Abbiamo stabilito un modello glioblastoma ortotopico corticale nei topi per intravital microscopia a due fotoni che ricapitola i vincoli biofisici normalmente in gioco durante la crescita del tumore. Una finestra di vetro cronica sostituzione del cranio sopra il tumore consente il seguito della progressione tumorale nel tempo mediante microscopia a due fotoni.
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Articolo metodologico
Un ortotopico Glioblastoma modello di mouse mantenimento di vincoli Cervello parenchimale fisiche e adatto per intravitale due fotoni Microscopia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) è la forma più aggressiva di tumore cerebrale senza trattamenti curativi ad oggi disponibili.
Modelli murini di questa patologia basano sull'iniezione di una sospensione di cellule di glioma nel parenchima cerebrale dopo incisione della dura madre. Considerando che le cellule devono essere iniettato superficialmente per essere accessibile a intravital microscopia a due fotoni, iniezioni superficiali non riescono a riepilogare le condizioni fisiopatologiche. Infatti, in fuga attraverso il tratto di iniezione maggior parte delle cellule tumorali raggiungono lo spazio extra-durale dove si espandono eccessivamente veloce, in assenza di vincoli meccanici del parenchima.
I nostri miglioramenti consistono non solo in focally impiantare uno sferoide glioma piuttosto che iniettare una sospensione di cellule di glioma negli strati superficiali della corteccia cerebrale, ma anche in intasamento sito di iniezione da un destrano gel emi-bead reticolato che è incollato alla cirding parenchima e sigillato a dura madre con cianoacrilato. Complessivamente queste misure rispettare la fisiologica espansione e l'infiltrazione delle cellule tumorali all'interno del parenchima cerebrale. Craniotomia è stato finalmente chiuso con una finestra di vetro cementato al cranio per consentire l'imaging cronica nel corso di settimane, in assenza di sviluppo del tessuto cicatriziale.
Approfittando di animali transgenici fluorescenti innestate con cellule tumorali fluorescenti Abbiamo dimostrato che le dinamiche di interazioni che avvengono tra le cellule del glioma, i neuroni (ad es Thy1-CFP topi) e vascolare (evidenziato da una iniezione endovenosa di un colorante fluorescente) possono essere visualizzati da intravital microscopia a due fotoni durante la progressione della malattia.
La possibilità di un tumore immagine a risoluzione microscopica in un ambiente cerebrale minimamente compromesso rappresenta un miglioramento degli attuali modelli animali di GBM che dovrebbero beneficiare campo della neuro-oncologia e test anti-droga.
Introduzione
Glioblastoma multiforme appare come la forma più aggressiva di tumore cerebrale negli adulti con una sopravvivenza mediana di 12 mesi e 5 anni tasso di sopravvivenza del 5%. Gestione clinica si basa sulla chirurgia, radioterapia e chemioterapia spesso usati in combinazione. Tuttavia, gli effetti di questi trattamenti rimangono palliative 1-3.
Fino ad ora, la maggior parte degli studi neuro-oncologia si basano su tecniche che sono solo in grado di fornire una visione statica ed eseguiti su grandi coorti di tumore animali recanti sacrificati a diversi punti temporali (si veda ad esempio 4,5). Il recente sviluppo di metodi di follow-up sulla base di imaging intravitale consente di studiare la crescita del glioma e le interazioni tra cellule tumorali e il loro microambiente fisiopatologica sullo stesso animale nel corso del tempo. Questo apre la strada per pezzo esclusivo di informazione che è stato finora irrealizzabile 6. Gli animali transgenici che esprimono tag fluorescenti in cellule di interesse possono essere utilizzatid per studiare le interazioni specifiche tra le cellule tumorali e ad esempio i neuroni in questo documento.
Negli ultimi dieci anni, intravital microscopia a due fotoni 7 è diventato un gold standard negli studi di neuro-oncologia fondamentali e sperimentazioni precliniche 8,9 per la sua capacità di eseguire profonda osservazione intravital di cervello di topo (> 500 micron al di sotto della dura madre) con una risoluzione spaziale micrometrica 10. Uso intravital microscopia a due fotoni con modelli animali orthotopical impiantati con una finestra cranica cronica 11, è possibile seguire la progressione tumorale nel tempo sulla stessa 9,12 mouse.
Uno dei principali inconvenienti di questi modelli animali precedentemente pubblicati è tuttavia che non imitano i vincoli fisici che regolano la crescita tumorale come la dura madre non è sigillato dopo l'iniezione della sospensione cellulare 9,13,14. Cellule del glioma possono perdere inspazio extradurale trasformazione di un modello di glioma ortotopico in uno eterotopico.
Il modello animale qui presentato consiste nella iniezione di uno sferoide di cellule di glioma fluorescenti nella corteccia cerebrale ad una profondità di 200 micron seguita dalla sigillatura della dura madre con destrano gel emi-bead reticolato e colla compatibile isto . La crescita tumorale è poi limitato al parenchima cerebrale che mantiene vincoli fisici patofisiologici. Una finestra di vetro cronica impiantato al di sopra del tumore consente un accesso ottico facile per intravital microscopia a due fotoni. L'uso di animali transgenici che esprimono tag fluorescenti in cellule di interesse è possibile eseguire un follow-up della crescita glioma nel tempo e per studiare la sua interazione con il suo microambiente (qui con neuroni e vasi evidenziati con destrani fluorescenti).
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con la legislazione francese e in conformità alla Direttiva del Consiglio della Comunità Europea del 24 novembre 1986 (86/609/CEE) per la cura e l'uso di animali da laboratorio. La ricerca sugli animali è stata autorizzata dalla Direzione Dipartimentale des Servizi Vétérinaires des Bouches-du-Rhône (licenza D-13-055-21) e approvato dal comitato etico della Provenza Costa Azzurra n ° 14 (Progetto 87-04122012) .
1. Spheroids Preparazione
- Preparazione delle piastre Petri agarosio rivestite
- Mescolare 1 g di agarosio con 100 ml di mezzo di coltura cellulare non addizionato con siero fetale bovino. Utilizzare un forno a microonde (850 W per 40 secondi, poi 3 x 15 sec; agitare la soluzione tra ogni sessione microonde) bollire la soluzione e per sciogliere completamente i agarosio. Autoclave questa soluzione di agarosio all'1% per 20 min a 120 ° C per assicurare steri. lità Nota: Fare attenzione a sciogliere completamente l'agarosio prima che il protocollo autoclave. Disomogeneità può compromettere la formazione di sferoidi.
- Una volta recuperato dall'autoclave, versare 10 ml della soluzione di agarosio 1% in 100 x 20 mm piastre di Petri. Lasciare il Petri-piatti 20 min a temperatura ambiente per permettere la soluzione di agarosio 1% a solidificare.
- Aggiungere 10 ml di PBS sopra il agarosio a mantenere l'umidità. Sigillare il coperchio delle scatole di Petri agarosio rivestite avvolgendoli con parafilm per evitare l'evaporazione. Piastre di Petri possono essere conservati per un massimo di due mesi a 4 ° C se adeguatamente umidificata dal livello di PBS.
- Cultura Spheroid
- In un 75 centimetri 2 fiasco, coltivare le cellule del glioma nel loro mezzo raccomandata come un monostrato.
- Sostituire il PBS da uno dei agarosio rivestite piastra Petri 1% in 1,5 ml di "medium condizionato" raccolti dal pallone contenente il monostrato di cellule di glioma 2Ds.
- Rimuovere il terreno dal pallone contenente il monostrato di cellule di glioma 2D.
- Lavare delicatamente il monostrato con 10 ml di PBS.
- Aggiungere 2 ml di 0,05% di una soluzione di tripsina / EDTA e incubare la beuta 4 minuti a 37 ° C. Nota: Il tempo di incubazione può variare a seconda della linea cellulare utilizzata.
- Aggiungere 8 ml di terreno di coltura per fermare l'azione della tripsina, lavare delicatamente la sospensione cellulare. Nota: Fare attenzione a non svuotare aria nella sospensione cellulare in quanto aumenta la morte cellulare.
- Mettere 6 ml della sospensione di cellule in una fiala sterile.
- Centrifugare la fiala 4 min a 800 rpm.
- Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere il sedimento cellulare in 3 ml di terreno di coltura.
- Seed la sospensione cellulare nel piatto preparato agarosio rivestite Petri.
- Mettere la piastra di Petri a 37 ° C in una atmosfera di CO 2 5% per 2 o 3 giorni finché si formano sferoidi del diametro desiderato.
2. Spheroid e Window impianto
- Preparazione del sistema di iniezione
- Capillari di vetro pulita (1 mm di diametro) per sonicazione in etanolo al 70% per 10 min. Lavare due volte con acqua prima immissione all'interno di un incubatore fino a secco.
- Tirare diversi capillari di vetro puliti con un estrattore pipetta al fine di preparare una piccola riserva.
- Rompere la punta del capillare tirato da graffi estremità su un pezzo di carta velina avere una estremità smussato della dimensione desiderata: tipicamente un diametro esterno di 300-350 micron e un diametro interno di 250-300 micron. Durante questo processo di formatura, controllare il diametro del capillare usando un macroscopio cui oculare è dotato di una mira graduata.
- Collegare l'estremità non smussato del capillare ad un collettore 3 vie con un pezzo di tubo di plastica il cui diametro interno adatta al diametro esterno del capillare.
- Utilizzo di plastica Tubing, collegare gli altri due modi di collettore di un 25 microlitri siringa microlitro e una siringa da 1 ml caricato con olio minerale compatibile isto.
- Regolare il selettore collettore di stabilire un percorso tra la siringa microlitro e la siringa da 1 ml. Rimuovere il pistone della siringa microlitri e iniettare olio minerale all'indietro nella siringa microlitro finché non fuoriesce spingendo il pistone della siringa da 1 ml. Sostituire il pistone della siringa microlitri pur non avendo cura di lasciare bolle d'aria nel tubo.
- Regolare il selettore collettore di stabilire un percorso tra il capillare e la siringa da 1 ml. Riempire il capillare con olio minerale fino a quando non fuoriesce dalla punta facendo attenzione a non lasciare bolle d'aria nel tubo.
- Regolare il selettore collettore per stabilire una connessione tra la siringa microlitro e capillare. Espellere circa 10 ml di olio minerale.
- Immergere la punta capillare nella soluzione PBSe usando lo spessore della siringa microlitri, aspirare 5μl di PBS nel capillare. Si noti che il menisco tra olio e PBS è chiaramente visibile.
- Fissare il capillare su un micromanipolatore 3 assi montaggio sotto il macroscopio intervento chirurgico. Questo sistema viene utilizzato per indirizzare il capillare al sito di iniezione sotto controllo visivo.
- Impianto Spheroid
- Leggermente sedare il mouse per inalazione di isoflurano in una camera di induzione (1,5% in aria durante 1 a 1,5 min).
- Anestetizzare l'animale con una iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina / xilazina (120 mg / kg, 12 mg / kg). Si noti che l'anestesia spesso riduce la temperatura corporea dell'animale. Si raccomanda di procedere con la chirurgia in una stanza a 26 ° C e per mantenere caldo animale con un cuscinetto riscaldante termocontrollata sottostante.
- Applicare una pomata oculare per evitare il disseccamento degli occhi.
- Radere il cuoio capelluto dell'animale.
- Luogol'animale in un telaio stereotassico utilizzando auricolari bar e un boccaglio.
- Pulire la pelle con povidone iodio (3% sapone, quindi soluzione al 10%).
- Fare un 1 cm di lunghezza incisione longitudinale al centro del cuoio capelluto con un bisturi. Utilizzando forbici tagliare e rimuovere la pelle sopra le ossa parietali.
- Con una lama da bisturi rimuovere delicatamente il periostio sopra il cranio. Applicare generosamente cianoacrilato sopra l'osso per generare una superficie ruvida per dopo cemento aderenza.
- Perforare l'osso parietale sotto un macroscopio chirurgica per generare una craniotomia di diametro di 4 mm. Ottimo aggiungere PBS ghiacciato contenente Pencillin (1.000 U / ml) e Streptomicin (1 mg / ml) durante la procedura generale per prevenire il riscaldamento. Rimuovere i piccoli frammenti ossei con una pinza e una garza sterile bagnata. Fate attenzione a forare di almeno 1 mm di distanza da suture del cranio parietali per evitare emorragie.
- Sottile l'osso al confine della craniotomia in cui verrà sigillato la finestra di vetro. Obiettivo è quello di indirizzo essicurarsi dopo posizionamento planare della finestra di vetro con massima superficie di contatto tra il cervello e il vetro. Rimuovere lentamente l'osso con una pinza e pulire la durata mater esposta con la soluzione PBS.
- Prendete un diametro di 5 millimetri rotonda vetrino di vetro, pulirlo con alcool ed asciugarlo con carta velina. Tentare di utilizzare il coprioggetto da coperchio per la craniotomia e confermare che una grande superficie piana del cervello entra in contatto con il vetro. Se necessario, rimuovere il vetrino di un ulteriore sottili le ossa laterali. Proseguire fino a quando il cervello può ottenere spremuto piatto se applicare delicatamente pressione sul vetrino una volta sul posto.
- Pulire nuovamente il vetrino con l'alcol, asciugarlo con carta velina, e salvarlo parte.
- Con un ago 26 gauge fare un foro nella dura madre nel centro della craniotomia evitando però principali vasi sanguigni. Assicurarsi di non danneggiare il parenchima cerebrale come lo scopo di questa fase è solo per aprire la durata mater.
- Pulire delicatamente la durata mater with soluzione PBS per rimuovere il sangue emorragico. Coprire con un foglio di carta velina mentre si prepara l'iniezione sferoide.
- Con il sistema di iniezione sferoide preparato al punto 2.1, succhiare uno sferoide rotondo montaggio del diametro interno capillare (circa 200-250 micron) dalla piastra Petri preparato al punto 1.2. Spheroid dovrebbe venire con circa 5 ml terreno di coltura. Dovrebbe cadere alla punta della capillarità sotto il suo peso.
- Rimuovere la carta velina bagnata utilizzati per coprire la craniotomia e posizionare l'animale sotto il sistema di iniezione.
- Abbassare la pipetta di iniezione fino a toccare il foro praticato nella dura madre. Quindi, abbassare nuovamente da 250 micron. Attendere 30 sec.
- Iniettare lentamente sferoide utilizzando il pistone della siringa microlitro (2-3 ml) mentre pompare il liquido in eccesso con un sottile foglio di carta tissue. Attendere 30 secondi e poi sollevare delicatamente la pipetta di iniezione da 50 micron verso la superficie. Attendere ancora 30 sec e ripett la procedura di sollevamento a passi di 50 pm fino alla superficie. I tempi di attesa evita l'estrazione dello sferoide che si attacca alla pipetta.
- Confermare la presenza dello sferoide nel cervello utilizzando un macroscopio fluorescenza.
- Mescolare 100-300 micron di diametro reticolati perline gel di destrano con la soluzione PBS in una capsula di Petri. Attendere 1min e pescare alcune perle idratati. Metterli con l'osso adiacente alla craniotomia.
- Sotto il controllo macroscopico, scegliere una perlina di diametro simile alla dimensione dell'apertura dura madre. Tagliare il cordone di destrano gel reticolato in due metà con pinze.
- Mettere delicatamente un destrano gel emi-bead reticolato nel foro di iniezione con la faccia convessa verso il sferoide. Fare attenzione a non rimuovere il sferoide e premere delicatamente verso il basso fino alla frontiera del concavo entrare in contatto con l'ambiente circostante dura madre.
- Mettere una goccia di colla cianoacrilato su un vetrino; immergere la punta di uno stuzzicadenti nel Drop di prendere una piccola quantità di colla. Sigillare rapidamente i bordi del destrano gel emi-bead reticolato all'adiacente dura madre mediante stampaggio colla intorno. Aver cura di effettuare movimenti rapidi e precisi per evitare l'incollaggio del destrano gel emi-bead reticolato allo stuzzicadenti. Evitare eccesso di colla che può diffondersi e ostacolare se non impedire l'imaging volta essiccato. Attendere 2 minuti per asciugare la colla e poi pulire la craniotomia e l'osso circostante con soluzione PBS.
- Finestra impianto
- Mettere il 5 mm di diametro intorno coprioggetto sopra la craniotomia (vedi 2.2.12). I bordi del coprioggetto devono essere sul cranio diluito al l'esterno della craniotomia. Il coprioggetto deve essere in contatto con la dura madre e l'osso assottigliato sui bordi. E 'molto importante avere un contatto diretto tra la dura madre e il vetrino di vetro altrimenti tessuto cicatriziale può sviluppare e impedire chiarezza ottica.
- Con un tessuto, assorbire il PBS su °bordi e coprioggetto in modo che la soluzione non copre completamente la craniotomia quando si applica una piccola pressione nel centro del vetrino. Questo farà sì che l'osso, vetro e cervello sono incollati insieme sul lato della regione di interesse.
- Mantenere una leggera pressione al centro del vetrino con una pinza mentre delicatamente applicando cianoacrilato al confine tra l'osso e il vetrino. La colla spontaneamente espandersi fino all'interfaccia con la soluzione PBS. Soluzione fungerà da barriera dato l'idrofobicità della colla. Tenuta dovrebbe essere efficace in meno di un minuto, ma prendere una cura estrema di non spostare il vetrino finché non viene risolto. Ciò altrimenti causare perdite cianoacrilato sulla dura madre quindi portare ad un fallimento della chirurgia.
- In caso colla sarebbe diffusa sulla parte superiore del vetro, rimuoverlo con una lama micro-bisturi effettuando movimenti a spirale altrimenti può ridurre chiarezza ottica. Attenzione a non rompere il vetrino di vetro During la procedura a causa della pressione eccessiva.
- Consolidare la fissazione vetro applicando cemento dentale sui bordi del coprioggetto verso il cranio adiacente. Assicurati di coprire l'intero cranio esposto fino al cuoio capelluto. Con cemento in più, costruire pareti laterali intorno al vetrino per creare il pool necessaria per l'immersione dell'obiettivo. Il cemento dentale curerà in meno di 10 min.
3. Assistenza post-operatoria e preparazione per l'imaging
- Assistenza post-operatoria
- Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico, iniettare Dexamethazon (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) sc sulle regioni pelvica e la sua giaceva in una gabbia con un caldo tessuto-nido.
- Monitorare l'animale fino a quando gli effetti dell'anestesia sono scomparsi. In generale 2 a 3 ore dopo l'intervento chirurgico, i topi sono completamente mobile. Assicurarsi che l'animale ha un facile accesso al cibo e all'acqua. Fornire l'animale con agarosio contenente glucosio (agarosio3%, glucosio 3%).
- Monitorare il peso dell'animale ogni giorno e iniettare Dexamethazon (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) sc per la prima 10d dopo l'intervento chirurgico. Per considerazioni etiche, eutanasia i topi quando la perdita supera il 15% del suo peso originale. Pressione intracranica aumenta con le dimensioni del tumore che porta a difficoltà motorie per l'animale. Questo è linea cellulare tumorale dipendente e si verifica a vari ritardi post-operatorie. Particolare attenzione dovrebbe essere presa per caratterizzare il punto finale della sperimentazione con la linea cellulare utilizzata.
- Preparazione per l'imaging
- Leggermente sedare il mouse per inalazione di isoflurano in una camera di induzione (1,5% in aria per 1 a 1,5 min).
- Anestetizzare l'animale con una iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina / xilazina (100 mg / kg, 10 mg / kg). Un tale anestesia permette tipicamente 45 min di osservazione. Per eseguire sessioni di imaging più lunghi, mouse viene posizionato sotto inalazione continua di isoflurano inaria (0,25-0,75%).
- Applicare una pomata oculare per evitare il disseccamento degli occhi.
- Mettere l'animale su un telaio stereotassico e bloccare il cranio con le earbars.
- Per visualizzare i vasi sanguigni, un colorante fluorescente può essere iniettato per via endovenosa.
- Se la finestra appare sporco, può essere pulito rimuovendo delicatamente i detriti con una lama sottile e l'angolo di un tessuto. Non utilizzare alcool per pulire la finestra in quanto non sempre è compatibile con cemento dentale e può raffreddare il cervello sotto la finestra.
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Risultati
Una volta che il protocollo chirurgico viene eseguito (Figura 1), gli animali possono essere osservati mediante microscopia a fluorescenza per settimane fino al sacrificio. Una reazione infiammatoria può essere osservata dopo l'intervento chirurgico che scompare entro una o due settimane. La crescita del tumore può essere osservato da varie tecniche di microscopia a fluorescenza incluse macroscopia e microscopia a due fotoni (Figura 2). Immagini di esempio qui raffigurati sono stati...
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Discussione
Questo approccio consente l'uso di metodi di imaging ottico per monitorare per giorni e settimane la crescita di un glioma ortotopicamente impiantato. Lo stesso animale può successivamente essere sottoposto a qualsiasi modalità di imaging cerebrale durante il corso della patologia; eppure la preparazione specifica microscopia a due fotoni offre l'opportunità unica di ottenere una risoluzione subcellulare all'interno del cervello dell'animale vivente. Il nostro protocollo presenta il vantaggio di far risp...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano sentitamente il Dott. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. Weber e A. Jaouen per voti discussioni; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, il personale della struttura animale in IBDML e il personale della piattaforma di imaging PicSIL a IBDML per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) a GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) per FD, per borse di studio dalla Fédération de la Recherche Médicale e Cancéropôle PACA alla CR.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Drill | Dremel (Germania) | 398 | qualsiasi trapano osseo chirurgico di alta qualità sarebbe sufficiente |
| Fresa per trapano (#1/4 Carbide Round Burr) | World Precision Instruments (USA) | 501860 (#1/4) | venduto anche da Harvard |
| Apparatus Forbici per tessuti | World Precision Instruments (USA) | 14395 | |
| Pinzetta Dumont M5S | World Precision Instruments (USA) | 501764 | |
| Cemento dentale | GACD (USA) | 12-565 & 12-568 | |
| Cianoacrilato | Eleco-EFD (Francia) | Cianolit 201 | |
| Capillari di vetro senza filamento | Clark Electromedical Instruments (UK) | GC100-15 | |
| Siringa da microlitro (25 &; l) | Hamilton (USA) | 702 | |
| Micromanipolatore | World Precision Instruments (USA) | Kite-R | |
| derivazione T (rubinetto a 3 vie - Luer lock) | World Precision Instruments (USA) | 14035-10 | |
| Stereotactic frame (adattatore per mouse) | World Precision Instruments (USA) | 502063 | |
| Vetrini coprioggetti | Warner Instruments (USA) | CS-5R (64-0700) | |
| Gel di destrano reticolato (Sephadex) G50 Coarse 100-300 µ m perline | Disponibile da vari fornitori tra cui Sigma (Germania) | ||
| Unguento oculare | TVM (Francia) | Ocry-gel | |
| Macroscopio a fluorescenza | Leica MZFLIII (Germania) | venduto anche da altre aziende | |
| Microscopio a due fotoni | Zeiss LSM 7MP (Germania) | venduto anche da altre aziende (Nikon, …) | |
| Laser a femtosecondi sintonizzabile a infrarossi (Maï-Taï) | Spectra Physics (USA) | venduta anche da altre società |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
