Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

Lo stress ossidativo è specificamente definita come una condizione che deriva da uno stato redox cellulare sbilanciato. Le reazioni redox complesse che si verificano normalmente all'interno delle cellule determinano il redox-stato cellulare. Reazioni redox comprendono tutte le reazioni chimiche che consistono nel trasferimento di elettroni tra atomi di molecole biologiche che producono riduzione e ossidazione di molecole (ad esempio reazioni redox). Queste reazioni sono catalizzate da specie attivata elettronicamente (cioè le specie pro-ossidanti), caratterizzati da una instabilità strutturale estremo e l'attivazione spontanea di elettroni sbilanciati che scambiano con biomolecole limitrofi. Queste reazioni irregolari risultano in danni al DNA, proteine ​​carbossilazione, e l'ossidazione dei lipidi, e alla fine portano alla morte delle cellule ^1. Aumento dei livelli di stress ossidativo sono stati associati con l'invecchiamento e la progressione di diversi stati patologici ^2. Lo stress ossidativo èstato segnalato per essere responsabile di alterazioni vascolari nel diabete e le malattie cardiovascolari ^3,4. Esso svolge anche un ruolo fondamentale nella degenerazione neuronale nella malattia di Alzheimer e il morbo di Parkinson ^5. Inoltre, lo stress ossidativo è stato dimostrato come un fattore critico nel governo progressione del cancro ed eventi metastatici ^6,7. Inoltre, le risposte infiammatorie e immunitarie possono suscitare e sostenere ulteriormente lo stress ossidativo ^8.

In cellule viventi, specie pro-ossidative sono derivati ​​da ossigeno (ROS, specie reattive dell'ossigeno) o di azoto (RNS; specie reattive). ROS includono il radicale idrossile, l'anione superossido ^(OH.) (O ₂ ^-), e il perossido di idrogeno (H ₂ O _2). Il primario RNS è l'ossido di azoto ^(NO).. Una serie di specie reattive secondarie può essere generato da interazioni spontanee between ROS e RNS o metalli liberi ioni ^9. Ad esempio, l'anione superossido reagisce con l'ossido di azoto per formare peroxynitrate (ONOO ^-), mentre H ₂ O ₂ reagisce con Fe ^{2 +} genera radicali idrossilici. ROS e RNS, grazie alla loro capacità di reagire con diverse biomolecole, sono considerati una minaccia pericolosa per il mantenimento dello stato fisiologico redox ^10. Per mantenere le cellule stato redox sono dotati di una serie di disintossicante molecole antiossidanti ed enzimi. La superossido dismutasi (SOD), catalasi, glutatione perossidasi e Peroxiredoxins costituiscono essenzialmente l'antiossidante enzimatico-arsenale che fornisce protezione cellulare da specie pro-ossidanti compreso H ₂ O _2, OH e Oono ^{-. 11.} Anche molecole anti-ossidanti come la vitamina C ed E, polifenoli e CoenzymeQ10 (CoQ10) sono di importanza critica per placare ROS e la loro de pericolosarivati ^​​12,13. Tuttavia, una eccessiva produzione di ROS e RNS, o una disfunzione del sistema antiossidante, sposta la redox-stato cellulare verso lo stress ossidativo ^14.

Oltre alla loro connotazione negativa, ROS può svolgere vari ruoli fisiologici in cellule di diversa origine. Cellule normalmente producono ROS come molecole di segnalazione per mediare eventi biologici normali, come la difesa ospite e ferita riparazione ^15-17. Specie reattive sono normalmente prodotti in cellule da enzimi intracellulari come NOx (NADPH) e XO (xantina ossidasi) in risposta a fattori di segnalazione, fattori di crescita e le fluttuazioni dei livelli di calcio intracellulare ^18,19. E 'stato riportato che i ROS differenzialmente può modulare l'attività di importanti fattori nucleari come p53 o componenti cellulari come l'ATM-chinasi, il principale regolatore della risposta al danno del DNA ^20. Analogamente ROS influenzano fortemente segnalazione cellulare mediando the ossidazione e inattivazione di proteina tirosina fosfatasi (PTP), che sono stabiliti come regolatori critici di trasduzione del segnale ^21. Inoltre, le metodologie di proteomica basata dimostrano che RNS sono anche responsabili di specifiche modificazioni delle proteine ​​e alterazioni della segnalazione molecolare. RNS reagiscono con i gruppi tiolo cisteina li modificano in S-nitrothiols (SNO) e innescando meccanismi molecolari concomitanti con stati patologici come le malattie infiammatorie e autoimmuni ^22,23.

Da esperimenti di coltura cellulare solo parzialmente riproducono la moltitudine di fattori che agiscono in vivo, è di grande interesse per eseguire studi redox in modelli animali ^24,25. Per ottenere ciò, il zebrafish è stato considerato un modello animale vertebrato adatto per studiare la dinamica di stress ossidativo ^26. Lo zebrafish è un nuovo modello di sistema che concede numerosi vantaggi di studiare eventi cellulari e genetici durante vertebrato development e la malattia. Grandi cluster di embrioni possono essere generate e disponibili settimanale per esigenze sperimentali. Inoltre, la straordinaria chiarezza ottica di embrioni di zebrafish, nonché le loro piccole dimensioni, permette l'imaging singola cellula e l'inseguimento dinamico in un insieme di organismi ^27. Nell'ultimo decennio, un numero considerevole di zebrafish mutanti sono stati generati per modellare condizioni patologiche umane come il cancro e malattie genetiche ^28-31. Ancora più importante, una moltitudine di linee transgeniche è stata prodotta per consentire ampie possibilità di manipolazioni genetiche e biologiche ^32. Ad esempio, le linee transgeniche zebrafish tessuto-specifici sono regolarmente utilizzati per studi in vivo. Queste linee esprimono una proteina fluorescente sotto il controllo di un promotore selezionato, offrendo la possibilità di identificare le singole cellule in vivo, così come la struttura anatomica di comprendere.

Diversi studi tossicologici hanno già utilizzato tegli Zebrafish per valutare l'effetto in vivo delle sostanze chimiche sulla omeostasi redox, suggerendo l'idoneità di questo vertebrato come modello animale per il campo della scoperta di nuovi farmaci e stress ossidativo ^33-35. Anche se alcuni sonde fluorescenti sono stati testati per monitorare lo stress ossidativo in larve di zebrafish ^36,37, non ci sono test stabiliti per rilevare e misurare i livelli di stress ossidativo nei tessuti zebrafish e cellule viventi. Qui si descrive un procedimento per la quantificazione in vivo di stress ossidativo in cellule di embrioni di zebrafish vivente. Strumenti di imaging, FACS ordinamento, sonde fluorescenti e le condizioni pro-ossidative sono tutti combinati per generare un semplice test per l'individuazione e la quantificazione delle specie ossidanti in embrioni e tessuti di zebrafish.

1. Preparazione di strumenti e soluzioni di lavoro

1. Preparare la soluzione di acqua pesce. Ottenere una soluzione stock sciogliendo 2 g di 'Ocean istantanea' sali marini in 50 ml di acqua distillata. Aggiungere 1,5 ml di brodo di pesce di acqua a 1 L di acqua distillata per preparare pronto a utilizzare l'acqua del pesce (/ sali marini ml 60 mcg concentrazione finale). Autoclave pronto all'uso pesci d'acqua prima dell'uso. Questa soluzione viene utilizzata come mezzo zebrafish.
2. Preparare metilcellulosa per il montaggio degli embrioni. Sciogliere 1.5 g di metilcellulosa in 50 ml di acqua sterile pesce. Facilitare la dissoluzione utilizzando un magnete su una piastra di agitazione. La completa dissoluzione della polvere può richiedere diverse ore. Controllare la soluzione per chiarezza e aliquote in piccoli tubi. Conservare a -20 ° C per mesi e scongelare le aliquote a uso. Centrifugare la metilcellulosa a 950 xg per 5 minuti prima di utilizzare. Evitare cicli di congelamento-scongelamento di aliquote.
3. Preparare 50 ml di tricaine / etil 3-amminobenzoato msale ethanesulphonate (soluzione) sciogliendo 200 mg di tricaine in 100 ml di acqua e aggiustare il pH a 7,0 con Tris-HCl 1 M (pH 9). Conservare questo stock a 4 ° C per non più di 30 giorni. ATTENZIONE: tricaine è tossico. Utilizzare secondo le appropriate linee guida di trattamento.
4. Indurre stress ossidativo in embrioni di zebrafish
   1. Preparare una soluzione ossidante per l'induzione dello stress ossidativo generico: Marca 50 ml di soluzione ossidante con l'aggiunta di H ₂ O Soluzione ₂ stock (perossido di idrogeno; 100 mm) per l'acqua il pesce. Usare H ₂ O ₂ di una concentrazione finale tra 2 mM e 100 mM. Preparare questa soluzione poco prima dell'uso. La soluzione ossidante può essere applicato sia a montare tutto ROS rilevamento e monocellulari ROS metodi di rilevamento. Non conservare questa soluzione. ATTENZIONE: H ₂ O ₂ è pericoloso e nocivo per inalazione e ingestione. Il contatto con materiale combustibile può provocare un incendio. Maneggiare sotto cappa aspirante e usura pers appropriatedispositivi di protezione onal.
   2. Preparare una soluzione ossidante per l'induzione dello stress ossidativo dei mitocondri-derivati: ottenere una soluzione stock ossidante (5 mm), sciogliendo 3,9 mg di rotenone in 2 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Conservare questa soluzione a temperatura ambiente al buio.
      1. Sciogliere soluzione stock rotenone a 10 ml di acqua i pesci per fare una soluzione pronta all'uso. Utilizzare rotenone ad una concentrazione compresa tra 5-50 micron. Non utilizzare rotenone a concentrazioni superiori a 100 micron. A concentrazioni appropriate, questa soluzione ossidante può essere applicato sia a montare tutto ROS rilevamento e monocellulari ROS metodi di rilevamento. ATTENZIONE: Rotenone è tossico e pericoloso. Manipolare secondo adeguate prudenza.
   3. Indurre stress ossidativo gene knock-down: knock-down dell'espressione genica nrf2a in embrioni di zebrafish da morpholino microiniezione come precedentemente riportato da Timme-Laragy A. et al, 2012 ^38..
   4. Indurre oxidative stress dopo il danno tissutale: generare un margine ferita alla pinna caudale di embrioni di zebrafish a 72 HPF come precedentemente descritto da 2009 ³⁹ Niethammer et al..
5. Preparare 5 ml di soluzione ROS-rilevazione per singola cella metodo di ROS-rilevamento:
   1. Soluzione per il rilevamento ROS generale: sciogliere la sonda molecolare ROS-sensitive generico in HBSS (soluzione salina bilanciata di Hanks), al fine di preparare una soluzione di lavoro (range di concentrazione: 2,5-10 micron). Questa soluzione deve essere preparata poco prima dell'uso.
   2. Soluzione per il rilevamento specifico ROS indotta dai mitocondri: Poco prima dell'uso, sciogliere un mitocondriale sonda ROS-sensibile con DMSO fare un soluzione stock 5 mm. Sciogliere soluzione di riserva in HBSS per preparare una soluzione di lavoro (range di concentrazione: 2,5-10 micron).
      NOTA: Evitare la luce e l'ossigeno l'esposizione di soluzioni di lavoro ROS di rilevamento e le rispettive soluzioni stock. Proteggere il tubo dalla luce utilizzandoun foglio di alluminio. Non conservare o di riutilizzo sonde disciolti in HBSS. Conservare le soluzioni madre a -20 ° C per un mese.
      ATTENZIONE: Maneggiare le sonde molecolari e DMSO sotto una cappa aspirante in accordo con le linee guida appropriate.
6. Preparare 5 ml di soluzione ROS di rilevamento per l'intero metodo di montaggio ROS-rilevamento: Sciogliere la soluzione generica sonda magazzino ROS-sensitive (stabilizzato in DMSO) in HBSS per preparare una soluzione di lavoro (range di concentrazione: 2.5-5 micron). Evitare la luce e l'esposizione all'ossigeno. Proteggere il tubo dalla luce. Preparare questa soluzione prima dell'uso. Non conservare o ri-utilizzare questa soluzione. ATTENZIONE: Maneggiare sonde molecolari sotto una cappa aspirante in accordo con le linee guida appropriate.
7. Fai 25 ml di Soluzione di arresto con l'aggiunta di 10 ml di siero fetale bovino a 15 ml di PBS 1x. Mantenere soluzione sterile. Conservare questa soluzione a 4 ° C. Questa soluzione è necessaria solo per la singola cella - metodo di rilevazione ROS.
8. Impostare l'incubatore d'aria zebrafish a 28 &# 176; C.
9. Impostare la centrifuga a 4 ° C per il metodo di rilevamento ROS singola cella.

2. L'accoppiamento di pesci adulti e selezione di embrioni di zebrafish

1. Set-up adulto coppia zebrafish attraversa secondo protocolli standard ^40. Selezionare la linea transgenica appropriato in conformità con le specifiche esigenze sperimentali.
2. Raccogliere le uova e metterli in un piatto di 90 mm con terreno di pesci d'acqua / embrione. Conservare le uova a 28 ° C fino embrioni svilupparsi e crescere allo stadio desiderato di sviluppo (ad esempio, 48 HPF, 72 hpf; hpf: ore dopo la fecondazione).
3. Schermo per lo sviluppo di embrioni. Escludere tutte le uova non fecondate o embrioni sottosviluppati.
4. Anestetizzare gli embrioni con l'aggiunta di 1 ml di tricaine (soluzione) in 50 ml di acqua i pesci.
5. Selezionare embrioni fluorescenti Tg sotto uno stereomicroscopio.

3. Trattamento di embrioni con ossidante agente

1. Utilizzare almeno 30 embrioni tra 48 hpf e 72 HPF per ogni condizione diversa. Lavare embrioni due volte con acqua pesce fresco per rimuovere tricaine.
2. Suddiviso embrioni fluorescenti in tre piatti. Mettere non più di 30 embrioni / piatto.
3. Rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 10 ml della soluzione ossidante o 10 ml di acqua pesce come soluzione di controllo.
4. Incubare gli embrioni per 10 minuti a 1 ora a 28 ° C. Il periodo di incubazione dipende dal livello di stress ossidativo essere indotta in tessuti specifici. Brevi periodi sono i migliori come le cellule colpite da stress ossidativo progressivamente subiscono la morte delle cellule.
5. Trasferimento degli embrioni in un nuovo piatto contenente HBSS ed embrioni di lavaggio agitando. Pre-HBSS caldo a 28 ° C.

4. Intero monte ROS Metodo di rilevazione

1. Raccogliere embrioni dopo il trattamento ossidante e mettere non più di 10 embrioni in un piccolo tubo. Risciacquare con HBSS il più possibile. Proteggere il tubo da luce utilizzando un foglio di alluminio.
2. Aggiungere 1 ml di soluzione di ROS rilevamento perogni provetta.
3. Incubare embrioni al buio per 15 minuti a 28 ° C per evitare l'esposizione alla luce.
4. Durante il tempo di incubazione preparare un vetrino per tutta l'analisi embrione. Mettete 300 ml di metilcellulosa su una "depressione" vetrino e stenderlo sulla superficie del vetro con un puntale. Evitare le bolle mentre si rilascia il metilcellulosa.
5. Al termine del periodo di incubazione, rimuovere immediatamente la soluzione ROS rilevamento e lavare due volte con 2 ml di HBSS. Lavare gli embrioni capovolgendo la provetta diverse volte. Non pipetta o vortice.
6. Aspirare embrioni superiore in una pipetta Pasteur di vetro. Posizione embrioni vicino all'apertura della pipetta e delicatamente espellere nel metilcellulosa. Orientare gli embrioni adeguatamente con un filo di nylon fine.
7. Confrontare la fluorescenza di embrioni di controllo con embrioni trattati. In alternativa, fissare parametri del stereomicroscopio a fluorescenza o un microscopio confocale in modo che tutti gli embrioni vengono esposte utilizzando lo stessoImpostazioni di imaging.

5. Single Cell Method ROS rilevamento

1. Inizia dal punto: 3.5. Assicurarsi di avere almeno 35 embrioni per ogni condizione.
2. Trasferire gli embrioni in un nuovo piatto. Rimuovere l'acqua i pesci, per quanto possibile. Aggiungere 10 ml di ghiacciata PBS 1x e 400 ml di inibitori della proteasi Cocktail. Dechorionate manuale embrioni con una pinza e rimuovere il sacco vitellino con un ago sottile. Nota: la rimozione sacco vitellino assicura campioni puliti per la successiva analisi FACS. Questo passaggio può essere evitato secondo strumento FACS.
3. Trasferimento de-yolked embrioni in una piastra a 24 pozzetti multiwell (15 embrioni / pozzetto) e rimuovere tutti i pesci d'acqua.
4. Aggiungere 300 ml di HBSS, 30 microlitri collagenasi P, 50 microlitri tripsina-EDTA in ciascun pozzetto.
5. Omogeneizzare embrioni pipettando gentilmente su e giù con un puntale stretto (1.000 ml).
6. Incubare a 28 ° C per 20 min e omogeneizzare campioni pipettando ogni 5 min.
7. Controllare DISR tessutouption osservando un'aliquota di omogenato al microscopio composto. Facilitare sospensione singola cella pipettando. Non incubare gli embrioni per più di 30 min.
8. Arrestare la reazione aggiungendo 200 ml di soluzione di arresto. Mescolare pipettando delicatamente.
9. Trasferire sospensione di cellule in una provetta pre-raffreddata con fondo stretto. Tenere la provetta in ghiaccio ed evitare l'esposizione alla luce.
10. Centrifugare per 5 minuti a 250 xga 4 ° C.
11. Rimuovere la fase superiore e risospendere le cellule con ghiaccio freddo HBSS pipettando delicatamente.
12. Contare le celle e assicurarsi di avere lo stesso numero di cellule in tutti i campioni. Non utilizzare meno di 2 x 10 ⁶ cellule.
13. Celle di centrifugazione per 5 minuti a 250 xg a 4 ° C.
14. Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet con 1 ml di ghiaccio raffreddato HBSS contenente la sonda ROS-sensitive.
15. Incubare la provetta a temperatura ambiente per 3 minuti al buio. Tempo di incubazione variare a seconda del livello di stress ossidativo e di tegli sensibilità della sonda.
16. Trasferire le cellule in una provetta FACS. Tenere le provette su ghiaccio ed evitare l'esposizione alla luce prima analisi FACS.
17. Ordinare le celle con un cell sorter fluorescenza-attivato (FACS). Lunghezze d'onda impostato conformemente fluorescenza Tg tessuto (ad esempio, GFP) e gli spettri di eccitazione / emissione della sonda molecolare utilizzato per il rilevamento ROS (ad esempio, sonde specifiche mitocondriali ROS-sensibili, generici sonde sensibili ROS).
18. Per ogni condizione, misurare tutti i campioni all'interno della stessa sessione sperimentale, applicando le stesse impostazioni FACS. Calcolare la percentuale di cellule fluorescenti come media di diverse repliche biologiche. Analizzare almeno due repliche per ogni condizione.

Applicando il metodo descritto qui, possiamo facilmente misurare e rilevare lo stress ossidativo (e livelli di ROS) nei tessuti embrionali di zebrafish. Dopo aver attraversato zebrafish adulto, uova vengono raccolte e permesso di sviluppare a 28 ° C per 72 ore dopo la fecondazione (HPF). Al fine di indurre stress ossidativo, proponiamo due diversi approcci: 1) Il trattamento degli embrioni con forti reagenti pro-ossidanti o 2) promuovere la formazione di ROS dopo la lesione del tessuto.

Nel primo approccio, abbiamo impiegato due reagenti diversi a seconda delle esigenze specifiche: perossido di idrogeno (H 2 O 2), come il nucleo cellulare agente formatura ROS, e rotenone, come il driver specifico ROS mitocondriale. Rotenone è un inibitore del complesso I della ETC, che deregolamentazione sono causativo di stress ossidativo 41.

Nel secondo approccio, abbiamo indotto accumulo di ROS creando una ferita alla pinna caudale di un embrione zebrafish39. Alternativa, condizioni di stress ossidativo possono essere promosse nei tessuti zebrafish abbattendo con l'iniezione morpholino la Nrf2 via di risposta antiossidante che è la difesa cellulare primaria contro gli effetti citotossici di stress ossidativo 38.

Una volta che lo stress ossidativo è indotta in embrioni di zebrafish, l'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) può essere misurata utilizzando sonde specifiche ROS sensibili generici o mitocondriali, che diventano fluorescenti su attivazione (cioè ossidazione).

Embrioni trattati possono essere analizzati utilizzando l'intero metodo di montaggio ROS-rilevamento o applicando il metodo di rilevazione singola cellula-ROS come riassunto nella Figura 1. La selezione tra metodi si basa sulla necessità di effettuare la misurazione qualitativa o quantitativa di stress ossidativo. Risultati rappresentativi di entrambi i metodi sono rappresentati in Figura 2 Figura 3.

Tutta Monte Metodo ROS rilevamento

La Figura 2 mostra l'applicazione del metodo di montaggio dell'intero ROS-rilevazione per imaging in vivo dello stress ossidativo. In particolare, questo metodo è stato applicato a seguire sia "forte" stress ossidativo generato dai trattamenti pro-ossidanti esogene e "basso" stress ossidativo generato da condizioni più fisiologiche quali lesioni ferita o delezione di un gene.

Livelli fisiologici di specie ossidative sono indotte da generare un micro lesioni o un'ampia ferita alla pinna caudale di un embrione zebrafish vivo a 72 HPF. È stato dimostrato che dopo la lesione, H 2 O 2 si accumula la ferita margine 20 min dopo la ferita 39. Per visualizzare l'accumulo di stress ossidativo al margine della ferita, gli embrioni sono stati incubati con un genericoSonda ROS-sensibile e ripreso a 20 minuti dopo il ferimento di 39. Confrontando alette di coda intatte con code feriti, è possibile distinguere un accumulo della sonda fluorescente al margine della ferita (Figura 2A). Non specifici segnale di fluorescenza debole viene rilevato in tutto il tessuto pinna caudale in entrambe le condizioni.

Per convalidare l'accumulo specifico della sonda ROS sensibile al margine della ferita, l'H 2 O 2 livelli presso la ferita è stata abbassata di un approccio farmacologico. Poiché è stato dimostrato che il margine di ferita H 2 O 2 accumulo è estremamente sensibile al DUOX-inibitore VAS2870 39, gli embrioni sono stati pre-trattati con questo inibitore prima ferimento. Confronto della fluorescenza della sonda ROS-sensibili, da VAS embrioni pre-trattate ei rispettivi controlli, indica che il segnale è dipendente ROS accumulo (ad esempio H 2 O 2) (Figura 2B).

Inoltre, abbiamo generato alti livelli di specie ossidanti nei tessuti zebrafish trattando embrioni di zebrafish con rotenone. Embrioni e controlli rotenone trattati sono stati incubati con un generico sonda ROS-sensibile per rilevare specificamente specie ROS. Successivamente, la sonda è stato lavato fuori e gli embrioni sono stati ripresi sotto un microscopio a fluorescenza stereo. Lo stress ossidativo è stato rilevato in tutto il corpo degli embrioni (Figura 2C). Immagini ad alto ingrandimento mostrano regioni anatomiche in cui la sonda viene metabolizzato con successo (Figura 2D). Immagini campo luminoso (pannelli superiori) distinguono strutture anatomiche, mentre le immagini di fluorescenza (pannelli inferiori) indicano le cellule ROS-positivi. Come mostrato dalle immagini fluorescenti i risultati sono principalmente una relazione qualitativa di rilevazione stress ossidativo, che si ottiene confrontando controllo con embrioni trattati.

Single Cell-ROS Metodo di rilevazione

Figura 3 rapporti FACS rappresentativi trame e quantificazione dello stress ossidativo mediante l'applicazione del metodo di rilevazione ROS singola cella. Questo metodo è stato adattato per misurare i livelli di stress ossidativo nelle cellule zebrafish che sono stati sottoposti a condizioni pro-ossidanti come riportato nel protocollo e dettagliate didascalie delle figure. Come descritto, lo stress ossidativo è stata misurata incubando tessuti zebrafish dissociate in singole cellule con una sonda molecolare ROS-sensibili. Poiché la procedura di dissociazione e la FACS si possono causare danni alle cellule, l'analisi di campioni richiede che solo "cellule vive" sono considerati per la quantificazione stress ossidativo. Di conseguenza, le cellule dissociate vengono analizzati selezionando la frazione di cellule che mostrano parametri fisici "cellule vive" (Figura 3a) ed escludendo le cellule morte (Figura 3B). Così, i campioni vengono quantizzati perlivelli di stress ossidativo secondo la fluorescenza della sonda ROS sensibile e per mostrare una fluorescenza endogena come la positività per la GFP (Figura 3C). Un campione di controllo negativo per la sonda ROS sensibile dovrebbe essere inclusa per valutare lo stress ossidativo indotto da manipolazione e procedure tecniche (Figura 3C; pannello: controllo -). Relativa FACS trama quantificazione dimostrato in istogrammi che mostrano le misure di diverse repliche biologiche (Figura 3D-E).

Oltre livello di stress ossidativo quantificazione su trattamenti perossido di idrogeno, questo metodo è stato applicato per quantificare i livelli di stress ossidativo condizioni fisiologiche tali noi in morphants nrf2a e rispettivi controlli (Figura 3F).

Inoltre, combinando il metodo di rilevazione ROS-cella singola con specifiche sonde ROS-sensibili come noi mitocondriale ROSonde S-sensibile, è anche possibile misurare lo stress ossidativo nel contesto di specifici trattamenti pro-ossidanti mitocondri targeting (figura 3G).

Figura 1. Figura schematica del metodo per misurare i livelli di ROS in embrioni di zebrafish. Adulti Zebrafish sono incrociate nelle apposite vasche di allevamento. Uova fecondate sono poi raccolti in piatti e conservati a 28 ° C per consentire embrione di sviluppare pienamente. Induzione di stress ossidativo può essere realizzato in diversi modi, sia per trattamenti farmaceutici o da insulti genetiche o fisiche. In alternativa, in caso di un mutante genetico viene analizzata, è possibile saltare questa incubazione e andare avanti. A questo punto, è possibile procedere secondo due metodi differenti. Secondo il "intero mount metodo ROS-detection "(a sinistra), zebrafish embrioni vengono immediatamente incubato con una sonda fluorescente ROS sensibile (1) e poi analizzati con fluorescenza o microscopio confocale (2). Nel "singola cellula ROS rilevamento" metodo (a destra), embrioni di zebrafish sono dissociate in singole cellule (1), incubate con una sonda ROS sensibile fluorescente (2) e analizzate mediante FACS per rivelazione di fluorescenza e quantificazione (3). Mentre il metodo "tutto il monte-ROS rilevamento" permette la rilevazione dello stress ossidativo in embrioni viventi principalmente come un test qualitativo, il metodo contributi "basati su singola cellula", sia qualitative e misurazioni quantitative dei livelli di stress ossidativo.

Figura 2. Risultati rappresentativi di tutto il metodo di montaggio ROS-rilevamento. A) embrioni di zebrafish a 72 HPF sono stati sottopostia ferire come precedentemente descritto da Niethammer et al., 2009 39. immagini confocali rappresentative mostrano specie pro-ossidanti (ROS) di accumulo (freccia) al margine della ferita della pinna caudale feriti. Specie ossidative sono stati rilevati con la sonda ROS generico (CellROX; 2,5 micron) 20 min dopo la ferita è stato fatto. Barra della scala 20 micron. B) immagini confocali rappresentative che mostrano margini della ferita di embrioni di zebrafish a 72 HPF. Gli embrioni sono stati pretrattati con VAS2870 (20 mM) o DMSO per 90 min prima di aver effettuato la ferita. ROS è stata rilevata con una sonda generica ROS-sensitive (CellROX; 2,5 micron) 20 min dopo la ferita. Barra della scala 20 micron. C) l'immagine del corpo intero che mostra rotenone stress ossidativo indotto in embrioni di zebrafish. Lo stress ossidativo è fortemente rilevato nella regione caudale degli embrioni come mostrato nel pannello D). Rotenone è un potente inibitore di ETC mitocondriale che colpisce principalmente skelcellule muscolari Etal in zebrafish. Barra della scala, 180 micron.

Figura 3. Risultati rappresentativi delle singole cellule ROS metodo di rilevamento. A) rappresentativa FACS diagramma che mostra un esempio tipico di embrioni di zebrafish dissociata a cellule singole. Cellule vive sono gated nella regione R1 accordo con i parametri FSC-H e SSC-H. SSC-H: 539 (Voltage), 1.0 (AmpGain), Mode: lineare; FSC-H:. E00 (Voltage), 2.1 (AmpGain) B) Rappresentante FACS grafico mostra un tipico esempio di embrioni di zebrafish dissociato da singole cellule. Prima dell'analisi FACS, il campione è stato incubato con ioduro di propidio (PI; 1 mg / ml) per 5 min. Le cellule morte sono gated sulla regione R2 accordo con PI fluorescenza (FL2-H del canale). FSC-H: E00 (Voltage), 2.1 (AmpGain), Mode: lineare, SSC-H: 539 (Voltage), 1.0 (AmpGain), Mode: livicino. Canali di tensione: FL-2:. 613 Log C) FACS Rappresentante trame mostrano dissociate embrioni di zebrafish sottoposti a trattamento pro-ossidante (H 2 O 2) e rispettivi controlli. Le cellule endoteliali sono visualizzate per canale GFP. Trame FACS rappresentano tutte le cellule colpite da stress ossidativo (ROS) su UL e UR. Cellule negative vengono tracciati su quadranti inferiori e LR (LL). Tg (Kdrl: GFP) s843 zebrafish a 48hpf state incubate con H 2 O 2 (2 mM) o H 2 O come controllo per 10 min. Prima dell'analisi FACS, gli embrioni vengono elaborati come descritto nel protocollo. Cellule colpite da stress ossidativo vengono rilevati utilizzando una sonda generica ROS sensibile fluorescente (CellROX; 2,5 mM). Un campione non incubate con la sonda ROS-sensitive è stata inclusa come controllo negativo. Confrontando il campione sottoposto a trattamento pro-ossidante con il comando corrispondente, il numero di cellule tracciata quadranti superiori (UL + UR) è più alto. Acquis FACSimpostazioni ition sono stati i seguenti: i canali di tensione: FL-1: 582 Log; FL-4:. 410 Log D) Istogramma che mostra la percentuale di cellule (UL + UR) affetti da stress ossidativo in H 2 O 2 embrioni trattati e rispettivo controllo. Le misure sono relative a campioni indicati in C. Cellule colpite da stress ossidativo vengono rilevati utilizzando una sonda generica ROS sensibile fluorescente (CellROX; 2,5 mM). I risultati sono la media di n = 2 diverse repliche biologiche ± SD. E) istogramma che mostra la percentuale di cellule endoteliali (GFP +) caratterizzate da stress ossidativo (ROS +) in H 2 O 2 embrioni trattati e rispettivo controllo. Le misure sono relative a campioni indicati in C. I risultati sono la media di n = 2 diverse repliche biologiche ± SD. F) istogramma che mostra la percentuale di cellule colpite da stress ossidativo (ROS +) in morphants nrf2a (nrf2a MO) e rispettivi controlli(Ctrl MO) a 24 HPF. I risultati sono la media di n = 2 diverse repliche biologiche ± SD G) istogramma che mostra la percentuale di cellule colpite da stress ossidativo mitocondriale negli embrioni trattati (rotenone;. 10 micron) e rispettivi controlli (Ctrl; DMSO) a 72 HPF. Dopo dissociazione di embrioni in cellule singole, mitocondriale stress ossidativo (ROS mitocondriale +) è stata misurata con una sonda specifica mitocondriale (MitoSOX; 5 pM). I risultati sono la media di n = 3 diverse repliche biologiche ± SD.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.