Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Sommario

Formazione di complessi proteici in vivo può essere visualizzato da bimolecular fluorescenza complementazione. Partner di interazione sono fusi a parti complementari tag fluorescenti e transitoriamente espressi in foglie di tabacco, risultando in un segnale fluorescente ricostituito upon vicinanza delle due proteine.

Abstract

Molte proteine ​​interagiscono transitoriamente con altre proteine ​​o sono integrati in complessi multi-proteici di svolgere la loro funzione biologica. Bimolecular complementazione fluorescenza (BiFC) è un metodo in vivo per monitorare tali interazioni nelle cellule vegetali. Nel protocollo presentato proteine ​​candidate indagati sono fusi a metà complementari di proteine ​​fluorescenti ei rispettivi costrutti vengono introdotti nelle cellule vegetali tramite trasformazione mediata da Agrobacterium. Successivamente, le proteine ​​sono espresse transitoriamente in foglie di tabacco ei segnali fluorescenti restaurati possono essere rilevati con un microscopio confocale a scansione laser nelle cellule intatte. Ciò consente non solo la visualizzazione della stessa interazione, ma anche la localizzazione subcellulare dei complessi proteici può essere determinato. A tal fine, geni marcatori contenenti un tag fluorescente possono essere coexpressed insieme ai costrutti BiFC, visualizzando così strutture cellulari come tegli reticolo endoplasmatico, mitocondri, l'apparato di Golgi o la membrana plasmatica. Il segnale fluorescente può essere monitorato direttamente nelle cellule epidermiche foglia o in protoplasti singoli, che possono essere facilmente isolato dalle foglie di tabacco trasformate. BiFC è ideale per studiare le interazioni proteina-proteina nel loro ambiente naturale all'interno della cellula vivente. Tuttavia, va considerato che l'espressione deve essere comandato da promotori forti e che i partner di interazione sono modificati per effetto fusione dei tag fluorescenza relativamente grandi, che potrebbero interferire con il meccanismo di interazione. Tuttavia, BiFC è un ottimo approccio complementare ad altri metodi comunemente applicati inquirenti interazioni proteina-proteina, come coimmunoprecipitation, vitro saggi di pull-down o esperimenti lievito-two-hybrid.

Introduzione

Studiare la formazione di complessi proteici e la loro localizzazione nelle cellule vegetali in vivo è essenziale per indagare reti cellulari, segnalazione e processi metabolici. BiFC permette la visualizzazione delle interazioni proteina-proteina nel loro ambiente naturale direttamente all'interno della cellula vegetale vivente ^1-5.

Nel BiFC avvicinarsi alla complementazione di due frammenti N-e C-terminali non fluorescente di una proteina fluorescente piombo ad una proteina fluorescente ricostituito. Frammenti di molte proteine ​​fluorescenti differenti sono stati utilizzati per rilevare le interazioni proteina, ad esempio, la proteina fluorescente verde (GFP) cromoforo delle quali è formata da tre residui chimicamente distinte ^6. Proteine ​​fluorescenti possono essere dimezzati all'interno di un ciclo o ß-strand di provocare i due frammenti non fluorescente che possono essere fuse per entrambe le proteine ​​di interesse. Il test può essere utilizzato per rilevare le interazioni in qualsiasi compartme subcellularent in qualsiasi organismo aerobicamente crescente o celle che possono essere geneticamente modificato per esprimere le proteine ​​di fusione. Se le due proteine ​​entrano in prossimità all'interno della cellula, la fluorescenza viene ricostituito e può essere monitorato mediante microscopia senza aggiunta di fluorofori esogeni o coloranti ^3.

Tabacco (Nicotiana benthamiana) ha dimostrato di essere un modello conveniente organismo per visualizzare l'interazione di proteine ​​vegetali, poiché le proteine ​​possono facilmente essere espresse utilizzando la trasformazione mediata da Agrobacterium di foglie di tabacco con i costrutti generati. Agrobatteri utilizzano un cosiddetto plasmide Ti (cancerogeni) codificanti per enzimi che mediano la trasduzione del gene di interesse in cellule vegetali. BiFC è ben applicabile per solubile così come per le proteine ​​di membrana all'interno di tutti i compartimenti cellulari ed è stato usato con successo negli ultimi anni per identificare proteine ​​interagenti in vivo e analizzare i siti di interazioneall'interno delle proteine ^​​7-9. Su espressione dei geni introdotti, l'interazione delle proteine ​​fluorescenti può essere visualizzato direttamente in foglie, che è adatto per strutture cellulari più grandi, come il reticolo endoplasmatico (ER), la membrana plasmatica o cloroplasti. Tuttavia, per monitorare la localizzazione in strutture più raffinate, per esempio, la busta cloroplasto, si consiglia di visualizzare la fluorescenza in protoplasti isolati di foglie di tabacco trasformate. Un insieme di vettori BiFC contenenti sia un C-terminale o un tag fluorescente N-terminale deve essere utilizzato per l'approccio BiFC in piante ^10. Il protocollo descritto qui di seguito è stato utilizzato per studiare l'interazione di citosolica heat shock protein 90 (HSP90) con la ripetizione tetratricopeptide (TPR) dominio contenente attracco proteine ​​Toc64 e AtTPR7 risiedono nella busta esterna cloroplasto e il reticolo endoplasmatico, rispettivamente, ^11-13. A questo scopo, HSP90 è stata fusa al Ctparte erminal di SCFP (SCFP ^C). Il tag è N-terminale fusa al chaperone per garantire l'accessibilità del C-terminale MEEVD motivo di legame di HSP90 al morsetto di tipo domini TPR. In parallelo, la parte N-terminale di Venere (Venus ^N) è stato fuso con i domini citosolici del dominio TPR contenente attracco proteine ​​Toc64 e AtTPR7, rispettivamente. Come controllo negativo abbiamo clonato la parte C-terminale solubile di SCFP ^C, solamente che risiede nel citosol ed è quindi un controllo appropriato.

I tag fluorescenti delle proteine ​​studiate devono affrontare lo stesso compartimento cellulare per consentire la vicinanza e la ricostituzione del segnale fluorescente in tal modo. Per determinare la localizzazione del segnale fluorescente ricostituito una proteina marker fusa a un tag fluorescente differente può essere cotransformed per dimostrare la localizzazione subcellulare dell'interazione. Una proteina marker ER fusa mCherrry fu trasformato simultaneamente nellacaso di ER si trova AtTPR7 ^14. L'autofluorescenza della clorofilla servito come marcatore cloroplasto in caso di Toc64. Con questo non solo l'interazione in vivo di Toc64 AtTPR7 e, rispettivamente, con la HSP90 chaperone citosolico può essere monitorato direttamente in foglie di tabacco, ma anche la localizzazione subcellulare dell'interazione può essere indagata.

BiFC è adatto come un approccio complementare ad altri metodi che studiano le interazioni proteina-proteina. Rispetto al coimmunoprecipitation o in esperimenti di pull-down in vitro, per esempio, anticorpi specifici devono essere disponibili per le proteine ​​di interesse, e le proteine ​​non devono essere espresso in modo ricombinante in vitro, che può essere difficile, specialmente per proteine ​​di membrana. Inoltre, anche le interazioni transitori possono essere monitorati utilizzando BiFC, poiché le proteine ​​sono catturate dalla interazione dei tag fluorescenti fusi ^15.

Protocollo

1. Trasformazione di BiFC Costruisce in Agrobacteria

1. Clonazione di costrutti BiFC
   1. Amplificare il gene di interesse da un modello appropriato utilizzando oligonucleotidi contenenti accompagnamento ATTB siti. Eseguire una PCR utilizzando un polimerasi correzione di bozze. Adattare la lunghezza della fase di ricottura per la combinazione di primer creazione e la lunghezza del passo allungamento secondo la dimensione del frammento. Controllare il prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio e purificarlo utilizzando una PCR Clean-up Kit.
   2. Eseguire la reazione BP con il frammento ottenuto e il vettore di entrata utilizzando ricombinasi BP. Mescolare 15-150 ng del prodotto attB-PCR con 150 ng del vettore entrata, aggiungere 2 ml di ricombinasi BP e riempire con tampone TE ad un volume totale di 8 microlitri. Incubare la reazione per 1 ora a RT e fermare la reazione con l'aggiunta di 2 ml proteinasi K per 10 min a 37 ° C.
   3. Trasformare l'intera reazione in competente E. coli DH5a; Cellule e schermare le colonie ottenute da Colony PCR per il corretto inserimento del frammento di DNA nel vettore. Sequenziamento del DNA dei plasmidi positivi viene effettuato per verificare l'assenza di mutazioni.
   4. Utilizzare il clone di entrata ottenuto per LR ricombinazione con l'appropriato vettore di destinazione usando un ricombinasi LR. Mescolare 50-150 ng di entrata vettore con 150 ng del vettore destinazione, aggiungere 1 ml LR recombinase e riempire con tampone TE ad un volume totale di 5 ml. Incubare la reazione per 1 ora a RT e fermare la reazione con l'aggiunta di 1 ml proteinasi K per 10 min a 37 ° C.
   5. Trasformare l'intera reazione in cellule competenti di E. coli DH5a e schermo colonie ottenute dalla colonia PCR per il corretto inserimento del frammento di DNA nel vettore. Sequenziamento del DNA non è necessario in questa fase.
   6. Isolare DNA plasmidico con un kit plasmide Mini a garantire un elevato grado di purezza.
2. Preparazione della chimicamente competenti Agrobacteria (ceppo AGL1, rifampicina e resistenza Carbenicillin)
   1. Streak out agrobatteri da una cultura magazzino e crescere per 24 ore a 28 ° C.
   2. Inoculare 5 ml terreno LB con una singola colonia e incubare una notte a 28 ° C.
   3. Inoculare 50 ml terreno LB con 2 ml di coltura durante la notte e crescere per circa 4 ore a 28 ° C per un OD ₆₀₀ di 1,0.
   4. Centrifugare le cellule a 3000 xg per 15 min a 4 ° C e risospendere il pellet in 1 ml sterilizzati ghiacciata CaCl ₂ (10 mM). Mantenere le cellule in ghiaccio dopo questo passaggio.
   5. Preparare aliquote (100 pl) delle celle, congelare immediatamente in azoto liquido e conservare a -80 ° C.
3. Trasformazione di chimica competente Agrobacteria
   1. Scongelare una aliquota di cellule AGL1 competenti su ghiaccio. Aggiungere 1-2 pg di DNA plasmidico da cellule. Incubare per 5 min in ghiaccio, 5 min in azoto liquido e 5 min a 37 ° C. Aggiungere 600 microlitri terreno LB alle cellule e snasello a 650 rpm per 4 ore a 28 ° C.
   2. Centrifugare le cellule per 1 min a 8000 xg e scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 50 ml di mezzo LB rimanente e piastra su piastre LB contenenti antibiotici appropriati. Sigillare le piastre e incubare per 2 giorni a 28 ° C. Colonie di evidenziare la presenza del plasmide da colonia PCR.
   3. Inoculare una colonia positiva in 5 ml di terreno LB contenente antibiotici appropriati e incubare a 28 ° C durante la notte. Miscelare 500 ml di coltura durante la notte con 500 microlitri 50% glicerolo sterilizzato e congelare a -80 ° C.
   4. Seminare le agrobatteri in terreno LB contenenti antibiotici appropriati direttamente dal glicerolo magazzino per la trasformazione transiente di foglie di tabacco.

2. Trasformazione transitoria delle foglie di tabacco

1. Agrobacteria crescita
   1. Preparare le seguenti soluzioni stock: acetosyringone (150 mm, sciogliere in 70% EtOH), deposito come aliquote a -20 ° C. MES / KOH (0,1 M) pH 5.7, conservare a 4 ° C (filtro sterile attraverso un filtro 0,2 micron per prevenire la crescita batterica durante la conservazione più a lungo), MgCl ₂ (1 M) stock, conservare a temperatura ambiente.
   2. Inoculare 10 ml di terreno LB contenente antibiotici appropriati con 50 ml di stock cultura AGL1 glicerolo contenente il plasmide di interesse in una provetta sterile da 50 ml ed incubare a 28 ° C per almeno 24 ore in agitazione a 190 rpm fino a un diametro esterno _{di 600} tra 1,0 -2.0 è raggiunto.
   3. Batteri centrifugare a 3000 xg per 15 min. Risospendere il pellet in mezzo infiltrazione fresco _[MgCl2 (10 mM), MES / KOH (10 mM) pH 5.7, acetosyringone (150 mM)] e regolare la sospensione in una OD ₆₀₀ di 1,0.
   4. Incubare le cellule Agrobacteria in un agitatore in testa per 2 ore nel buio. Le cellule possono quindi essere utilizzati per l'infiltrazione.
2. Infiltrazione di foglie di tabacco
   1. Utilizzare tresettimana vecchio tabacco (Nicotiana benthamiana) piante. Scegliere diverse foglie più vecchie per infiltrazione.
   2. Miscelare volumi uguali dei agrobatteri trasportano i costrutti di interesse (3 ml ciascuna). Prendete una siringa da 5 ml senza ago per l'infiltrazione. Infiltrarsi nella sospensione cellulare attentamente le foglie di tabacco premendo la siringa sul lato inferiore delle foglie in più punti.
   3. Annaffiare le piante e lasciarli al buio per due giorni.

3. Protoplast Preparazione

Preparazione Protoplast di foglie di tabacco è stato adattato da Koop et al. ¹⁶ e leggermente modificato.

1. Preparazione Buffer
   1. Preparare F-PCN medio: Macro-sali _[KNO3 (1012 mcg / ml), CaCl ₂ • 2H ₂ O (440 mg / ml), MgSO ₄ • 7H ₂ O (370 mg / ml), KH ₂ PO ₄ ( 170 mg / ml), NH _4-succinato [(20 mm; preparare un 2 m stock solution (succinato (236 mcg / ml) e NH ₄ Cl (106 mcg / ml), portato a pH 5,8 per sciogliere)], Micro-sali [EDTA-Fe (III) X na-sale (40 mcg / ml), KJ (0,75 mg / ml), H ₃ BO ₃ (3 mg / ml), MnSO ₄ • H ₂ O (10 mcg / ml), ZnSO ₄ • 7H ₂ O (2 mg / ml), Na ₂ MoO ₄ • 7H ₂ O (0,25 mg / ml), CuSO ₄ • 5H ₂ O (0,025 mcg / ml), CoCl ₂ • 6H ₂ O (0,025 mcg / ml)], MES (390 mcg / ml), glucosio (circa 80 ug / ml) osmolarità 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Conservare in aliquote a -20 ° C.
   2. Preparare mezzo F-PIN: Tutti gli ingredienti come F-PCN ma invece di utilizzo saccarosio glucosio (circa 110 mcg / ml), osmolarità 550 mOsm, pH 5,8 (KOH). Conservare in aliquote a -20 ° C.
   3. Preparare W5 medio: 150 mM NaCl, 125 mM CaCl _2, 5 mM KCl, 2 mM MES, osmolarità 550-580 mOsm, pH 5.7 (KOH). Conservare a 4 °, C (filtro sterile attraverso un filtro 0,2 micron per prevenire la crescita batterica durante la conservazione più a lungo).
   4. Preparare soluzione enzimatica fresca per l'isolamento di protoplasti (0,1 g cellulasi, 0,03 g macerozym in 10 ml F-PIN). Incubare la soluzione a 55 ° C per 10 minuti e raffreddare a RT. Aggiungere 100 pl di 10% BSA a 10 ml di soluzione.
2. Isolamento di protoplasti
   1. Mettere una foglia infiltrato in una capsula di Petri e aggiungere la soluzione enzimatica fresca. Utilizzare una nuova lametta per tagliare la foglia in circa 0,5 cm ² pezzi di dimensioni. Trasferire la foglia-pezzi con soluzione enzimatica in un pallone vuoto infiltrazione ed il vuoto infiltrarsi per circa 20 secondi fino a quando le bolle d'aria emergono dalle foglie (rilascio del vuoto con molta attenzione).
   2. Agitare la beuta per 90 min a 40 rpm nell'oscurità.
   3. Rilasciare protoplasti agitando per 1 min a 90 giri al minuto. Filtrare la soluzione attraverso una garza (100 micron) in 15 ml di tubo di centrifugazione (fondo tondo).
   4. Sovrapporre la soluzione protoplasto con 2 ml di tampone F-PCN e centrifugare per 10 minuti a 70 g (accelerazione e decelerazione lenta) a temperatura ambiente.
   5. Protoplasti intatte accumulano all'interfaccia di soluzione enzimatica e F-PCN. Prendete un ampio orifizio 1 punta ml pipetta per trasferire i protoplasti intatti in un tubo da centrifuga fresco e riempire con il tampone W5. Centrifugare per 2 minuti a 100 xg (accelerazione lenta e decelerazione) per far sedimentare i protoplasti.
   6. Rimuovere con cura il supernatante utilizzando una pipetta e risospendere pellet in circa 200 microlitri tampone W5, a seconda della quantità di protoplasti.
   7. Utilizzare sempre punte orifizio largo per evitare rottura di protoplasti intatti.

4. Laser Scanning Microscopy

1. Preparazione del campione
   1. Incollare due piccole strisce di sigillante intorno ad un vetrino da microscopio (2 cm l'uno dall'altro). Mettere 20 ml di soluzione di protoplasti tra le strisce e posizionare con cura un vetro di coperturasulla parte superiore. Le strisce sigillanti assicurarsi che i protoplasti non vengono schiacciate dal vetro di copertura.
   2. Per campioni totali foglia tagliare un pezzo di 1 cm dalla foglia e posizionarlo su un vetrino da microscopio con il lato inferiore del foglio rivolto verso l'alto. Aggiungere circa 30 ml H ₂ O, posizionare un vetro di copertura sulla parte superiore e fissare saldamente con nastro adesivo su entrambi i lati.
2. Impostazioni di immagini e microscopio confocale
   1. Imaging viene eseguita con un microscopio confocale a scansione laser Leica, Tipo: TCS SP5. Per ingrandimento usare una lente obiettivo (HCX PL APO CS) con una magnitudo di 63X con glicerolo come mezzo di imaging. Impostare l'apertura numerica a 1,3. Utilizzare il software Leica Application Suite / Advanced Fluorescence per la valutazione (vedi Dati supplementari S1).
   2. Impostare il laser Argon al 30% e la potenza del laser a 488 nm ad un'intensità del 18% per monitorare il segnale BiFC ricostituito a 515 nm e impostare una larghezza di banda di emissione rivelatore PMT 495-550.
   3. Per monitorare clorofilla autofluorescenza impostare un secondo di banda di emissione rivelatore PMT 650-705.
   4. Per monitorare segnale mCherry usa il laser HeNe 561, impostare l'intensità del laser 561-18% e la larghezza di banda di emissione di un terzo rivelatore PMT 587-610.
   5. Assicurarsi che le immagini di tutti i canali del rivelatore PMT sono prese con le stesse impostazioni di guadagno (guadagno deve essere compresa tra 800-900 escludere segnali di fondo).
   6. Scattare foto in larghezza format / altezza di 1024 x 1024 pixel con una velocità di scansione di 100 Hz.
   7. Per Z stackings utilizzano una distanza massima di 0,5 micron tra ogni pila.

Risultati

In questo esempio si è usato il metodo BiFC per monitorare l'interazione della HSP90 citosolico chaperone molecolare delle proteine ​​di membrana di docking AtTPR7 e Toc64. AtTPR7 fa parte del translocon Sec e interagisce con chaperone citosolico, che eventualmente offrono preproteine ​​secretori per traslocazione post-traduzionale alla membrana ER. Allo stesso modo, Toc64 la busta esterna cloroplasto agisce in import post-traslazionale ricevendo HSP90 preproteine ​​cloroplasti associati. Entrambe le proteine ​​comprend...

Discussione

Dopo la pianificazione di un esperimento BiFC devono essere considerati diversi punti. Nonostante non sia richiesta informazioni strutturali sulle proteine ​​di interesse, la topologia deve essere conosciuto quando si lavora con proteine ​​di membrana spanning. Le proteine ​​fluorescenti devono risiedere nello stesso compartimento subcellulare o affrontare lo stesso lato di una membrana per consentire l'interazione. Naturalmente, quando si analizzano le proteine ​​che richiedono una sequenza di targeting N-terminale...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3',5'-Dimetossi-4'-idrossiacetofenone	Sigma-Aldrich	D134406	Acetosyringone
Cellulasi, Onozuka-R10	Serva	16419	da Trichoderma viridae
Macerozyme R-10	Serva	28302	da Rhizopus sp.
GATEWAY, BP Clonasi II, Kit enzimatico	Invitrogen	11789-(020)
GATEWAY, LR Clonasi II, Kit enzimatico	Invitrogen	11791-(020)
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
NucleoSpin Gel e PCR Clean-up Kit	Macherey-Nagel	740609-250
pDEST-GWVYNE	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-VYNE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning
pDEST-SCYCE(R)GW	Invitrogen		Gateway-cloning