Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all&#39;attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

Melissa V. Fernandez; Elizabeth A. Miller; Nina Bhardwaj

doi:10.3791/51284

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Articolo metodologico

Attivazione e misurazione dei NLRP3 inflammasome all'attività utilizzando IL-1β in cellule dendritiche umane derivate da monociti

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DOI:

10.3791/51284

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22 maggio 2014

Melissa V. Fernandez¹ , Elizabeth A. Miller² , Nina Bhardwaj³

¹Department of Pathology, New York University School of Medicine, ²Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Mount Sinai Medical Center, ³Division of Hematology and Oncology, Hess Center for Science and Medicine, Mount Sinai Medical Center

In questo articolo

Sommario

Le cellule dendritiche (DC) secernono IL-1β in risposta al riconoscimento di TLR8 purinico sintetico, R848, seguita dall'attivazione inflammasome NLRP3 con nigericin, dunque, IL-1β può essere utilizzata per misurare l'attività inflammasome NLRP3. Intracellulare colorazione citochina, immunoblotting, ELISA e sono utilizzati per misurare con precisione NLRP3 inflammasome adescamento e l'attivazione tramite l'espressione di IL-1β.

Abstract

Processi infiammatori derivanti dalla secrezione di interleuchina (IL) -1 citochine famiglia di cellule immunitarie portano a infiammazione locale o sistemica, rimodellamento tissutale e riparazione, e il controllo virologico ^{1, 2.} L'interleuchina-1β è un elemento essenziale della risposta immunitaria innata e contribuisce ad eliminare agenti patogeni invasori evitando la creazione di infezione persistente ^1-5.

Inflammasomes sono la piattaforma chiave di segnalazione per l'attivazione di interleuchina 1 enzima di conversione (ICE o caspasi-1). Il inflammasome NLRP3 richiede almeno due segnali in DC per provocare la secrezione di IL-1β ^6. Espressione proteica Pro-IL-1β è limitato in cellule quiescenti; Pertanto è richiesto un segnale di innesco per IL-1β trascrizione e l'espressione della proteina. Un secondo segnale rilevato dai risultati NLRP3 nella formazione del multi-proteina NLRP3 inflammasome. La capacità delle cellule dendritiche di responsabilitàd per i segnali necessari per la secrezione di IL-1β può essere testato utilizzando un purinico sintetico, R848, che è rilevata da TLR8 in monociti umana derivata cellule dendritiche (moDCs) di cellule primarie, seguita da attivazione del inflammasome NLRP3 con la tossina batterica e ionophore potassio, nigericin.

Monociti DC derivati vengono facilmente prodotte nella cultura e forniscono significativamente più cellule purificate di cellule dendritiche mieloidi umane. Il metodo qui presentato differisce da altri saggi inflammasome dal fatto di utilizzare in vitro umana, invece di topo derivata, DC permettendo così lo studio della inflammasome nella malattia umana e infezione.

Introduzione

L'attivazione del sistema immunitario innato è necessario per orientare le risposte immunitarie adattative durante l'infezione, la malattia, e la vaccinazione ^7. Le cellule dendritiche sono le più potenti cellule presentanti l'antigene del sistema immune innato; sono specializzati per l'assorbimento di antigeni, la migrazione ai linfonodi, e l'attivazione di ingenuo CD4 ⁺ e CD8 ⁺ citolitica cellule T ^8-10. Per attivare il rilevamento rapido patogeno il sistema immunitario innato utilizza numerosi germinali codificato pattern recognition recettori (PRR), che riconoscono patogeni conservati motivi derivati....