Dettagli del protocollo sono previste per l'etichettatura di cellule staminali embrionali umane in vitro con la seconda nanoparticelle generano armoniche. Metodologie di indagine hESC mediante microscopia multi-fotone e la loro differenziazione in gruppi cardiache sono anche presentati.
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Articolo metodologico
Harmonic Nanoparticelle for Regenerative ricerca
In questo articolo
Sommario
Abstract
In questo esperimento visualizzato, dettagli del protocollo sono previste per l'etichettatura in vitro di cellule staminali embrionali umane (hESC) con nanoparticelle di generazione di armoniche secondo (HNPS). Questi ultimi sono una nuova famiglia di sonde recentemente introdotte per l'etichettatura di campioni biologici per l'imaging multi-fotone. HNPS sono in grado di raddoppiare la frequenza della luce di eccitazione dal processo ottica non lineare di generazione di seconda armonica senza alcuna restrizione sulla lunghezza d'onda di eccitazione.
Multi-fotone metodologie per la differenziazione hESC nei cluster cardiaci (mantenuti culture aria-liquido lungo termine) basato sono presentati in dettaglio. In particolare, viene mostrata la prova su come massimizzare l'intenso seconda armonica (SH) emissione di HNPS isolati durante il monitoraggio 3D di battere tessuto cardiaco in 3D. L'analisi delle immagini risultanti per recuperare modelli 3D displacement è anche dettagliata.
Introduzione
Sistemi di microscopia non lineari, grazie alle loro intrinseche capacità di sezionamento tre dimensioni, hanno sempre innescato la richiesta di fluorofori foto-stabile con bande di assorbimento a due fotoni nel vicino infrarosso. Solo negli ultimi due anni, per completare lo sviluppo di etichette a base di fluorescenza (coloranti, quantum dots, la conversione di nanoparticelle), una metodologia di imaging diverso ha sfruttato l'uso di una nuova famiglia di nanoparticelle intrinsecamente non lineari come etichette, cioè nanoparticelle armonica (HNPS) che sono stati specificamente sviluppati per microscopia multi-fotone. Queste etichette, basati su crista....
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Protocollo
1. Cultura e Espansione del CES umano
- Preparare il mezzo di propagazione delle cellule (chiamata PM) contenente Knockout DMEM integrato con il 20% Knockout siero, 1% MEM non-aminoacidi essenziali, 1% di L-glutammina 200 mm, 1% penicillina-streptomicina e 3,5 microlitri β-mercaptoetanolo.
- Scongelare ESC umane (hESC) in 8 ml di PM medio e centrifugare le 5 min a 115 xg per scartare DMSO-integrato medio di congelamento.
- Aggiungere 1 ml di PM mezzo contenente 10 mM roccia inibitore per impedire l'apoptosi e migliorare la sopravvivenza cellulare dopo lo scongelamento (solo 24 ore di incubazione).
- Aggiungere fattore di crescita ....
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Risultati
Prima di valutare l'attività di battitura da confocale, è stata eseguita una accurata caratterizzazione della risposta ottica non lineare dei filtri in PTFE, da soli o in presenza di HNPS ad alta concentrazione (1 mg / ml). Si è assicurato che: i) il substrato nudo due fotoni di fluorescenza eccitata è molto debole e non può impedire misurazione relativi campioni biologici, e ii) l'emissione SH da HNPS isolato può essere facilmente acquisita da immagini attraverso il substrato in modo epi-rilevamento (Fi.......
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Discussione
L'applicazione delle nanotecnologie alla ricerca sulle cellule staminali è un settore relativamente nuovo, ma in rapida espansione. Come sottolineato da vari articoli di rassegna sull'argomento, l'uso di nanoparticelle può essere applicato per realizzare diversi compiti di ricerca, che vanno dalla cella di inseguimento (sia in vitro che in vivo), alla consegna intracellulare di proteine e geni, non ultimo la creazione di ambienti cellulari biomimetici per preferenziale stimolazione / inibizione de.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare il finanziamento parziale del progetto di ricerca FP7 NAMDIATREAM europea (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) e il progetto INTERREG IV Francia-Svizzera NAOMI.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Incubatore per microscopio | OKO LAB | UNO package (stadio superiore) | 37 gradi C, 5% CO2, idratato |
| Microscopio multifotone | Nikon | AR1-MP | |
| Scansione rapida, quattro rivelatori descanneti non fotomoltiplicatori Filtri | |||
| SHG e autofluorescenza | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Obiettivi per microscopio | Nikon | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30, WD 16 mm | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25, WD 0.18 mm λ S, inibitore di Rhock del rivestimento nano-cristallino | ||
| Sigma | Y-27632 | ||
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Siero knockout | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Aminoacidi non essenziali | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutammina 200 mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillina-streptomicina | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoetanolo | Sigma | M7522 | |
| Collagenasi IV | Gibco | 17104-019 | |
| Strumento raschiatore a rullo | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Sistema Aggrewell | StemCell Technologies | 27845 | |
| Siero Hyclone | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatina | Sigma | G9391 | |
| Piastre a 6 pozzetti | Piastre Falcon | 353046 | |
| a 24 pozzetti | Nunclon | 142475 | |
| Filtri in politetrafluoroetilene (PTFE) | Inserti Millipore | NA76/25 | |
| Millipore | PICM03050 |
Riferimenti
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007)....
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Ristampe e permessi
