Isolamento di mRNA associati con mitocondri di lievito per studiare i meccanismi di traduzione localizzata

Sommario

Molti mRNA codificanti proteine ​​mitocondriali sono associate alla membrana esterna mitocondriale. Descriviamo una procedura di frazionamento subcellulare volta a isolamento dei mitocondri di lievito con i suoi mRNA e ribosomi associati. Questo protocollo può essere applicato a cellule cresciute in condizioni diverse per rivelare meccanismi di localizzazione mRNA e traduzione localizzata vicino ai mitocondri.

Abstract

La maggior parte delle proteine ​​mitocondriali sono codificati nel nucleo e devono essere importati nel organello. Import può verificarsi durante la proteina è sintetizzata nei pressi dei mitocondri. Il supporto per questa possibilità deriva da studi recenti, in cui molti mRNA codificanti proteine ​​mitocondriali hanno dimostrato di essere localizzato nei pressi mitocondri. Insieme con dimostrazioni precedenti di associazione ribosomi 'con la membrana esterna, questi risultati suggeriscono un processo di traduzione localizzata. Tale traduzione localizzata può migliorare l'efficienza di importazione, di fornire siti di regolazione unici e ridurre al minimo i casi di espressione ectopica. Diversi metodi sono stati utilizzati per caratterizzare i fattori ed elementi che mediano traduzione localizzata. Standard tra questi è frazionamento subcellulare mediante centrifugazione differenziale. Questo protocollo ha il vantaggio di isolamento di mRNA, ribosomi e proteine ​​in una singola procedura. Questi possono poi essere caratterizzata da diverse molecolare e biMetodi ochemical. Inoltre, trascrittomica e proteomica metodi possono essere applicati al materiale risultante, permettendo quindi intuizioni genoma di ampiezza. L'utilizzo di lievito come organismo modello per tali studi ha i vantaggi di velocità, costi e semplicità. Inoltre, gli strumenti genetici avanzati e ceppi di delezione disponibili agevolare la verifica dei fattori candidati.

Introduzione

Le cellule eucariotiche sono organizzate in compartimenti distinti aventi funzioni specifiche. Per realizzare la sua funzione, ciascun compartimento contiene un insieme unico di proteine ​​che sono essenziali per la sua attività. Un possibile meccanismo attraverso il quale queste proteine ​​si avvicinano loro scompartimento è di ^1,2 traduzione localizzata. In questo processo, la proteina è sintetizzata a destinazione ribosomi e mRNA che si trovano lì. Tra i probabili vantaggi di una versione localizzata sono aumentati efficienza della proteina targeting, ridotto bisogno di accompagnatori di proteine, e consentendo meccanismi di regolazione site-specific. I....

Protocollo

1. I mitocondri Purificazione

Pesare il pellet di cellule. Circa 0,6 g si ottengono da cellule di 100 ml.

1. Crescere 100-150 ml di cellule di lievito di OD ₆₀₀ = 1-1.5 al 30 ° C su un terreno di crescita non fermentabili, come mezzo di crescita a base-galattosio, per arricchire di mitocondri.
2. Centrifugare le cellule a 3.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
3. Lavare il pellet con acqua bidistillata e centrifugare di nuovo. Scartare il surnatante.
4. Risospendere il pellet in 1 ml DTT tampone in 0,5 g di cellule. È importante trattare le cellule con un....

Risultati

Questo protocollo permette la separazione di una frazione-mitocondri contenente da componenti citosolici. Il modo migliore per testare il suo successo è quello di eseguire l'analisi del nord e l'analisi occidentale (Figura 1) per i campioni delle diverse fasi di isolamento. Tre parametri per la qualità di isolamento sono derivati ​​da queste analisi. In primo luogo, se l'RNA o proteine ​​nei campioni sono intatti - questi saranno rilevati come bande distinte nelle analisi. Eventi di degradaz.......

Discussione

I progressi tecnologici nella diagnostica per immagini hanno dato strumenti ad alta risoluzione per studiare la localizzazione mRNA. Oggi, si può misurare il movimento di una singola molecola di mRNA a scala msec ^23-26. Tuttavia, gli approcci tradizionali biochimici, come quello sopra descritto, sono anche informativo e sono preferibili in alcuni casi. Isolamento Biochemical permette la purificazione di un grande repertorio di mRNA e proteine, ed è quindi preferibile per studi genoma di ampiezza. In un singol.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Estratto
BactoPeptone
Galattosio			Non sterilizzare in autoclave il galattosio
Terreno			Per l'arricchimento mitocondriale, è necessario utilizzare qualsiasi fonte di carbonio non fermentabile, come il terreno di crescita a base di galattosio sterilizzato all'1% Estratto di lievito, 2% BactoPeptone, 2% Galattosio
0,1 M Tris-HCl, pH 9,4
30 mM Tris-HCl, pH 7,6
Ditiotreitolo (DTT),
10 mM, tampone			0,1 M, TrisHCl, pH 9,4, 10 mM, Ditiotreitolo (DTT). Preparare fresco ogni volta
1,2 M Sorbitolo
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0,2 μ m filtro
Tampone			1,2 M Sorbitolo, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filtra questo buffer (0,2 μ m) e conservare a temperatura ambiente per un uso futuro
Zimoliasi 20T			20.000 U/g
Terreno			recupero Terreno di crescita a base di galattosio integrato con 1 M Sorbitolo
0,1 mg/ml Cicloesimide (CHX)
0,6 M Mannitolo
5 mM MgAc
100 mM KCl
0,5 mg/ml Eparina
1 mM Fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF)
Mannitolo Tampone			0,6 M Mannitolo, 30 mM Tris-HCl pH7,6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Aggiungere fresco: 0,5 mg/ml Eparina, 0,1 mg/ml CHX e 1mM (PMSF). Filtra questo tampone e usalo ghiacciato
8 M Guanidinio-HCl
100% e 70% etanolo (EtOH)
3 M Acetato di sodio, pH 5,2
10 M LiCl soluzione
250 mM Tris HCl pH 6,8
SDS
Glicerolo
β-Mercaptoetanolo
Blu
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6,8, 8% SDS, 40% Glicerolo, 20% β-mercaptoetanolo e 0,02% Blu di bromofenolo
Omogeneizzatore a balze della capacità di 15 ml dotato di pestello