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Articolo metodologico

Rilevamento di Barriera tessuto Turbativa con una Transistor elettrochimica biologico

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DOI:

10.3791/51102

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10 febbraio 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioelectronics, Ecole Nationale Superieure des Mines, 2Research and Exploratory Development Division, Applied Physics Laboratory, Johns Hopkins University

In questo articolo

Sommario

Il Transistor elettrochimica organica è integrato con cellule vive e utilizzato per monitorare il flusso di ioni attraverso la barriera epiteliale intestinale. In questo studio, un aumento di flusso di ioni, correlate a rottura di giunzioni strette, indotta dalla presenza del chelante calcio EGTA (etilenglicole-bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N ', N'-tetra acetico acido), viene misurata.

Abstract

Il tratto gastrointestinale è un esempio di tessuto barriera che fornisce una barriera fisica contro l'ingresso di agenti patogeni e tossine, pur consentendo il passaggio di ioni e molecole necessarie. Una violazione in questa barriera può essere causato da una riduzione della concentrazione di calcio extracellulare. Questa riduzione nella concentrazione di calcio provoca un cambiamento conformazionale di proteine ​​coinvolte nella tenuta della barriera, portando ad un aumento del flusso paracellular. Per simulare questo effetto chelante calcio etilene glicole bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N ', N'-acido acetico tetra (EGTA) è stato utilizzato su un monostrato di cellule note per essere rappresentativo del tratto gastrointestinale. Esistono già diversi metodi per rilevare la rottura del tessuto barriera, come immunofluorescenza e permeabilità saggi. Tuttavia, questi metodi sono molto tempo e costosa e non adatta per misure dinamiche o ad alto rendimento. Strumenti elettronici per la misurazione del tessuto barrieraintegrità esiste anche per la misura della resistenza transepiteliale (TER), tuttavia questi sono spesso costosi e complessi. Lo sviluppo di metodi rapidi, economici, e sensibili è urgente l'integrità del tessuto barriera è un parametro chiave nella scoperta di nuovi farmaci e la diagnostica patogeno / tossina. Il transistor elettrochimica organica (OECT) integrato con il tessuto barriera formando cellule è stato dimostrato come un nuovo dispositivo in grado di controllare dinamicamente l'integrità del tessuto barriera. Il dispositivo è in grado di misurare le variazioni minute a flusso ionico con risoluzione temporale senza precedenti e sensibilità, in tempo reale, come indicatore di integrità del tessuto barriera. Questo nuovo metodo è basato su un semplice dispositivo che può essere compatibile con le applicazioni di screening ad alta produttività e fabbricato a basso costo.

Introduzione

L'epitelio gastrointestinale è un esempio di tessuto barriera, che controlla il passaggio di molecole tra differenti compartimenti del corpo. L'epitelio è costituito da cellule cilindriche allungate unite da complessi di proteine ​​che forniscono una barriera fisica 1 contro patogeni e tossine, pur consentendo il passaggio di acqua e sostanze nutritive necessarie per sostenere il corpo. Questa selettività è dovuta alla polarizzazione delle cellule epiteliali, che crea due differenti domini di membrana: il lato apicale delle cellule esposte al lume e il lato basale delle cellule ancorate sui tessuti sottostanti 2,3. Giunzioni strette (TJ) sono complessi di proteine ​​presenti nella porzione apicale delle cellule epiteliali e sono parte di un complesso più larga nota come la giunzione apicale 4. Flusso di ioni attraverso il tessuto barriera può andare sia tramite il transcellulare (attraverso la cella) o tramite un paracellular (tra due celle adiacenti) percorso. La somma diil trasporto attraverso entrambe le vie è noto come la resistenza transepiteliale. La giunzione apicale è responsabile della regolazione di ioni e molecole che passano attraverso la barriera 5,6 tramite una specifica funzione di chiusura e di apertura. Una disfunzione o alterazione di tali complessi proteici sono spesso correlati alla malattia 7-11. Inoltre, molti enterici patogeni / tossine sono noti per indirizzare specificamente questo complesso, entrando così il corpo e che porta a diarrea, molto probabilmente come conseguenza della massiccia disregolazione del flusso di ioni / acqua attraverso la barriera 12-14. Tessuto barriera può anche essere modificato cambiando il microambiente extracellulare. Caderina è una proteina critica per adesione cellula-cellula, ed è coinvolta nella formazione della giunzione apicale. Il calcio è necessaria per la conformazione strutturale corretta di caderina, e una diminuzione del calcio extracellulare ha dimostrato di causare la distruzione della giunzione cellula-cellula e una successiva apertura delparacellular percorso tra le celle 15. In questo studio, EGTA (etilenglicole-bis (beta-amminoetil etere)-N, N, N ', N'-acido acetico tetra), uno specifico chelante del calcio, è stato usato per indurre una breccia nel tessuto barriera, in quanto ha dimostrato di avere un effetto rapido e drastico sul paracellulare ion flusso 16,17. Questo chelante del calcio è stato utilizzato su un monostrato confluente e differenziata della linea cellulare Caco-2. Coltivate in inserti coltura cellulare, questa linea cellulare è noto per sviluppare le caratteristiche del tratto gastrointestinale ed è ampiamente utilizzato dall'industria farmaceutica per testare l'assorbimento di farmaci 18,19.

Metodi per monitorare l'integrità dei tessuti barriera sono abbondanti. Questi metodi sono spesso ottica, basandosi su immunofluorescenza di particolari proteine ​​note per essere all'incrocio apicale 20, o basandosi sulla quantificazione di una molecola tracciante fluorescente che è normalmente impermeabile al tessuto barriera21,22. Tuttavia, i metodi label-free (ovvero senza un fluoroforo / cromoforo) sono preferibili come l'uso di un'etichetta può incorrere artefatti, e spesso aumenta il tempo di costo e dosaggio. Elettrico, monitoraggio senza etichetta di tessuto barriera è recentemente emerso come un metodo di monitoraggio dinamico 23. Ad esempio recenti progressi tecnologici nella spettroscopia di impedenza elettrica hanno consentito lo sviluppo di un apparecchio di scansione disponibile in commercio 24,25 che può misurare la resistenza transepiteliale (TER), una misurazione della conduttanza di ioni attraverso lo strato di cellule.

Elettronica organica ha creato un'opportunità unica per interfacciare il mondo dell'elettronica e della biologia 26,27 28,29 utilizzando polimeri conduttori che possono condurre entrambi i vettori elettronici e ionici. Una nuova tecnica per rilevare le infrazioni in tessuto barriera usando l'OECT 30-32 è stato recentemente introdotto. Questo dispositivo è stato validato con tecniche esistenti con noiEd valutare integrità della barriera di tessuto, tra cui immunofluorescenza, test di permeabilità con Lucifero giallo, e spettroscopia di impedenza utilizzando il Cellzscope. Nel caso di tutti i composti tossici testati, il OECT stato trovato per operare con sensibilità uguale o migliore, e con maggiore risoluzione temporale, rispetto alle tecniche precedenti. In questo dispositivo, PEDOT PSS, un polimero conduttore che ha dimostrato di essere stabile e biocompatibile 33,34, viene utilizzato come materiale attivo nel canale transistor. Il OECT è composto di elettrodi di drain e di source su entrambi i lati di un canale polimero conduttivo. Questo viene poi messo in contatto con un elettrolita, che costituisce parte integrante del dispositivo. Un elettrodo di gate è immerso nell'elettrolita (Figura 1), e quando una tensione di gate positiva è applicata al gate, cationi dell'elettrolita sia costretto ad entrare canale, dedoping così il polimero conduttore ed una conseguente variazione del source-drain corrente. Il device è quindi estremamente sensibile ai cambiamenti minute a flusso di ioni a causa di amplificazione del transistor. Uno strato di cellule coltivate su un inserto di coltura cellulare è stata posta tra l'elettrodo di gate e il canale polimero conduttivo. La presenza di uno strato di cellule intatte agisce come barriera per i cationi entrare nel polimero conduttore, quindi, in presenza di un monostrato intatto, la corrente diminuisce di scarico (Figura 2: transizione da una regione a b). In presenza di un composto tossico, il tessuto barriera progressivamente perdere la sua integrità, lasciando che i cationi entrano nel film polimerico e aumentando la corrente di drain (Figura 2: regione c). Con questa tecnica, la breccia nel tessuto barriera è visto dalla modulazione della corrente di drain, corrispondente alla modulazione del flusso attraverso il monostrato. Questo dispositivo è in grado di misurare le variazioni minute a flusso ionico con risoluzione temporale senza precedenti e la sensibilità in tempo reale. Questo wil tecnologial essere di interesse nel campo della tossicologia per il test anti-droga, diagnostica delle malattie o di ricerca di base, come il modello di barriera può essere facilmente adattato. Questo metodo aiuterà anche a ridurre la sperimentazione animale, in quanto consente la validazione dei modelli in vitro per sostituire nei test in vivo.

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Protocollo

1. PEDOT: PSS Soluzione Preparazione

  1. A 50 ml di PEDOT PSS, aggiunta di glicole etilenico (aumenta conducibilità) in un rapporto in volume di 1:4 (glicole etilenico a PEDOT PSS), 0,5 microlitri / ml di acido Dodecylbenzenesulfonic (DBSA) come un tensioattivo, e 10 mg / ml 3-glicidossipropiltrimetossisilano (GOPS) come reticolante per favorire l'adesione del polimero conduttore al vetrino.

2. OECT Fabrication (Figura 3)

  1. Definire i contatti di source e drain oro evaporato termicamente tramite lift-off litografia:
    1. Spin cappotto photoresist su un normale vetrino pulito a 3000 rpm per 30 sec. Dimensioni di vetro sono 3 in x 1 pollice
    2. Definire modelli da fotolitografia. Dimensioni possono essere modificate, tuttavia le dimensioni qui elencate hanno mostrato di portare alla sensibilità ottimale. Quindi utilizzare uno sviluppatore.
    3. Evaporare 5 nm e 100 nm di cromo e oro, rispettivamente.
    4. Sollevare-off il photoresist in un acbagno di acetone per 1 ora, lasciando il substrato con la sorgente e il pozzo nell'area contatti Au solo.
  2. La lunghezza desiderata della PEDOT: canale PSS è di 1 mm. Questo è ottenuto utilizzando un patterning parylene-C (Pa-C) tecnica peel-off:
    1. Caricare 3,5 g di Pa-C nel setup rivestimento. Uniformemente evaporare 2 micron di parylene-C sulla parte superiore del substrato con Au contatti.
    2. Motivo canale mediante fotolitografia:
      1. Spin cappotto fotoresist a 3000 rpm per 30 sec.
      2. Utilizzare una maschera per illuminare il canale e il contatto oro 20 sec ai raggi UV, il photoresist esposto diventerà solubile nello sviluppatore.
      3. Utilizzare sviluppatore per aprire l'area canale sul photoresist.
    3. Incidere il Pa-C nell'area canale da un passo plasma 15 min (O 2 (50 sccm) e CHF 4 (3 sccm) plasma a 160 W) per aprire il canale e il contatto oro.
  3. Depositare la PEDOT: soluzione miscela PSS da spin coating a500 rpm per 45 sec. Infornare per 30 secondi a 110 ° C.
  4. Peel-off della Pa-C per rivelare la PEDOT: canale PSS del substrato sottostante. Questo canale dovrebbe sovrapporsi leggermente con i contatti Au assunti nel protocollo 1.
  5. Campioni cuocere per 1 ora a 140 ° C in condizioni atmosferiche.

3. Assemblea dispositivo

  1. Fai PDMS mescolando due soluzioni (di solito forniti insieme in un kit) con un rapporto 01:10 di salamoia in soluzione base. Cuocere per 1 ora a 120 ° C.
  2. Progettare bene usando un punzone buco e tagliare un quadrato intorno alla zona desiderata.
  3. Colla un PDMS ben sopra il canale, al risultato in una zona canale di circa 6 mm 2. Assicurarsi che i contatti di source e drain non sono coperti.
  4. Effettuare un supporto di plastica con un foro in esso (può utilizzare il supporto per l'inserto di coltura cellulare) e poi incollarlo sopra le PDMS. Lasciate asciugare per una notte.
  5. Testare il bene della fuga dalla precarica con watER.
  6. Saldare i fili elettrici sul contatto source e drain con stagno.

4. Cell Culture

  1. Preparare delle cellule di coltura come segue:
    1. In DMEM, aggiungere 1% glutammina, 10% siero fetale bovino, 0,5% penicillina-streptomicina, e 0,1% Gentamicina.
    2. Sterilizzare terreni di coltura cellulare utilizzando un dispositivo di filtro sterile.
  2. Mantenere cellule Caco-2 tra il passaggio 49 e 68 a 37 ° C in atmosfera umidificata al 5% CO 2, in cellule di coltura.
  3. Dividere le celle una volta alla settimana con tripsina e di sementi a 1,5 x 10 4 cellule / inserimento.
  4. Cambiare cella cultura dei media due volte a settimana per 3 settimane.

5. Misure con OECT

  1. Collegare un filo di Ag / AgCl ad un Sourcemeter per uso come elettrodo cancello. Immergere la punta nella cella terreni di coltura, che viene utilizzato come elettrolita, come illustrato in figura 1a.
  2. Collegare i fili di source e drain di tegli Sourcemeter (configurazione in dual channel).
  3. Applicare un impulso quadrato tensione positiva (GS V) tra il gate e source (usato come elettrodo di riferimento: terra). Una tensione costante negativa tra drain e source (V DS) è applicata e corrente corrispondente (I DS) è misurata.
  4. Utilizzare una raccolta di dati programma in esecuzione PC. Parametri OECT inseriti in un programma di acquisizione personalizzato dovrebbero essere le seguenti: V DS = -0,2 V, V GS = 0.3 V, V GS in tempo = 2 sec, off time = 28 sec.
  5. Lettura corrente source-drain (I DS) e la corrente di gate (I GS). Effettuare la misurazione per alcuni minuti per garantire un segnale stabile base.

6. Integrazione Celle con OECT per Misura

Nota: Prima dell'esperimento, l'integrità dello strato di cellule può essere verificata misurando TER con un dispositivo di spettroscopia di impedenza. TER di ogni 3 settimane di età Caco-2 inse cellularert dovrebbe essere superiore a 400 Ω. cm 2.

  1. Durante il tempo off di misurazione OECT: Rimuovere l'elettrodo di porta dalla elettrolita, incorporare l'inserto di coltura cellulare, e sostituire l'elettrodo di porta all'interno dell'inserto di coltura cellulare.
  2. Effettuare una misura di base con le cellule per diversi minuti al fine di garantire un segnale stabile. Questa linea di base sarà utilizzato come per il calcolo del valore normalizzato corrispondente a un monostrato intatto (0).

7. Preparazione e introduzione di composto tossico

  1. Preparare una soluzione 1 M di EGTA in acqua deionizzata, prima regolando il pH della soluzione a 7,4 con Tris base.
  2. Aggiungere la soluzione EGTA nel volume appropriato per ottenere la concentrazione desiderata (ad esempio tra 5 mM e 100 mM), tenendo conto del volume. Il EGTA dovrebbe essere aggiunto nella camera basale durante il tempo libero.
  3. Misurare continuamente per 90 minuti come nel protocollo 5. Se la misura è being effettuata a temperatura ambiente, la stabilità delle cellule non rimarrà costante dopo 90 min.
  4. Alla fine della corsa, graffiare lo strato di cellule di provocare la completa distruzione dello strato di barriera misura e per 15 min, questo punto potrebbe essere fatto rimuovendo il filtro e immergendo l'elettrodo di gate nei media. Questa linea di base sarà utilizzato come per il calcolo del valore normalizzato corrispondente a un monostrato distrutta.

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Risultati

Durante la prima fase di misurazione, la corrente di drain può variare leggermente, ma nella maggior parte dei casi dovrebbe rimanere stabile (figura 2, parte a). Se il segnale non è stabile, il transistore deve essere eliminata e sostituita. Questo controllo della stabilità garantisce inoltre che le eventuali perdite iniziali conducibilità del dispositivo non influenzano la misura successiva. Dopo alcuni minuti di misurazione, l'inserto con cellule che formano il tessuto barriera è posto sulla part...

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Discussione

Questa tecnica fornisce un nuovo metodo per integrare un transistore elettrochimica organica con cellule vive per misurare l'integrità del tessuto barriera. I principali vantaggi di questa tecnica sono la rapidità e sensibilità, ma anche il basso costo del dispositivo per il controllo dinamico di tessuto barriera.

Poiché questo metodo utilizza cellule vive, un punto critico è quello di assicurarsi di utilizzare un monostrato, che rappresenta uno strato barriera intatto. I parametri della...

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Dichiarazioni

Questo progetto è sostenuto da FP7-PEOPLE-2009-RG, Marie Curie progetto n 256.367 (CELLTOX) e la Commissione europea ERC-2010-StG Research Council Proposta n 258.966 (IONOSENSE), così come una concessione congiunta dal Conseil Regional de Provenza-Alpi-Costa Azzurra e CDL Pharma per ST. Ringraziamo George Malliaras per utili discussioni relative al design e funzionalità OECT.

Ringraziamenti

Gli autori di questo documento non hanno interessi finanziari concorrenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Clevios pH 1000Heraus Clevios
AZ9260 resinaCipec Specialità
Acido dodecilbenzensolfonico (DBSA)Acros Organic
3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane (GOPS)Sigma Aldrich
24-well Suspended cell Inserto per coltura Millicell  PET 0,4 μ m MilliporeDominique Dutscher51705
Piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti BD FalconDominique Dutscher51705
Stericup-GPT PES 0.22 μ MDominique Dutscher51246
Advanced DMEM Marque GIBCOFisher ScientificE3434T
FBS Heat Inact.Fisher ScientificE3387M
Penicillina StreptomicinaFisher ScientificE3470C
GlutaMAXFisher ScientificE3524T
Tripsina 0,05% EDTAFisher ScientificE3513N
EGTA (Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N′,N&primo;-acido tetraacetico)Sigma AldrichE4378
Glicole etilenico, anidro, 99,8%,Sigma Aldrich
Caco-2 celleATCC
PDMSDow CorningSYLGARD 184 ELASTOMERO
Au (99,99%)NEYCOAU3X6
Cromo (99,95%)NEYCO
Parylene CSistemi di rivestimento
Filo Ag/AgClApparecchio Harvard Photoresist
Cipec Specialties
SILICONICO speciali

Riferimenti

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