smussato, lunghezza 12 mm |
| Vannas-Tü Forbici a molla bingen - Lame da 5 mm Dritte | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont #7 Pinze - Titanio Biologie | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Penna diamantata | Tools-tech | ||
| 15 mm x 15 mm Vetrini coprioggetti | Scintille | MIC3366 |
Riferimenti
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- Lee, M. Y., Lufkin, T. Development of the "Three-step MACS": a novel strategy for isolating rare cell populations in the absence of known cell surface markers from complex animal tissue. J. Biomol. Tech. 23, 69-77 (2012).
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Ristampe e permessi
