Quantitative Microscopia ottica: Misura di Biofisica Cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard

Sommario

Descriviamo l'uso di un microscopio ottico standard per eseguire misurazioni quantitative della massa, del volume e della densità cellulare attraverso una combinazione di immagini in campo chiaro e contrasto interferenziale differenziale.

Abstract

Descriviamo l'uso di un microscopio ottico standard effettuare misurazioni quantitative di massa, volume e densità su campioni cellulari attraverso una combinazione di campo luminoso e interferenze immaginario contrasto differenziale. Due approcci principali sono presentati: noninterferometric microscopia fase quantitativa (NIQPM), effettuare misurazioni di massa cellulare totale e la distribuzione subcellulare densità e trasformata di Hilbert differenziale microscopio a contrasto di interferenza (HTDIC) per determinare il volume. NIQPM si basa su un modello semplificato di propagazione delle onde, chiamata approssimazione parassiale, con tre ipotesi di base: bassa apertura numerica (NA), illuminazione, diffusione deboli e debole assorbimento della luce da parte del campione. Fortunatamente, i campioni cellulari non colorati soddisfano questi presupposti e bassa illuminazione NA è facilmente raggiunti nei microscopi commerciali. HTDIC viene utilizzato per ottenere informazioni volumetrico da tramite a fuoco DIC immagini ad alta illumin NAcondizioni di cooperazione. Illuminazione elevata NA agevola la massima sezionamento del campione lungo l'asse ottico. Trasformata di Hilbert di elaborazione dell'immagine DIC su pile migliora notevolmente algoritmi di rilevamento del bordo per la localizzazione dei bordi del provino in tre dimensioni separando i valori di grigio di intensità campione da quelli dello sfondo. I vantaggi principali di NIQPM e HTDIC laici nella loro accessibilità tecnologica con microscopi "off-the-shelf". Ci sono due limiti fondamentali di questi metodi: slow z-stack tempo di acquisizione in ambiti commerciali attualmente abroga l'indagine dei fenomeni più veloce di 1 fotogramma / minuto, e in secondo luogo, gli effetti di diffrazione limitano l'utilità di NIQPM e HTDIC agli oggetti da 0.2 fino a 10 (NIQPM) e 20 (HTDIC) micron di diametro, rispettivamente. Quindi, la dinamica dei campioni e la sua associata di interesse devono soddisfare certa dimensione e vincoli temporali per consentire l'uso di questi metodi. Eccitante, cellula più fissoI campioni r sono prontamente studiate con questi metodi.

Introduzione

L'uso della microscopia ottica è ormai onnipresente nelle indagini di organismi cellulari. Grazie al loro basso endogeni di assorbanza e di scattering deboli strutture in spettro ottico visibile, le cellule non influenzano fortemente l'ampiezza delle onde ottiche li attraversano e quindi appaiono semitrasparente quando ripreso con microscopi da campo luminoso standard. Campioni cellulari, tuttavia, rallentano onde ottiche viaggiano attraverso di loro in un modo che è linearmente correlata alla quantità di densità di massa locale in una particolare regione dello spazio attraverso il quale la luce viaggia. Utilizzo di questo sfasamento temporale eterogenea prof....

Protocollo

1. Microscopio Specifiche

Per eseguire l'imaging nel modo corretto, il microscopio dovrebbe avere le seguenti specifiche:

1. Possedere entrambi contrasto di interferenza differenziale (DIC) e campo chiaro (BF) contrasto.
2. Avere movimento asse z controllato da computer.
3. Avere un diaframma regolabile per variare l'apertura numerica della lente condensatore. Un'apertura con una regola graduata o lettura elettronica è tenuto a conoscere il valore della apertura numerica. L'apertura numerica deve variare da 0,1 per NIQPM fino a 0.9 (o superiore) per HTDIC.
4. Il microscopio dovrebbe avere un fi....

Risultati

Corretta illuminazione campione durante passante fuoco acquisizione delle immagini è fondamentale per la corretta attuazione del NIQPM un algoritmi HTDIC nd. Nella figura 2 si illustrano alta e bassa illuminazione NA sia sotto DIC e contrasto campo chiaro di una sfera di polistirolo e la linea cellulare di adenocarcinoma del colon umano SW620. Figure 2A, 2C, 2I, e 2K dimostrano di imaging ottimale per NIQPM. Figure 2F, 2H, 2N e 2P dimos.......

Discussione

In generale, NIQPM è una tecnica di diffrazione limitata convalidata su percorso lunghezze ottiche vanno ,25-44,7. Validazione è stata eseguita su n = 1.596 sfere di polistirene variano in diametro 0,11-9,8 micron sospese in Fluoromount G (dati non mostrati). Cellule possiedono percorso lunghezze ottiche che vanno da quasi 0-7.

Quando si misura la distribuzione della densità di un esemplare si può scoprire che l'immagine pseudo DIC guarda bene mentre la mappa di densità possiede contribu.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microscopio Zeiss Axio Imager 2	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania	Microscopio Axio Imager D2
Filtro verde (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Filtro verde
Software SlideBook 5.5	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Software di acquisizione immagini
Polistirene microsfere	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Sfere di polistirene
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mezzi di montaggio