Articolo metodologico

Isolamento dei vasi sanguigni derivati ​​da Multipotent precursori del muscolo scheletrico umano

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DOI:

10.3791/51195

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21 agosto 2014

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1Stem Cell Research Center, Department of Bioengineering and Orthopedic Surgery, University of Pittsburgh, 2Department of Orthopedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Nazarbayev University Research and Innovation System, Nazarbayev University, 4Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California at Los Angeles, 5Department of Cell Biology, Erasmus MC Stem Cell Institute, 6OHSU Center for Regenerative Medicine, Oregon Health & Science University, 7Centre for Cardiovascular Science and MRC Centre for Regenerative Medicine, Queen's Medical Research Institute and University of Edinburgh, 8David Geffen School of Medicine and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California at Los Angeles, 9Stem Cell Research Center, Department of Orthopedic Surgery and McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

In questo articolo

Sommario

I vasi sanguigni all'interno del porto muscolo scheletrico diverse popolazioni precursori multi-lignaggio umane che sono ideali per applicazioni rigenerative. Questo metodo di isolamento permette la purificazione simultanea di tre popolazioni di cellule precursori multipotenti rispettivamente da tre strati strutturali dei vasi sanguigni: cellule endoteliali da miogenici intima, periciti dai media, e le cellule avventiziali da avventizia.

Abstract

Dalla scoperta delle staminali / cellule stromali mesenchimali (MSC), l'identità originaria e la localizzazione delle MSC sono state oscurate dal loro isolamento retrospettiva nella cultura. Recentemente, con l'ordinamento delle cellule fluorescenza-attivato (FACS), noi e altri ricercatori prospetticamente identificato e purificato tre sottopopolazioni di cellule precursori multipotenti associate alla vascolarizzazione del muscolo scheletrico umano. Queste tre popolazioni di cellule: cellule endoteliali miogeniche (MECS), periciti (PC), e le cellule avventiziali (ACS), sono localizzati rispettivamente ai tre strati strutturali dei vasi sanguigni: intima, media e avventizia. Tutte queste cellule staminali del sangue-nave-derivato umano (hBVSC) popolazioni esprimono non solo i marcatori MSC classiche, ma possiedono anche le potenzialità di sviluppo mesodermiche simili a MSC tipici. In precedenza, MECS, PC e AC sono state isolate tramite protocolli distinti e successivamente caratterizzato in studi separati. L'attuale prot isolamentoOcol, attraverso modifiche al processo di isolamento e le rettifiche dei marcatori di superficie delle cellule selettive, ci permette di purificare contemporaneamente tutte e tre le sottopopolazioni hBVSC da FACS da una singola biopsia muscolare umana. Questo nuovo metodo non solo snellire l'isolamento di più sottopopolazioni BVSC ma facilitare anche le future applicazioni cliniche di hBVSCs per diversi scopi terapeutici.

Introduzione

Muscolo scheletrico umano è stato considerato una fonte clinicamente attraente di cellule staminali / progenitrici. Il muscolo scheletrico non contiene solo impegnata progenitori miogenici, mioblasti scheletrici, ma anche le cellule staminali miogeniche primitive, comprese le cellule satelliti e cellule staminali derivate dal muscolo (MDSCs) 1. L'uso di cellule umane di derivazione muscolari staminali / progenitrici, autologo o allogenico, nella medicina rigenerativa è stato ampiamente studiato in modelli animali preclinici e sperimentazioni cliniche. Le applicazioni rigenerative delle cellule staminali / progenitrici muscolari vanno dalla rigenerazione del muscolo distrofico nella distrofia muscolare di Duchenne (DMD) pazienti per riparare il cuore danneggiato nei pazienti con infarto.

Dalla scoperta delle staminali / cellule mesenchimali stromali (MSC) e di altre popolazioni di cellule precursori multipotenti, comprese le cellule multipotenti derivate dal midollo osseo progenitrici adulto (MAPCs) e le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (ADSCs), staminali adulte /cellule progenitrici sono stati ampiamente studiati fino ad oggi 1-9. Tuttavia, la loro identità originaria e localizzazione in situ sono state oscurate dai metodi di isolamento retrospettivi. Recentemente, utilizzando cellule fluorescenza-attivato (FACS), noi e altri gruppi hanno prospetticamente identificato e purificato tre popolazioni di cellule precursori multipotenti da vasi sanguigni all'interno del muscolo scheletrico umano e diversi altri organi: cellule endoteliali miogenici (MECS), periciti (PC), e le cellule avventiziali (ACS) 10. Questi tre sottopopolazioni di cellule umane staminali-vasi sanguigni derivati ​​(hBVSCs) si trovano, rispettivamente, nei tre strati strutturali dei vasi sanguigni: tunica intima, tonaca media, e la tunica avventizia. Più in particolare, MECs e PC sono rilevati in microvasi e capillari mentre ACS sono localizzate nello strato avventizia delle arterie più grandi e le vene. Ogni sottoinsieme di cellule precursori esprime una combinazione unica di antigeni di superficie cellulare: MECs (CD34 + / 56 + / 144 + / 45 -), PC (CD146 + / 34 - / 45 - / 56 -) e AC (CD34 + / 31 - / 45 - / 56 - / 146 -).

Ulteriore caratterizzazione di questi sottoinsiemi hBVSC ha rivelato che tutti e tre popolazioni di cellule precursore possiedono potenzialità di sviluppo mesodermiche simili a MSC tipici, tra cui miogenesi scheletrica, osteogenesi, condrogenesi, e adipogenesi. Tutti i sottoinsiemi hBVSC mostrano anche i marcatori MSC classici, tra cui CD44, CD73, CD90 e CD105, al momento e nella cultura. Collettivamente questi elementi di prova sostenuto l'origine vascolare delle MSC. Inoltre, le capacità terapeutiche di MECs, PC e AC sono stati recentemente dimostrato in studi separati. MECs ordinati da biopsie muscolari umane adulte sono stati mostrati per rigenerare i muscoli feriti e distrofici scheletriche e riparazione feriti miocardio più efficiente di mioblasti scheletrici e endo vascolarecellule thelial (ECS). PC purificato da diversi organi umani hanno anche dimostrato di riparare / rigenerare i muscoli scheletrici feriti e distrofiche e contribuire al pool delle cellule satellite 13-16. Molto recentemente, abbiamo dimostrato che i PC derivate dal muscolo scheletrico umano riparare efficacemente il miocardio infartuato mediante effetto paracrino indiretta e interazioni cellulari dirette 17. ACs, d'altra parte, sono stati direttamente isolata dai vasi sanguigni espiantati o purificato mediante FACS da tessuto adiposo umano e muscolo scheletrico. Una notevole effetto pro-angiogenico di ACS è stata dimostrata in un topo arti posteriori modello di ischemia 19. Inoltre, ACS hanno anche dimostrato di riparare il miocardio infartuato più efficiente rispetto MSC convenzionali, indicando il robusto potenziale terapeutico di ACS in ischemico riparazione dei tessuti 20.

L'attuale protocollo prevede la purificazione simultanee, prospettico purificazione di MECS, PC, eACs dal sistema vascolare di un singolo biopsia muscolare scheletrico umano. Questo ci permette di studiare e / o scegliamo la sottopopolazione hBVSC ottimale per diversi scopi terapeutici. Inoltre, questa nuova tecnica amplia ulteriormente il repertorio di cellule staminali / progenitrici che possono derivare dal muscolo scheletrico umano, che lo rende una fonte ideale di cellule precursori multipotenti per la medicina rigenerativa.

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Protocollo

1 Biopsia muscolare Processing

  1. Preservare biopsia muscolare scheletrico umano su ghiaccio in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) addizionato con siero fetale bovino 5% (FBS) e 1% penicillina-streptomicina (P / S) durante il trasporto.
  2. Dopo la ricezione della biopsia muscolare, rimuovere il campione dal contenitore di trasporto e lavare due volte in tampone fosfato salino (PBS), integrato con la soluzione antibiotica-antimicotica 2% (A / A) in condizioni sterili.
  3. Rimuovere la adiposo allegato e del tessuto connettivo con le forbici sterili e pinze in DMEM addizionato con 2% A / A.
  4. Rimuovere grandi vasi sanguigni sotto il microscopio di dissezione e successivamente tagliare il campione muscolari in piccoli pezzi (<1 cm 2 di dimensione).
  5. Conserva pezzi di muscolo tagliati (<5 grammi) in 20 ml di terreno di conservazione (PM; DMEM supplementato con 10% FBS e 1% P / S) a 4 ℃ fino a 5 giorni.

2. Muscle Dissociationi e isolamento delle cellule

  1. Il giorno di isolamento delle cellule, rimuovere pezzi di muscolo dal PM e lavare due volte in PBS addizionato con 2% P / S. Per rendere la soluzione Kjeldahl, tipo I, di tipo II, e collagenasi di tipo IV (100 mg / ml) al momento in PM.
  2. Tritare finemente e tritare meccanicamente pezzi muscolari con forbici sterili e pinze in una piastra di Petri con una piccola quantità di PM fino a che la soluzione passa da 10 ml pipetta sierologica senza coagulazione. Rimuovere il residuo adiposo e del tessuto connettivo durante questo processo. Utilizzare almeno 8-10 grammi di muscolo adulto o 2 grammi di muscolo fetale per ogni isolamento delle cellule.
  3. Trasferire 4-5 grammi di muscolo adulto macinata a 20 ml (o 2 grammi di muscolo fetale tritata in 10 ml) Ofthe soluzione di digestione con un 10 ml pipetta sierologica. Digest per 50 - 60 minuti a 37 ℃ su un agitatore orbitale a 70-80 rpm. Ottimizzare il rendimento superficie cellulare e la conservazione antigene regolando il tempo di digestione e / o la velocità di agitazione di conseguenza in base alla quantitàdel tessuto. Osservare lo stato di digestione ogni 15-20 minuti fino a quando la torbidità quasi cancella.
  4. Pipettare vigorosamente il tessuto digerito 3-5 volte con 10 ml pipetta sierologica. Aggiungere la stessa quantità di PM per fermare la reazione e centrifugare a 400 xg per 4 min.
  5. Rimuovere con attenzione il surnatante; risospendere il pellet con 10 ml di PM per lavare, e poi filtrato attraverso un colino cella di 100 micron.
  6. Centrifugare a 400 xg per 4 minuti e rimuovere con cautela il surnatante. Pellet Risospendere in tampone di lisi degli eritrociti (155 mM NH 4 Cl, 10mM KHCO 3, 0,1 mm EDTA), filtrare attraverso un filtro 70 micron cellulare per ottenere una sospensione singola cella, e poi incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Filtrare attraverso un colino cella 70 m nuovo se qualsiasi precipitazione si osserva.
  7. Centrifugare a 400 xg per 4 minuti e risospendere il pellet di cellule in 0,5 ml di PBS. Contare il numero di cellule. Ottenere un totale di almeno 5 milioni di cellule per l'ordinamento delle cellule. Diluire il singlsospensione e cellulare per meno di 5 milioni di cellule per ml con PBS per la colorazione. Estrarre 50-100 ml di sospensione cellulare e suddivisa in 11 tubi per colorazioni di controllo (controllo senza macchia, controlli negativi e monocolore controlli positivi).

3 Etichettatura cellulare e ordinamento

  1. Incubare la sospensione di cellule singole per 10 min a 4 ℃ nel siero di topo (diluito 1:10 in PBS) per bloccare scopo se necessario.
  2. Aggiungi CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, e CD146-FITC (tutti 1: 100) nella sospensione di cellule singole e incubare per 20 minuti a 4 ℃. Per il controllo negativo, aggiungere le concentrazioni equivalenti di APC-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PE, e gli anticorpi IgG isotipo FITC-coniugato e incubare per 20 minuti a 4 ℃. Per monocolore controlli positivi, aggiungere le concentrazioni equivalenti di CD34-APC, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PE, e CD146-FITC singolarmente in ciascuna provetta e incubare per 20 minuti a 4 ℃.
  3. Dopo l'incubazione, Centrifugare a 400 xg per 4 minuti per lavare. Risospendere il pellet di cellule in 1 - 2 ml di DMEM supplementato con 5% FBS e 1% P / S. La concentrazione finale della sospensione cellulare deve essere inferiore a 5 milioni di cellule per ml. Aggiungere 7-AAD (1: 100) e incubare per 15 minuti a RT per l'esclusione di cellule morte. Per il controllo negativo e monocolore controlli positivi, pellet cellulari risospendere in 0,5 ml di DMEM supplementato con 5% FBS e 1% P / S.
  4. Trasferire tutte le sospensioni cellulari a fondo rotondo flusso polistirolo citometria a tubi. Preparare provette per il prelievo di cellule (ogni tubo è pre-riempita con 500 ml di terreno di coltura appropriato: MPM per MECs; EGM-2 per PC, media CA per ACS). Sospensioni cellulari Trasporto su ghiaccio al cell sorter.
  5. Sospensioni cellulari eseguire sul cell sorter nell'ordine del controllo senza macchia, controlli negativi, monocolore controlli positivi, e la sospensione cellulare principale mentre la regolazione dell'intensità del laser, la compensazione dei canali, e la popolazione di cellule gating rigorosamente per massimizzare cellulare purezza (fare riferimento agli articoli pubblicati da Giove e di altre riviste per i dettagli di citometria a flusso).
  6. Raccogliere popolazioni cellulari desiderati nei tubi di raccolta appropriati. Conservare le cellule raccolte in 4 ℃ se non semina immediatamente.

4. post-smistamento Colture Cellulari

  1. Seed MECs appena ordinate (P0) a <10.000 cellule / cm 2 in MPM su piastre pre-rivestite di tipo collagene. Per la successiva passaging di MECs, sementi 3.500 - 4.000 cellule / cm 2 in MPM su piastre / flaconi pre-rivestite di tipo collagene.
  2. Seed PC appena ordinate (P0) a <20.000 cellule / cm 2 in EGM-2 su piastre rivestite con appena lo 0,2% di gelatina. Per la successiva passaging di PC, cellule dividere in rapporto 1: 3 in mezzo PC (DMEM supplementato con 20% FBS e 1% P / S) su piastre di coltura polistirolo regolari fino P2. Da P3 in poi, le cellule del seme a 6.500 - 7.000 cellule / cm 2 in media PC sul regolari cultura polistirolo piatti / fiaschi.
  3. Seed appena ordinato AC (P0) a <20.000 cellule / cm 2 a medio AC (DMEM supplementato con 20% FBS e 1% P / S) su piastre di coltura polistirolo regolari. Per la successiva passaging di ACS, cellule seme a 6.500 - 7.000 cellule / cm 2 a medio AC sul regolari cultura polistirolo piatti / fiaschi.

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Risultati

Parametri FACS vengono prima corretti sulla base dei dati ottenuti dal controllo senza macchia, controlli negativi, e un solo colore controlli positivi. Dopo esclusione delle cellule morte, sospensione cellulare fluorescenza marcato viene sottoposto ad una serie di selezioni marcatori di superficie cellulare negativi e positivi. In primo luogo, le cellule CD45 + sono gated prima CD56 + e CD56 - le cellule sono separate dal CD45 - frazione. Il CD56 + frazione è ulter...

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Discussione

Identificazione e purificazione di sottopopolazioni hBVSC rappresentano un importante passo avanti nella comprensione di MSC ontogenesi. Vi è una crescente evidenza che indica l'origine perivascolare di cellule staminali mesenchimali e l'associazione tra cellule precursori tessuto-specifici e vasi sanguigni 22-25. Inoltre, la capacità di isolare sottopopolazioni omogenee di hBVSCs AIDS ulteriormente la comprensione di MSC eterogeneità e la biologia delle cellule vascolari 26.

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Dichiarazioni

J.H. ha ricevuto una remunerazione da Cook MyoSite, Inc. per i servizi di consulenza e per le royalties ricevute dalle licenze tecnologiche durante il periodo in cui è stata eseguita la ricerca di cui sopra. Tutti gli altri autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare Alison Logar per l'eccellente assistenza tecnica di citometria a flusso. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Dipartimento della Difesa (JH), l'Henry J. Mankin sedia dotata (JH), e il Ministero dell'Istruzione e della Scienza della Repubblica del Kazakistan (AS). CWC è stato sostenuto in parte dalla borsa di studio predoctoral American Heart Association (11PRE7490001). M.Corselli è stato sostenuto dal California Institute for Regenerative Medicine borsa di formazione (TG2-01169).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Collagenasi tipo 1SigmaC5894Fiala sterile
Collagenasi tipo 2SigmaC1764Fiala sterile
Collagenasi tipo 4SigmaC1889Fiala sterile
Anti-umano CD34 APCBD Pharmingen555824Mantenere sterile
Anti-umano CD45 APC-Cy7BD Pharmingen557833Mantenere sterile
Anti-umano CD56 PE-Cy7BD Pharmingen 557747Mantenere sterile
Anti-umano CD144 PEBeckman CoulterA07481Mantenere sterile
Anti-umano CD146 FITCAbD SerotecMCA2141FMantenere sterile
FACS Aria II Citometroa flusso Becton-Dickinson
EGM-2 completoLonzaCC-3162Per la coltura di PC (solo P0)
DMEM alto glucosio (1X), liquido, con L-glutammina, senza piruvato di sodioInvitrogen11965Per la coltura di PC
DMEM alto glucosio (1X), liquido, con L-glutammina, con piruvato di sodioInvitrogen11995Per la coltura di MEC e AC
Siero fetale bovinoInvitrogen10437-028
Siero di cavallo inattivato termicamenteInvitrogen26050-088
Penicillina/streptomicinaInvitrogen15140-122
Antibiotico-antimicotico (100X)Invitrogen15240-062
Tripsina-EDTA 0,5% (10X)Invitrogen15400-054
Dulbecco' s PBS senza calcio e magnesioInvitrogen14190-250
Estratto di embrione di polloFiltro chimico accuratoCE650T-10prima dell'uso

Riferimenti

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