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Articolo metodologico

A Novel Luce Danni Paradigma per l'uso in retina Rigenerazione Studi in Zebrafish adulti

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⸱

DOI:

10.3791/51017

⸱

24 ottobre 2013

 , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Department of Opthalmology, Wayne State University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Protocolli multipli danni leggeri sono stati descritti da fotorecettori danni e di conseguenza indurre una risposta rigenerazione della retina in zebrafish adulto. Questo protocollo descrive un metodo migliorato che può essere utilizzato in animali pigmentate e che danneggia la stragrande maggioranza di canna e cono fotorecettori attraverso l'intera retina.

Abstract

Indotto dalla luce degenerazione retinica (LIRD) è comunemente usato in entrambi i roditori e zebrafish per asta danni e fotorecettori cono. In zebrafish adulto, la degenerazione dei fotorecettori innesca Müller cellule gliali di rientrare nel ciclo cellulare e produrre progenitori transitoria-amplificazione. Questi progenitori continuano a proliferare quando migrano alla zona danneggiata, dove in ultima analisi, danno luogo a nuovi fotorecettori. Attualmente esistono due paradigmi LIRD ampiamente usate, ognuna delle quali provoca vari gradi di perdita dei fotorecettori e corrispondenti differenze nella risposta rigenerazione. Come strumenti più genetici e farmacologici sono disponibili per testare il ruolo dei singoli geni di interesse durante la rigenerazione, vi è la necessità di sviluppare un paradigma LIRD robusto. Qui si descrive un protocollo LIRD che si traduce in perdita diffusa e costante di entrambe bastoncelli e coni in cui abbiamo combinato l'uso di due tecniche LIRD stabiliti in precedenza. Inoltre, Questo protocollo può essere esteso ad animali pigmentati, che elimina la necessità di mantenere le linee transgeniche di interesse sullo sfondo albino per gli studi LIRD.

Introduzione

Indotto dalla luce degenerazione retinica (LIRD) è comunemente usato in entrambi i roditori e zebrafish per asta danni e fotorecettori cono. In zebrafish adulto, la degenerazione dei fotorecettori innesca Müller cellule gliali di rientrare nel ciclo cellulare e produrre progenitori transitoria-amplificazione. Questi progenitori continuano a proliferare quando migrano alla zona danneggiata, dove in ultima analisi, danno luogo a nuovi fotorecettori. Attualmente esistono due paradigmi LIRD ampiamente usate, ognuna delle quali provoca vari gradi di perdita dei fotorecettori e corrispondenti differenze nella risposta rigenerazione. Come strumenti più genetici e farmacologici sono disponibili per testare il ruolo dei singoli geni di interesse durante la rigenerazione, vi è la necessità di sviluppare un paradigma LIRD robusto. Qui si descrive un protocollo LIRD che si traduce in perdita diffusa e costante di entrambe bastoncelli e coni in cui abbiamo combinato l'uso di due tecniche LIRD stabiliti in precedenza. Inoltre, Questo protocollo può essere esteso ad animali pigmentati, che elimina la necessità di mantenere le linee transgeniche di interesse sullo sfondo albino per gli studi LIRD.

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Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo protocollo è stato approvato dal comitato di utilizzo degli animali presso la Wayne State University School of Medicine.

1. Adattamento al buio

  1. Trasferimento ~ 10 pesci adulti albino o pigmentato dal sistema abitativo normale in un involucro scuro. Se disponibile, utilizzare un involucro scuro che è incorporata nel modulo alloggiamento zebrafish, che consente il flusso dell'acqua normale attraverso il serbatoio. (Se un tale sistema non sia disponibile, posizionare il serbatoio di pesce in un involucro completamente buio, avendo cura di aerare il pesce con l'ossigeno).
  2. Conservare il pesce al buio per 10 giorni. Quando l'alimentazione degli animali o l'aggiunta di nuovi pesci alla casella buio, assicurarsi di muoversi il più rapidamente possibile per evitare di esporre il pesce ad un lungo periodo di luce.

2. L'esposizione ai raggi UV della luce

  1. Assicurarsi che l'alimentazione alla sorgente di raggi UV è OFF. Rimuovere il filamento della luce UV da stereomicroscopio a fluorescenza.
    1. Utilizzare un inverted15 cm di diametro in vetro Petri (o qualcosa di simile due centimetri altezza) come supporto per il filamento UV. Tape la capsula di Petri di banco di laboratorio.
    2. Nastro il filamento luce UV alla parte superiore del piatto rovesciato Petri. Disporre modo che ~ 2 mm fine degli aggetti filamento capsula di Petri.
  2. Ottenere un bicchiere di vetro da 250 ml. Coprire ½ del fondo, laterale e posteriore del becher con foglio di alluminio, assicurandosi che il lato "splendente" della lamina affronta l'interno del bicchiere. Se il bicchiere è graduato, coprire la metà formulazione del bicchiere con un foglio, lasciando la chiara metà del bicchiere esposto.
  3. Riempire il becher da 250 ml con 100 ml di acqua dal sistema di impianto pesce.
  4. Porre il bicchiere da 250 ml in un bicchiere 4 L. Riempire il bicchiere 4 L con acqua finché il livello dell'acqua è anche con la linea 100 ml di acqua nel becher da 250 ml.
  5. Aggiungere un massimo di 10 animali scuro trattati al bicchiere da 250 ml. Coprire il bicchiere da 250 ml, con un piccolo pezzo di alluminiosventare.
  6. Posizionare l'intero apparato becher immediatamente adiacente al filamento UV. Il filamento deve toccare la parte esterna del bicchiere 4 L e rivolta verso la porzione esposta del becher da 250 ml. Assicurarsi che il bicchiere da 250 ml è centrata nel fondo del becher 4 L.
  7. Posizionare un grande schermo opaco dietro il becher 4L, consentendo gli animali siano esposti, ma impedendo qualsiasi personale di laboratorio di vedere la punta del filamento UV. ATTENZIONE: assicurarsi che questa barriera è a posto prima di accendere l'alimentazione alla sorgente di raggi UV.
  8. Accendere la fonte di energia UV. Imposta il timer per 30 min. Luogo con qualsiasi etichette di avvertimento necessarie per garantire che il personale di laboratorio ignari non si espongono accidentalmente a radiazioni UV.
  9. Dopo 30 minuti, spegnere la fonte di energia UV. Rimuovere il becher da 250 ml con il pesce. NOTA: se sono necessari più cicli di esposizione ai raggi UV, lasciare che la fonte di alimentazione raffreddare (~ 20 min) prima di ripetere il protocollo di esposizione. Assicurarsi di sostituire tha 100 ml di acqua con acqua fresca sistema per ogni esposizione. L'acqua nel becher 4 L non necessita di essere sostituito.

3. Lampada alogena Luce Esposizione

  1. Trasferire il pesce da 250 ml in un bicchiere L acrilico serbatoio di pesci 1.8. Riempire il serbatoio fino al segno di overflow.
  2. Posizionare la lampada zona da trattare luce alogena. Ottenere quattro 250 W Lampade alogene utilità da un negozio di ferramenta locale. Di fronte a due lampade nella stessa direzione, organizzare 29 centimetri a parte sul centro. Disporre le altre due lampade in modo simile.
    1. Posizionare la seconda serie di lampade in modo che essi sono di fronte alla prima serie di lampade, lasciando ~ 73 cm tra gli insiemi di due lampade. Questo crea una zona di trattamento luce a forma di rettangolo di 29 x 73 cm.
  3. Ottenere un piccolo ventilatore da un negozio di ferramenta locale. Posizionare la ventola equidistante tra le due serie di lampade, appena al di fuori della zona di trattamento luce.
  4. Posizionare due 1.8 L serbatoi pieni di acqua nel centro delzona di trattamento luce, equidistante tra le due serie di lampade. La distanza tra le lampade e la parete esterna del serbatoio dovrebbe essere ~ 29 cm. Nota: anche se solo trattamento 10 pesci in un serbatoio di 1,8 L, utilizzare questo accordo. Sono necessari entrambi i serbatoi per mantenere la temperatura dell'acqua di ciascun serbatoio all'interno della gamma appropriata.
  5. Inserire un aeratore ossigeno in ogni serbatoio.
  6. Coprire ogni serbatoio con chiare coperchi acrilici, lasciando un ~ 2 centimetri vuoto a fine vicina alla ventola. Disporre la ventola in modo che possa soffiare aria in questa lacuna. Posizionare un termometro in uno o entrambi i serbatoi.
  7. Attivare l'alimentazione per le luci, ventole e aeratori. Mantenere il trattamento della luce per un massimo di 4 giorni. Il pesce non deve essere alimentato durante il trattamento con la luce, per non compromettere la qualità dell'acqua e provocare più stress agli animali.
  8. Monitorare il livello di temperatura e di acqua su una base quotidiana. Mantenere la temperatura a 30-33 ° C. Se necessario, regolare la velocità della ventola e / o la distanza tra i serbatoi e il lights.
    1. Top fuori ogni serbatoio con acqua sistema, se necessario, di solito tutti i giorni.
    2. Usare sempre sano zebrafish adulto (tipicamente 6-9 mesi di età) a mantenere un tasso di sopravvivenza di quasi il 100%. Tuttavia, se un pesce viene trovato morto nel serbatoio, rimuoverla immediatamente e sostituire l'acqua nel serbatoio intero.

4. Collezione tessuti

  1. 48 ore dopo l'inizio del trattamento con luce alogena togliere il pesce dalla zona da trattare.
    1. Preparare fresco fissativo formaldeide etanolica (1 parte di formaldeide al 37%, 9 parti di 100% di etanolo).
    2. Euthanize zebrafish con una dose eccessiva di anestetico 2-fenossietanolo (0,4 mg / L).
    3. Trasferire il pesce zebra eutanasia di un tovagliolo di carta. Enucleare l'occhio usando pinze curve.
    4. Mettere gli occhi enucleati in fissativo e negozio O / N a 4 ° C.
  2. Cryoprotect gli occhi.
    1. Lavare gli occhi in 5% di saccarosio 1x PBS per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi sostituire confresco 5% di saccarosio 1x PBS per 2 h. Successivamente, lavare gli occhi nel 30% saccarosio PBS 1x O / N a 4 ° C. Lavare gli occhi in un 01:01 (parti uguali) del tessuto congelamento medie e il 30% di saccarosio 1x PBS O / N a 4 ° C.
  3. Incorpora gli occhi in 100% tessuto congelamento medio e conservare a -80 ° C. Orientare gli occhi in modo che criosezionamento del tessuto viene eseguita sul asse dorsale / ventrale.
  4. Cryosection il tessuto e posto su vetrini. Diapositive caldi per 2 ore a 55 ° C. Conservare i vetrini a -80 ° C o eseguire immediatamente immunoistochimica standard.
  5. Eseguire immunoistochimica standard su tessuto sezionato e immagine con la microscopia a fluorescenza 40,51.

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Risultati

Il protocollo di trattamento finora descritto luce è stata confrontata con ogni singolo metodo di LIRD. Nel buio trattati con animali adulti albini (Figure 3-5), i singoli trattamenti di luce determinato una notevole perdita di canna (figura 3) e il cono (Figura 4) fotorecettori. Tuttavia, entrambi i trattamenti individuali principalmente danneggiati fotorecettori nella metà dorsale della retina, lasciando la retina ventrale relativamente protetto dai trattamen...

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Discussione

Qui mostriamo che la combinazione di una breve esposizione ai raggi UV, con un continuo brillante luce i risultati di esposizione nella perdita dei fotorecettori capillare e una risposta rigenerazione robusto. Rispetto ai singoli metodi LIRD, questo metodo combinato è anche il protocollo più efficace per danneggiare entrambe le aste e coni in entrambe le metà della retina. È importante sottolineare che questo trattamento è efficace in animali pigmentati così come gli animali albini.

...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Xixia Luo per un'eccellente allevamento di pesci e di supporto tecnico. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health sovvenzioni R21EY019401 (RT) e P30EY04068 (RT), e fondi di start-up a RT, tra cui una sovvenzione illimitata di ricerca per prevenire la cecità alla Wayne State University, Dipartimento di Oftalmologia. JT è stato sostenuto da un Thomas C. Rumble Fellowship fornito dalla Wayne State University Graduate School.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Sorgente di luce UVLeicaEL600
Piastra Petri in vetro (150 x 20 mm)Sigma-Aldrich/PyrexCLS3160152BO
Bicchiere in vetro da 250 mlSigma-Aldrich/PyrexCLS1000250
Bicchiere in vetro da 4 LSigma-Aldrich/PyrexCLS10004L
Foglio di alluminioFisher01-213-105
250 W alogeno lampadeWorkforce265-669
1,8 L serbatoi in acrilico trasparenteAquaneeringZT180T
1,8 L coperchi per serbatoi in acrilico trasparenteAquaneeringZT180LCL
FanHoneywellHT-900
AeratoreTetra77853-900
TermometroCole-ParmerYO-08008-58
Piegato pinze (5/45)World Precision Instruments504155

Riferimenti

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