Una procedura per l'impianto Array organizzata di microfili per Recordings singola unità di Awake, Comportarsi Animali

Sommario

Impiantare array organizzate di microfili per l'uso in single-unit registrazioni elettrofisiologiche presenta una serie di sfide tecniche. Sono descritti metodi per eseguire questa tecnica e le attrezzature necessarie. Inoltre, i frutti di un array Microconduttori organizzati per registrare da sub-regioni neurali distinti con elevata selettività spaziale è discusso.

Abstract

In vivo registrazioni elettrofisiologiche nella veglia, animali comportarsi forniscono un potente metodo per la comprensione segnalazione neurale a livello di singola cellula. La tecnica consente sperimentatori di esaminare temporalmente e regionale modelli di cottura specifici al fine di correlare i potenziali d'azione registrati con il comportamento in corso. Inoltre, le registrazioni singola unità possono essere combinati con una pletora di altre tecniche per produrre spiegazioni complete della funzione neurale. In questo articolo, descriviamo l'anestesia e la preparazione per Microwire impianto. Successivamente, annoveriamo l'attrezzatura necessaria e passaggi chirurgici per inserire con precisione una matrice microconduttori in una struttura di destinazione. Infine, descriviamo brevemente l'attrezzatura utilizzata per registrare da ciascun elettrodo nella matrice. Gli array Microconduttori fissi descritti sono particolarmente adatti per l'impianto cronica e consentono registrazioni longitudinali di dati neurali in quasi tutte le Preparati comportamentalion. Discutiamo rintracciamento brani elettrodi per triangolare posizioni Microconduttori nonché modi per combinare microconduttori impianto con tecniche di immunoistochimica per aumentare la specificità anatomica dei risultati registrati.

Introduzione

Registrazioni elettrofisiologiche permettono agli scienziati di esaminare le proprietà elettriche delle cellule biologiche. Nel sistema nervoso centrale, in cui gli impulsi elettrici servono come meccanismo di segnalazione, queste registrazioni sono di particolare importanza per la comprensione funzione neurale ^1-2. Durante le registrazioni singola unità a comportarsi animali, un microelettrodo che è stato inserito nel cervello è in grado di registrare i cambiamenti nella generazione di un neurone di potenziali d'azione nel corso del tempo.

Mentre molte tecniche permettono di registrare l'attività cerebrale, monoblocco elettrofisiologia è uno dei metodi più precisi consentendo risoluzione a livello di singolo neurone. Quando si desidera un alto grado di specificità spaziale, microfili possono essere utilizzati per indirizzare discreti sotto-nuclei o insiemi di cellule all'interno del brain3. Registrazioni singola unità beneficiano anche di alta risoluzione temporale registrazioni sono accurate a livello di microsecondo. E, in vivo unregistrazioni veglia consentono interazioni circuito intatto, con l'ambiente naturale della afferenti ed efferenti proiezioni, chimico sistemico e influenze ormonali e parametri fisiologici. Segnali neurali sono derivati ​​da input sensoriali, comportamenti motori, elaborazione cognitiva, neurochimica / farmacologia, o una combinazione. Di conseguenza, la segregazione di sensoriali, motorie, cognitive, e chimiche influenze richiede esperimenti ben concepiti, con rischi e controlli efficaci che possono consentire per la valutazione di ciascuna delle influenze di cui sopra. Tutto sommato, le registrazioni a comportarsi animali permettono sperimentatori di osservare l'integrazione di più fonti di informazioni all'interno di un circuito funzionante e per derivare un modello più completo della funzione del circuito.

Registrazioni singola unità soffrono anche di una serie di svantaggi, la cui sperimentatore deve essere consapevole. In primo luogo, le registrazioni possono essere difficili da condurre. Infatti, le proprietà di the amplificatori Headstage e le microfili impiantati che permettono specificità spaziale e temporale in queste registrazioni rende anche registrazioni suscettibile all'influenza di segnali elettrici estranei (cioè "disturbo" elettrico). Di conseguenza, la capacità di risolvere i problemi in un sistema elettrofisiologico richiede una comprensione tecnica ben sviluppata di principi e apparecchi elettrofisiologici. E 'anche importante notare che, in determinate circostanze, segnali elettrici registrati nelle registrazioni extracellulari possono rappresentare la somma di più segnali neurali. Inoltre, la generalizzazione dell'attività singola unità all'attività popolazione all'interno di una regione bersaglio può spesso essere limitata dal grado di eterogeneità cellulare all'interno della regione bersaglio (ma vedi Cardin ^4). Ad esempio, gli elettrodi possono essere prevenuto verso registrazione neuroni di output elevata ampiezza in luogo di altre cellule. L'interpretabilità delle registrazioni singola unità è aumentatacombinando registrazioni con altre tecniche, tra cui, ma non limitatamente a, elettrici (ortodromica o antidromica), chimica (ad es iontoforetico o recettore designer) o optogenetic stimolazione ^4, inattivazioni neurali temporanee, esami sensomotori ^5, le procedure di disconnessione o immunoistochimica ^3.

Nel protocollo che segue enumereremo i materiali e le fasi necessarie per impiantare una matrice microconduttori organizzata nel ratto (anche se il protocollo può essere adattato per l'uso in altre specie). Il procedimento e lo stile di array fissi utilizzati nel nostro laboratorio hanno dimostrato affidabile per registrazioni longitudinali e possono sostenere registrazioni della stessa neurone nel tempo per un mese ^6-8. Ciò rende questa procedura ideale per l'esame delle risposte fasiche agli stimoli sperimentali, i cambiamenti plastici in risposte neurali, o meccanismi di apprendimento e motivazione.

Protocollo

La massima cura deve essere presa per mantenere condizioni di asetticità (come descritto nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio ⁹⁾ durante la preparazione e lo svolgimento della seguente procedura. Il protocollo che segue è conforme alla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio ed è stato approvato dalla cura degli animali ed uso Comitato Istituzionale, Rutgers University. Si stima che le procedure successive richiederanno 3-6 ore per completare.

Impiantare Array Microwire:

1. Inserire animali sotto anestesia utilizzando 50 mg / kg sodio pentobarbital (ip) e amministrare 10 mg / kg di nitrato di atropina metile (IP; Glicopirrolato può essere sostituito) e 0,25 mg di penicillina (300.000 U / ml im) per mantenere la funzione respiratoria e prevenire l'infezione rispettivamente.
   Nota: Con la lunghezza di 3-6 ore di questa chirurgia impianto, pentobarbital di sodio viene usato perché è conveniente e limita l'esposizione umana alleanestetici (come potrebbe accadere con l'uso prolungato di anestetici a gas), pur fornendo anestesia di lunga durata. Sostituzione di altri anestetici è accettabile.
2. Verificare che l'anestesia ha avuto effetto utilizzando il test tail pinch prima di procedere.
3. Se necessario, invia alternando iniezioni di ketamina cloridrato (60 mg / kg ip) e sodio pentobarbital (5-10 mg / kg ip) per mantenere l'anestesia durante l'intervento chirurgico.
4. Shave il cuoio capelluto con una lama da bisturi # 22.
5. Disinfettare il cuoio capelluto rasato con povidone iodio.
6. Dare iniezioni sottocutanee di bupivacaina (~ 1 mg / kg SC sviluppa su 4 siti di iniezione) per anestetizzare localmente il cuoio capelluto. Lasciare 5-10 min per l'anestetico locale per avere effetto.
7. Inserire un lubrificante oftalmico sopra gli occhi per mantenere l'umidità durante l'anestesia.
8. Fissare l'animale in bar orecchio e il naso morsetto di un apparato stereotassico.
9. Utilizzare punti di riferimento visivi (ad esempio una barra orizzontale sul stertelaio eotaxic) per livellare approssimativamente la testa dell'animale. Questa fase ha il solo scopo approssimativamente a livello del cranio.
10. Praticare un'incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto con una lama da bisturi # 11 montato su un supporto bisturi. L'incisione deve estendersi da appena dietro le orecchie alla porzione posteriore dell'osso nasale.
11. Utilizzando una spatola dissezione, cancellare il cranio di tutto il tessuto rimanente fino sono stati raggiunti entrambi i crinali cranio laterali e la cresta cranio posteriore.
12. Tirare indietro la pelle intorno l'incisione utilizzando un numero di hemostats (6x).
13. Pulire il cranio di qualsiasi sangue e lasciarlo asciugare. Se si verifica un sanguinamento residuo, interrompere il sanguinamento residuo con un piccolo strumento cauterizzazione. Assicurare che il cranio rimane pulita e asciutta consente acrilico dentale usati nelle fasi successive di legarsi al cranio permanentemente.
14. Mark bregma e lambda (Figura 2D) interpolando l'intersezione delle suture cranio. Un microfono dissezioneROSCOPE è necessario marcare con precisione queste posizioni.
15. Attaccare un piccolo oggetto appuntito (ad esempio una spilla o dei denti punta) ad un braccio stereotassico e abbassarlo per determinare la dorsale / ventrale (DV) coordinata bregma e lambda.
16. Regolare il morsetto naso fino coordinate DV per bregma e lambda sono entro 100 micron (0,1 mm) di ogni altro.
17. Una volta livellato, registrare anteriore / posteriore (AP), mediale / laterale (ML) e DV coordinate di bregma con la posizione del morsetto naso. Controllare due volte le coordinate per la precisione, come il resto della chirurgia dipende dalla precisione di queste coordinate.
18. Utilizzare le coordinate misurate per calcolare la ML e coordina AP per i quattro angoli della "finestra cranio" relativo al bregma (cioè craniotomia; la figura 1). La finestra cranio è un rettangolo posizionato proprio attraverso la quale la matrice microconduttori passerà.
19. Utilizzare le coordinate calcolate per segnare ilCoordinate finestra teschio sul cranio con un allegato stereotassico punta e inchiostro della penna stilografica. Per ottenere segni precisi, applicare solo una piccola quantità di inchiostro alla punta dell'utensile marcatura con un applicatore di cotone.
20. Perforare fuori dalla finestra cranio rimuovendo l'osso in una serie di piccoli strati.
    1. Inizia forando gli angoli marcati della finestra in cui sono stati collocati i segni.
    2. Quindi, collegare gli angoli e delineare la finestra.
    3. Infine, chiaro l'area all'interno della struttura fino alla profondità di dura madre. Il foro deve essere più ampio (cioè smussato) sotto gli strati superficiali del cranio per garantire che la finestra mantiene una larghezza appropriata dall'alto verso il basso.
21. Utilizzare microforceps per rimuovere con attenzione i chip qualsiasi osso residuo, detriti, o dura madre all'interno della finestra del cranio. Questo passo è estremamente importante, in quanto questi bit di materiale possono compromettere l'integrità della matrice durante la discesa. Una volta eliminato, si deve tenere the finestra umido con soluzione salina batteriostatica per il resto della chirurgia.
22. Posizionare le marcature sul cranio per 5 viti cranio e 1 filo di terra (Figura 1). Queste posizioni varieranno a seconda della regione del cervello mirata. Headstage sarà più sicuro se una vite è posto su ciascuna delle 5 ossa del cranio. Posizionare entrambe le viti del cranio e filo di terra in luoghi che non interferiscono con il posizionamento di matrice Microwire.
23. Praticare i fori per le viti cranio e fissare le viti a posto. Le viti devono essere abbassati fino a solo 3-4 discussioni stanno mostrando (o, se si utilizzano viti diverse da quelle raccomandate, abbastanza profonda per attraversare lo spessore del cranio di promuovere la stabilità matrice, ma non troppo in profondità in modo da danneggiare la corteccia). Pulire i filetti delle viti dopo il posizionamento.
24. Praticare un foro per il cavo di terra. Abbassare il filo lentamente (più di 1-2 minuti) per il DV obiettivo di coordinare e fissare il filo in posizione utilizzando acrilico dentale.
25. Aggiungere acrilico intorno i filidelle viti cranio. Prima si asciuga acrilici, rimuovere eventuali eccessi di cemento che scorre lontano dal filo di terra o viti cranio. Lasciare 15 minuti per l'acrilico dentale ad asciugare / indurire.
26. Fissare la matrice al braccio stereotassico. Livellare la matrice e orientarlo in modo che possa esattamente passare attraverso i confini della finestra cranio.
27. Mettere salina nella finestra cranio in modo che sia a livello con il cranio. Abbassare la matrice finché si crea una fossetta nella soluzione salina. Questo coordinate serve come livello cranio per la matrice. Utilizzare questo valore per calcolare la coordinata DV finale della matrice.
28. Abbassare la matrice lentamente fino a raggiungere la coordinata DV finale. Fermare ogni 1mm discesa ed attendere per alcuni minuti per consentire tessuto cerebrale riprendersi da fossette e per sciogliere la porzione inferiore del polietilenglicole (PEG) sulla matrice (PEG viene utilizzato per mantenere temporaneamente i fili nella loro conformazione riducendo , e si dissolve lentamente in soluzione salina).
29. Quando la matrice è di 1 mmdistante dal target, abbassarlo più lentamente fino a raggiungere la destinazione finale. Abbassamento a 0,1-0,2 mm alla volta prima di consentire il tessuto a riposo per un periodo di 5 min mira a preservare il tessuto presso il sito di destinazione, nonché connessioni sinaptiche prossimali. Se l'apparecchiatura è disponibile, precisione abbassamento della matrice può essere assistita mediante un manipolatore motorizzato.
30. Sciogliere il restante PEG e utilizzare acrilico dentale per cementare le microfili a posto. Aggiungere più strati di cemento per assicurare che i fili siano sicure e quindi consentire 15-20 min per il cemento per indurire prima di procedere. Questo assicura che i fili non saranno jostled dalla loro posizione finale.
31. Costruisci il resto della headstage dell'animale utilizzando acrilico dentale. Utilizzare l'acrilico per incassare le viti cranio, filo di terra, e il connettore per le microfili. Lasciare che il cappello acrilico per indurire a sufficienza prima di procedere.
32. Suturare l'incisione cuoio capelluto con suture assorbibili e somministrare 2 ml of salina batteriostatica (sc) per ripristinare l'idratazione da un intervento chirurgico.
33. Rimuovere l'animale dalle barre orecchio e posizionare il soggetto in una zona pulita. Osservare l'animale frequentemente durante il recupero post-operatorio fino termoregolazione e di locomozione hanno recuperato. Dopo il recupero dall'anestesia, spostare l'animale in un solo alloggiamento per il resto del recupero post-chirurgico.
34. Dare animali monitoraggio postoperatorio quotidiana e la cura nei giorni successivi alla procedura. Recupero da questa procedura è ottimale quando sono consentiti sette o più giorni.
35. Dare animali iniezioni di Carprofene (5mg/kg) e Enrofloxacina (5-10 mg / kg) o loro equivalenti durante il recupero per il programma consigliato dal veterinario curante.

Risultati

Un elenco delle attrezzature utilizzate da questo laboratorio per la registrazione di segnali elettrofisiologici possono essere trovate nella tabella 3. Dopo il recupero da un intervento chirurgico,-singole unità sono registrati inserendo un guadagno unitario headstage nel connettore impiantato. Questo headstage è collegato tramite un cavo a un commutatore, che è capace di libera rotazione senza interruzioni nella registrazione elettrofisiologica attraverso l'uso di anelli collettori elettrici. Il c...

Discussione

Registrazioni extracellulari rappresentano una potente tecnica sperimentale che può essere incorporato in quasi ogni preparazione sperimentale nel campo delle neuroscienze. Fili che sono stati impiantati in array organizzati possono essere seguiti come i loro alberi passano attraverso il cervello e nella loro regione di destinazione (Figura 5A). Quando una piccola lesione post-sperimentale viene creato sulla punta microconduttori noninsulated per creare un piccolo deposito ferro dal filo di acciaio inos...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tabella 1. Elenco dei materiali chirurgici.
Garza	Fisher (MooreBrand)	19-898-144
Cotton Swabs	Fisher (Puritan)	S304659
Nembutal (Pentobarbital)	Sigma Aldrich	P3761
Atropina Nitrato di metile	Sigma Aldrich	A0382
Baytril (Enrofloxacina)	Butler Shein ( Bayer)	1040007
Ketamina cloridrato	Butler Shein	SKU# 023061
Betadine (Povidone-Iodio)	Fisher (Perdue)	19-066452
Stereotax	Kopf	Modello 900
Strumento di cauterizzazione	Stoelting	59017
Microscopio da dissezione	Nikon	SMZ445
Trapano dentale	Buffalo	37800
Soluzione salina batteriostatica	Bulter Schein	8973
Jewlers Viti	Stoelting	51457
Microsonde array di microfili		Filo di terra personalizzato Omnetics
		Custom Plug
Dental Acrylic	Fisher (BAS)	50-854-402
Suture riassorbibili	Fisher (Ethicon)	NC0258473
Puralube (unguento/lubrificante oftalamico)	Fisher (Henry Schein)	008897
Tabella 2. Elenco degli strumenti chirurgici.
2x Microforcipe	George Tiemann Co.	#160-57	Multiuso (ad es. rimozione di detriti nella finestra del cranio)
2x Pinze	George Tiemann Co.	#160-93	Multiuso (ad es. legare suture)
6x Emostatici	George Tiemann Co.	#105-1125	Morsetto e incisione aperta
1x Forbici piccole	George Tiemann Co.	#105-411	Tagliare le suture dopo aver legato
1x pinza per tessuti	George Tiemann Co.	#105-222	Tenere il tessuto durante la sutura
1x Porta aghi	George Tiemann Co.	#105-1259	Ago da sutura 1x
Supporto per bisturi (con lama #11)	George Tiemann Co.	#105-80 (con lama #105-71)	Incisione del cranio
1x #22 Lama per bisturi	George Tiemann Co.	#160-381	Rasatura del cuoio capelluto
1x Spatola chirurgica	George Tiemann Co.	# 160-718	Raschiamento cranio per pulire il tessuto sul cranio
Macchine / gioiellieri viti	varie	N / A	0/80 x 1/8 "
Tabella 3. Elenco delle apparecchiature per la registrazione di segnali elettrofisiologici.
Microwire Array & Connector	Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD)	N/A (Parte n. in base alle caratteristiche dell'array)	Impiantato cranialmente nella regione di registrazione target. Gli array sono personalizzati in base alla spaziatura dei fili desiderata, alla lunghezza, ecc.
Unity-Gain Harness/Headstage	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1200	Amplificazione iniziale del segnale neurale; consente la propagazione di piccoli segnali neurali.
Commutatore (e girevole del fluido opzionale)	Plastics One, Inc. (Roanoke, VA)	SL18C	Consente agli animali di ruotare liberamente mentre propagano il segnale elettrico al preamplificatore
Preamplificatore	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1198	Amplifica in modo differenziale i segnali neurali contro un elettrodo di riferimento.
Filtro e amplificatore	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1199	Filtra e amplifica ulteriormente il segnale amplificato in modo differenziale.
Computer di acquisizione	EnGen (Phoenix, AZ)	N/A (Custom Build)	Esegue software e hardware per l'acquisizione di dati comportamentali e neurali.
Carta A/D	Traduzione dei dati (Marlboro, MA)	DT-3010	Digitalizza i segnali neurali per il campionamento al computer.
scheda I/O digitale	(Norton, MA)	PCI CTR-05	Acquisisce input e output comportamentali

Elaborazione della misurazione della