I vasi sanguigni all'interno del porto muscolo scheletrico diverse popolazioni precursori multi-lignaggio umane che sono ideali per applicazioni rigenerative. Questo metodo di isolamento permette la purificazione simultanea di tre popolazioni di cellule precursori multipotenti rispettivamente da tre strati strutturali dei vasi sanguigni: cellule endoteliali da miogenici intima, periciti dai media, e le cellule avventiziali da avventizia.
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Articolo metodologico
Isolamento dei vasi sanguigni derivati da Multipotent precursori del muscolo scheletrico umano
In questo articolo
Sommario
Abstract
Dalla scoperta delle staminali / cellule stromali mesenchimali (MSC), l'identità originaria e la localizzazione delle MSC sono state oscurate dal loro isolamento retrospettiva nella cultura. Recentemente, con l'ordinamento delle cellule fluorescenza-attivato (FACS), noi e altri ricercatori prospetticamente identificato e purificato tre sottopopolazioni di cellule precursori multipotenti associate alla vascolarizzazione del muscolo scheletrico umano. Queste tre popolazioni di cellule: cellule endoteliali miogeniche (MECS), periciti (PC), e le cellule avventiziali (ACS), sono localizzati rispettivamente ai tre strati strutturali dei vasi sanguigni: intima, media e avventizia. Tutte queste cellule staminali del sangue-nave-derivato umano (hBVSC) popolazioni esprimono non solo i marcatori MSC classiche, ma possiedono anche le potenzialità di sviluppo mesodermiche simili a MSC tipici. In precedenza, MECS, PC e AC sono state isolate tramite protocolli distinti e successivamente caratterizzato in studi separati. L'attuale prot isolamentoOcol, attraverso modifiche al processo di isolamento e le rettifiche dei marcatori di superficie delle cellule selettive, ci permette di purificare contemporaneamente tutte e tre le sottopopolazioni hBVSC da FACS da una singola biopsia muscolare umana. Questo nuovo metodo non solo snellire l'isolamento di più sottopopolazioni BVSC ma facilitare anche le future applicazioni cliniche di hBVSCs per diversi scopi terapeutici.
Introduzione
Muscolo scheletrico umano è stato considerato una fonte clinicamente attraente di cellule staminali / progenitrici. Il muscolo scheletrico non contiene solo impegnata progenitori miogenici, mioblasti scheletrici, ma anche le cellule staminali miogeniche primitive, comprese le cellule satelliti e cellule staminali derivate dal muscolo (MDSCs) 1. L'uso di cellule umane di derivazione muscolari staminali / progenitrici, autologo o allogenico, nella medicina rigenerativa è stato ampiamente studiato in modelli animali preclinici e sperimentazioni cliniche. Le applicazioni rigenerative delle cellule staminali / progenitrici muscolari vanno dalla rigenerazion....
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Protocollo
1 Biopsia muscolare Processing
- Preservare biopsia muscolare scheletrico umano su ghiaccio in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) addizionato con siero fetale bovino 5% (FBS) e 1% penicillina-streptomicina (P / S) durante il trasporto.
- Dopo la ricezione della biopsia muscolare, rimuovere il campione dal contenitore di trasporto e lavare due volte in tampone fosfato salino (PBS), integrato con la soluzione antibiotica-antimicotica 2% (A / A) in condizioni sterili.
- Rimuovere la adiposo allegato e del tessuto connettivo con le forbici sterili e pinze in DMEM addizionato con 2% A / A.
- Rimuovere grandi vasi sanguigni sotto il micr....
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Risultati
Parametri FACS vengono prima corretti sulla base dei dati ottenuti dal controllo senza macchia, controlli negativi, e un solo colore controlli positivi. Dopo esclusione delle cellule morte, sospensione cellulare fluorescenza marcato viene sottoposto ad una serie di selezioni marcatori di superficie cellulare negativi e positivi. In primo luogo, le cellule CD45 + sono gated prima CD56 + e CD56 - le cellule sono separate dal CD45 - frazione. Il CD56 + frazione è ulter.......
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Discussione
Identificazione e purificazione di sottopopolazioni hBVSC rappresentano un importante passo avanti nella comprensione di MSC ontogenesi. Vi è una crescente evidenza che indica l'origine perivascolare di cellule staminali mesenchimali e l'associazione tra cellule precursori tessuto-specifici e vasi sanguigni 22-25. Inoltre, la capacità di isolare sottopopolazioni omogenee di hBVSCs AIDS ulteriormente la comprensione di MSC eterogeneità e la biologia delle cellule vascolari 26.
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Dichiarazioni
J.H. ha ricevuto una remunerazione da Cook MyoSite, Inc. per i servizi di consulenza e per le royalties ricevute dalle licenze tecnologiche durante il periodo in cui è stata eseguita la ricerca di cui sopra. Tutti gli altri autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Alison Logar per l'eccellente assistenza tecnica di citometria a flusso. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del Dipartimento della Difesa (JH), l'Henry J. Mankin sedia dotata (JH), e il Ministero dell'Istruzione e della Scienza della Repubblica del Kazakistan (AS). CWC è stato sostenuto in parte dalla borsa di studio predoctoral American Heart Association (11PRE7490001). M.Corselli è stato sostenuto dal California Institute for Regenerative Medicine borsa di formazione (TG2-01169).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Collagenasi tipo 1 | Sigma | C5894 | Fiala sterile |
| Collagenasi tipo 2 | Sigma | C1764 | Fiala sterile |
| Collagenasi tipo 4 | Sigma | C1889 | Fiala sterile |
| Anti-umano CD34 APC | BD Pharmingen | 555824 | Mantenere sterile |
| Anti-umano CD45 APC-Cy7 | BD Pharmingen | 557833 | Mantenere sterile |
| Anti-umano CD56 PE-Cy7 | BD Pharmingen | 557747 | Mantenere sterile |
| Anti-umano CD144 PE | Beckman Coulter | A07481 | Mantenere sterile |
| Anti-umano CD146 FITC | AbD Serotec | MCA2141F | Mantenere sterile |
| FACS Aria II Citometro | a flusso Becton-Dickinson | ||
| EGM-2 completo | Lonza | CC-3162 | Per la coltura di PC (solo P0) |
| DMEM alto glucosio (1X), liquido, con L-glutammina, senza piruvato di sodio | Invitrogen | 11965 | Per la coltura di PC |
| DMEM alto glucosio (1X), liquido, con L-glutammina, con piruvato di sodio | Invitrogen | 11995 | Per la coltura di MEC e AC |
| Siero fetale bovino | Invitrogen | 10437-028 | |
| Siero di cavallo inattivato termicamente | Invitrogen | 26050-088 | |
| Penicillina/streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | |
| Antibiotico-antimicotico (100X) | Invitrogen | 15240-062 | |
| Tripsina-EDTA 0,5% (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Dulbecco' s PBS senza calcio e magnesio | Invitrogen | 14190-250 | |
| Estratto di embrione di pollo | Filtro chimico accurato | CE650T-10 | prima dell'uso |
Riferimenti
- Peault, B., et al. Stem and Progenitor Cells in Skeletal Muscle Development. Maintenance, and Therapy. Mol Ther. 15, 867-877 (2007).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat C....
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Ristampe e permessi
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