Articolo metodologico

Un saggio di legame High Throughput MHC II per l'analisi quantitativa dei peptidi epitopi

DOI:

10.3791/51308

⸱

25 marzo 2014

 ,  ,  , 
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Institute for Immunology and Informatics, University of Rhode Island, 3Department of Computer Science, Dartmouth College

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Sommario

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Saggi biochimici con molecole ricombinanti umani MHC II grado di fornire rapide, approfondimenti quantitativi nella identificazione degli epitopi immunogenico, la cancellazione o il design. Qui, un saggio di legame peptide-MHC II scalata a 384 pozzetti è descritto. Questo formato conveniente, deve risultare utile nel campo della proteina deimmunization e progettazione di vaccini e sviluppo.

Abstract

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Saggi biochimici con molecole ricombinanti umani MHC II grado di fornire rapide, approfondimenti quantitativi nella identificazione degli epitopi immunogenico, la cancellazione o il design 1,2. Qui, un saggio di legame peptide-MHC II viene scalata a 384 pozzetti. Il protocollo ridotta riduce i costi dei reagenti del 75% ed è più alta velocità di quanto precedentemente descritto protocolli da 96 pozzetti 1,3-5. In particolare, il disegno sperimentale permette l'analisi robusta e riproducibile fino a 15 peptidi contro un allele MHC II per 384 pozzetti ELISA. Utilizzando un'unica movimentazione robot liquido, questo metodo consente un ricercatore di analizzare circa novanta peptidi prova in triplice copia in un range di concentrazioni otto e quattro tipi di alleli MHC II in meno di 48 ore. Altri lavorano nei campi di proteine ​​deimmunization o la progettazione di vaccini e sviluppo può trovare il protocollo per essere utile nel facilitare il proprio lavoro. In particolare, le istruzioni passo-passo e il formato visivodi Giove dovrebbe consentire ad altri utenti di stabilire rapidamente e facilmente questa metodologia nei propri laboratori.

Introduzione

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Le proteine ​​sono la classe più rapida crescita di agenti terapeutici 6, e la rapida espansione delle condotte biotherapeutic ha focalizzato sempre più l'attenzione sulle sfide connesse con lo sviluppo e l'uso di farmaci proteici. Una considerazione unica deriva dal fatto che, in un sistema immunitario sano e funzionante, tutte le proteine ​​extracellulari sono campionati dalle cellule presentanti l'antigene (APC). Una volta internalizzato da APC, una proteina viene scissa in piccoli frammenti peptidici, e segmenti immunogenici putativi sono caricati nella scanalatura di classe II principali proteine ​​complessi di istocompatibilità (MHC II). ....

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Protocollo

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Quattro attività principali comprendono il saggio di legame peptide-MHC II: 1-Rilegatura: peptidi di prova in concorrenza con peptidi marcati di controllo per l'associazione in soluzione di proteine ​​MHC II solubili. Binding è misurata su una vasta gamma di concentrazioni di peptide di prova. 2-Capture: Dopo la reazione di legame avvicina equilibrio, complessi peptide-MHC II vengono catturati e separati dal peptide legato e proteine ​​mediante riconoscimento dipendente dalla conformazione con un anticorpo immobilizzato. 3-Detection: Catturato peptide di controllo è quantitativamente rilevata tramite fluorescenza in tempo risolto. 4-Analisi: i dati spettroscopici son....

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Risultati

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La sequenza peptidica matura di Enterobacter cloacae P99 beta-lattamasi (BLA) (GenBank ID # X07274.1) è stato analizzato con ProPred 16 per leganti peptidici putativi per MHC II allele DRB1 * 1501 (tabella 4). ProPred identificato 117 peptidi nonamer considerando un obbligatorio residuo P1 ancoraggio (cioè una M, L, I, V, F, Y, o W nella posizione 1, che è richiesto per MHC II vincolante 31). Ad una soglia del 5%, peptidi solo con punteggi superiori o uguali a 2,6.......

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Discussione

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Biotherapeutics si sono affermati come una pietra miliare della medicina moderna, che rappresentano quattro delle prime cinque farmaci più venduti nel 2012 32. Il settore biofarmaceutica ha mostrato una crescita sostenuta per diversi anni 6, e il continuo sviluppo di nuovi agenti, così come l'emergere dei biosimilari ha ampliato condotte biofarmaceutiche. Guardando al futuro, valutare e mitigare l'immunogenicità di terapie proteiche diventerà parte integrante dello sviluppo biotherapeutic f.......

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Dichiarazioni

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Leonard Moise è impiegato da e detiene stock option in EpiVax, Inc., una società di biotecnologia di proprietà privata si trova a Providence, RI. Il lavoro contenute in questo rapporto di ricerca è libera da ogni pregiudizio che potrebbe essere associato con gli obiettivi commerciali dell'azienda.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R01-GM-098977 e R21-AI-098.122 per CBK e KEG. RSS è stato sostenuto in parte da una Luce Foundation Fellowship e in parte da una borsa di studio Thayer Innovation Program presso la Scuola di Ingegneria Thayer.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tetraborato di sodio decaidratoSigma221732
acido citricoSigmaC1901
Fosfato di sodio bibasicoSigmaS7907
Trizma HClOmniPur9310
Tween-20SigmaP7949
100% DMSOSigmaD8418
Octyl-& beta;-D-glucopiranasideFischer29836-26-8
Pefa Bloc SCFRoche1158591600
Dulbecco' s 10x Soluzione salina tamponata con fosfatoInvitrogen14200-166
Tampone per test DELFIAPerkin Elmer4002-0010
Tampone di potenziamento DELFIAPerkin Elmer4001-0010
Streptavidina marcata con europioPerkin Elmer1244-360
L243 anticorpo anti-HLA-DRBiolegend307602
biotinilato Peptidi traccianti21st Century BiochemicalsOrdine
Peptidi di prova (1-4 mg, 85% di purezza)GenscriptCustom Order
Monomeri HLA-DRB1 purificati (non biotinilati)Benaroya Research Institute*Ordine
Piastra EIA/RIA bianca a 384 pozzettiThermo460372
Polipropilene Piastra a 384 pozzettiCostar3656
Pellicola, AxySeal, 80 & micro; m, applicatore ELISA Axygen AscientificPCR-SP
MilliQ WaterN/AN/A
Epimotion Liquid Handler (o simile)Eppendorf5075
Select TS Plate Washer (o simile)BioTek405
SpectraMax Gemini Microplate Reader (o simile)Molecular DevicesN/A
*Le molecole umane ricombinanti di MHC II possono essere ottenute dal Benaroya Tetramer Core Laboratory. Vedere: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory
personalizzatopersonalizzato

Riferimenti

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  1. Steere, A. C., et al. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide. J. Exp. Med. 203, 961-971 (2006).
  2. Raddrizzani, L., et al.

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Ristampe e permessi

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Errata corrige

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Formal Correction: Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes
Posted by JoVE Editors on 3/18/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes.  There were typos in the Protocol section and Table 2.

Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

to:

Add 80 µl of 1 mM Pefa Bloc and 60 µg of octyl-β-D-glucopyranaside to 3,920 µl of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).

Step 5.2 in the Protocol was updated from:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

to:

Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 µM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.

Table 2 was updated from:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (mM)20
Vol. MHC II Stock to Add (ml)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (ml):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

to:

MHC II Allele DRB1*:1501
MHC II Stock Concentration (mg/ml)1.3
MHC II Stock Concentration (μM)20
Vol. MHC II Stock to Add (μl)14.65
Vol. Reaction Buffer to Add (μl):2885.35
MHC II Master Mix Concentration (nM)101

Tag

MHC II Binding AssayPeptide Epitope AnalysisHigh Throughput ELISASolution Phase CompetitionTime Resolved FluorometryPeptide MHC II ComplexImmunogenic Epitope IdentificationProtein DeimmunizationVaccine DesignLiquid Handling Robot

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