Piattaforma microfluidica per la misurazione dei neutrofili Chemiotassi dal Lordo Sangue intero

Summary

Dettagli Questo protocollo un saggio progettato per misurare la chemiotassi dei neutrofili umani da una gocciolina di sangue intero con robusto riproducibilità. Questo approccio elude la necessità di una separazione dei neutrofili e richiede solo pochi minuti di dosaggio tempo di preparazione. Il chip microfluidica consente la misura ripetuta di chemiotassi dei neutrofili nel tempo nei neonati o piccoli mammiferi, dove il volume del campione è limitata.

Abstract

I neutrofili hanno un ruolo essenziale nella protezione contro le infezioni e il loro numero nel sangue sono spesso misurato in clinica. Superiore conta dei neutrofili nel sangue sono di solito un indicatore di infezioni in corso, mentre una bassa conta di neutrofili sono un segnale di avvertimento per i rischi più elevati per le infezioni. Per realizzare le loro funzioni, neutrofili devono anche essere in grado di spostare efficacemente dal sangue dove trascorrono la maggior parte della loro vita, nei tessuti, dove si verificano infezioni. Di conseguenza, eventuali difetti nella capacità dei neutrofili di migrare può aumentare il rischio di infezioni, anche quando sono presenti in numero appropriato nel sangue neutrofili. Tuttavia, la misurazione dei neutrofili capacità di migrazione nella clinica è un compito impegnativo, che richiede tempo, richiede grandi quantità di sangue, e conoscenze specifiche. Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo progettato un robusto saggi microfluidica per la migrazione dei neutrofili, che richiede una singola goccia di sangue non trasformati, circumsfiati la necessità di una separazione dei neutrofili, ed è facile da quantificare su un semplice microscopio. In questo saggio, neutrofili migrano direttamente dalla gocciolina di sangue, attraverso piccoli canali, verso la sorgente di chemiotattico. Per impedire il flusso granulare di globuli rossi attraverso gli stessi canali, abbiamo implementato filtri meccanici con virata a gomito che bloccare selettivamente l'anticipo di globuli rossi. Abbiamo convalidato il test confrontando la migrazione dei neutrofili dalle gocce di sangue raccolti da dito cazzo e sangue venoso. Abbiamo anche confrontato questi sangue intero (WB) fonti di migrazione dei neutrofili da campioni di neutrofili purificati e abbiamo trovato la velocità costante e la direzionalità tra le tre fonti. Questa piattaforma microfluidica consentirà lo studio della migrazione dei neutrofili umana in clinica e l'impostazione della ricerca per far progredire la nostra comprensione delle funzioni dei neutrofili nella salute e nella malattia.

Introduction

Traffico neutrofili svolge un ruolo critico nel determinare l'avanzamento e la risoluzione di molte condizioni infiammatorie, tra aterosclerosi ^1, infezione batterica o sepsi ^2, e ustioni ^3. Per il loro importante contributo alle condizioni di salute e di malattia, conta dei neutrofili è parte dello standard di analisi del sangue spesso considerati nei laboratori clinici e di ricerca. Tuttavia, pur essendo una delle prove più diffusi, il valore di conteggio dei neutrofili nella diagnosi di infezione e sepsi è stato spesso interrogato ^4. Per esempio, uno studio dei neutrofili in pazienti ustionati rivelato che cont....

Protocol

1. Fabbricazione di dispositivi Microfluidic

1. Utilizzando tecniche fotolitografiche standard fabbricare il maestro stampo wafer in una camera pulita di classe 1000. Reticolo i primi 3 micron-sottile strato di fotoresist negativo a base epossidica per definire i canali di migrazione secondo le istruzioni del produttore. Reticolo secondo strato 50 micron di spessore per definire le camere cellulare carico e chemochine.
2. Utilizzare il wafer fantasia di lanciare dispositivi (PDMS) polidimetilsilossano. Agitare vigorosamente PDMS (20 g) con iniziatore (2 g) per 5 minuti usando forchetta di plastica in grande vassoio pesatura plastica.
3. Versare ....

Results

Il sangue intero (WB) saggio chemiotassi dei neutrofili è stata convalidata misurando l'accumulo di neutrofili verso un gradiente fMLP (Film S1). I risultati confermano che i globuli rossi sono intrappolati dal pettine filtrazione mentre neutrofili (blu) sono in grado di migrare attivamente di sangue intero (figura 3A e Movie S1). Il gradiente lineare stabile chemiotattico (verde) formato dal sangue intero dispositivo microfluidica è stata confermata usando destrano mar.......

Discussion

In questo lavoro, abbiamo sviluppato una piattaforma microfluidica per misurare neutrofili chemiotassi da una goccia di sangue (2 microlitri). La filtrazione on-chip meccanica dei globuli rossi da migrare attivamente neutrofili elude la necessità di metodi ingombranti separazione cellulare come la densità gradienti ^10, selezione positiva ¹¹ o selezione negativa ^12, che sono inclini a introdurre artefatti attivando neutrofili. La filtrazione meccanica dei globuli rossi distingue la nostra.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
vetrini standard	Fisher Scientific	125495	1 X 3 pollici
Piastra con fondo in vetro	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, diametro punta 5,0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, diametro punta 1,5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Preparazione e analisi del saggio microfluidico
Punta per pipetta con caricamento in gel	Fisher Scientific	02-707-139
Siringa	Fisher Scientfic	309602
Ago con punta smussata, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Eparina	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich Albumina
sierica umana	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0,2% concentrazione finale in HBSS
Fibronectina	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
Lancetta di sicurezza SurgiLance, profondità 2,2 mm, 22 G		SLN240
Colorazione Hoescht	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
Kit per l'arricchimento dei neutrofili umani EasySep	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg / Blue M Forno	Thermo Scientific	13-258-30C
Pinzette di precisione in acciaio inossidabile Techni	Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Essiccatore sottovuoto resistente agli agenti chimici	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Piastra riscaldante digitale	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE microscopio invertito	Nikon - Micro Video Instruments Inc.
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Obiettivo	Nikon - Micro Video Instruments Inc.
Lumen 200 con guida luminosa da 2 metri per Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Eccitatori a banda stretta da 32 mm - Emettitori da 25 mm	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 raffreddato CCD Camera 1.600 x 1.200 pixel	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C