Il Transistor elettrochimica organica è integrato con cellule vive e utilizzato per monitorare il flusso di ioni attraverso la barriera epiteliale intestinale. In questo studio, un aumento di flusso di ioni, correlate a rottura di giunzioni strette, indotta dalla presenza del chelante calcio EGTA (etilenglicole-bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N ', N'-tetra acetico acido), viene misurata.
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Articolo metodologico
Rilevamento di Barriera tessuto Turbativa con una Transistor elettrochimica biologico
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tratto gastrointestinale è un esempio di tessuto barriera che fornisce una barriera fisica contro l'ingresso di agenti patogeni e tossine, pur consentendo il passaggio di ioni e molecole necessarie. Una violazione in questa barriera può essere causato da una riduzione della concentrazione di calcio extracellulare. Questa riduzione nella concentrazione di calcio provoca un cambiamento conformazionale di proteine coinvolte nella tenuta della barriera, portando ad un aumento del flusso paracellular. Per simulare questo effetto chelante calcio etilene glicole bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N ', N'-acido acetico tetra (EGTA) è stato utilizzato su un monostrato di cellule note per essere rappresentativo del tratto gastrointestinale. Esistono già diversi metodi per rilevare la rottura del tessuto barriera, come immunofluorescenza e permeabilità saggi. Tuttavia, questi metodi sono molto tempo e costosa e non adatta per misure dinamiche o ad alto rendimento. Strumenti elettronici per la misurazione del tessuto barrieraintegrità esiste anche per la misura della resistenza transepiteliale (TER), tuttavia questi sono spesso costosi e complessi. Lo sviluppo di metodi rapidi, economici, e sensibili è urgente l'integrità del tessuto barriera è un parametro chiave nella scoperta di nuovi farmaci e la diagnostica patogeno / tossina. Il transistor elettrochimica organica (OECT) integrato con il tessuto barriera formando cellule è stato dimostrato come un nuovo dispositivo in grado di controllare dinamicamente l'integrità del tessuto barriera. Il dispositivo è in grado di misurare le variazioni minute a flusso ionico con risoluzione temporale senza precedenti e sensibilità, in tempo reale, come indicatore di integrità del tessuto barriera. Questo nuovo metodo è basato su un semplice dispositivo che può essere compatibile con le applicazioni di screening ad alta produttività e fabbricato a basso costo.
Introduzione
L'epitelio gastrointestinale è un esempio di tessuto barriera, che controlla il passaggio di molecole tra differenti compartimenti del corpo. L'epitelio è costituito da cellule cilindriche allungate unite da complessi di proteine che forniscono una barriera fisica 1 contro patogeni e tossine, pur consentendo il passaggio di acqua e sostanze nutritive necessarie per sostenere il corpo. Questa selettività è dovuta alla polarizzazione delle cellule epiteliali, che crea due differenti domini di membrana: il lato apicale delle cellule esposte al lume e il lato basale delle cellule ancorate sui tessuti sottostanti 2,3. Giunzioni strette (TJ)....
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Protocollo
1. PEDOT: PSS Soluzione Preparazione
- A 50 ml di PEDOT PSS, aggiunta di glicole etilenico (aumenta conducibilità) in un rapporto in volume di 1:4 (glicole etilenico a PEDOT PSS), 0,5 microlitri / ml di acido Dodecylbenzenesulfonic (DBSA) come un tensioattivo, e 10 mg / ml 3-glicidossipropiltrimetossisilano (GOPS) come reticolante per favorire l'adesione del polimero conduttore al vetrino.
2. OECT Fabrication (Figura 3)
- Definire i contatti di source e drain oro evaporato termicamente tramite lift-off litografia:
- Spin cappotto photoresist su un normale vetrino pulito a 3000 rpm per 30 sec. Dimensioni ....
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Risultati
Durante la prima fase di misurazione, la corrente di drain può variare leggermente, ma nella maggior parte dei casi dovrebbe rimanere stabile (figura 2, parte a). Se il segnale non è stabile, il transistore deve essere eliminata e sostituita. Questo controllo della stabilità garantisce inoltre che le eventuali perdite iniziali conducibilità del dispositivo non influenzano la misura successiva. Dopo alcuni minuti di misurazione, l'inserto con cellule che formano il tessuto barriera è posto sulla part.......
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Discussione
Questa tecnica fornisce un nuovo metodo per integrare un transistore elettrochimica organica con cellule vive per misurare l'integrità del tessuto barriera. I principali vantaggi di questa tecnica sono la rapidità e sensibilità, ma anche il basso costo del dispositivo per il controllo dinamico di tessuto barriera.
Poiché questo metodo utilizza cellule vive, un punto critico è quello di assicurarsi di utilizzare un monostrato, che rappresenta uno strato barriera intatto. I parametri della.......
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Dichiarazioni
Questo progetto è sostenuto da FP7-PEOPLE-2009-RG, Marie Curie progetto n 256.367 (CELLTOX) e la Commissione europea ERC-2010-StG Research Council Proposta n 258.966 (IONOSENSE), così come una concessione congiunta dal Conseil Regional de Provenza-Alpi-Costa Azzurra e CDL Pharma per ST. Ringraziamo George Malliaras per utili discussioni relative al design e funzionalità OECT.
Ringraziamenti
Gli autori di questo documento non hanno interessi finanziari concorrenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Clevios pH 1000 | Heraus Clevios | ||
| AZ9260 resina | Cipec Specialità | ||
| Acido dodecilbenzensolfonico (DBSA) | Acros Organic | ||
| 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS) | Sigma Aldrich | ||
| 24-well Suspended cell Inserto per coltura Millicell PET 0,4 μ m Millipore | Dominique Dutscher | 51705 | |
| Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti BD Falcon | Dominique Dutscher | 51705 | |
| Stericup-GPT PES 0.22 μ M | Dominique Dutscher | 51246 | |
| Advanced DMEM Marque GIBCO | Fisher Scientific | E3434T | |
| FBS Heat Inact. | Fisher Scientific | E3387M | |
| Penicillina Streptomicina | Fisher Scientific | E3470C | |
| GlutaMAX | Fisher Scientific | E3524T | |
| Tripsina 0,05% EDTA | Fisher Scientific | E3513N | |
| EGTA (Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N′,N&primo;-acido tetraacetico) | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Glicole etilenico, anidro, 99,8%, | Sigma Aldrich | ||
| Caco-2 celle | ATCC | ||
| PDMS | Dow Corning | SYLGARD 184 ELASTOMERO | |
| Au (99,99%) | NEYCO | AU3X6 | |
| Cromo (99,95%) | NEYCO | ||
| Parylene C | Sistemi di rivestimento | ||
| Filo Ag/AgCl | Apparecchio Harvard Photoresist | ||
| Cipec Specialties |
Riferimenti
- Farquhar, M. G., Palade, G. E. Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol. 17, 375-412 (1963).
- Gaillard, J. L., Finlay, B. B. Effect of cell polarization and differentiation on entry of Listeria monocytogenes into the enterocyte-like Caco....
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Ristampe e permessi
